Name: Isolação adulta preliminar ultra-som-aumentada do fibroblasto (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Aprenda a isolar fibroblastos primários de adultos usando digestão enzimática, agitação mecânica e ondas ultrassônicas. Este protocolo simplificado minimiza a contaminação bacteriana e é acessível para iniciantes em biologia celular.

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Agradecemos a Sra. Romy Kempe e a Sra. Annett Opitz pelo apoio técnico especializado. Agradecemos também ao Sr. Bjoern Binnewerg por ele apoiar. Este trabalho foi apoiado por subvenções de a) o Förderkreis Dresdner Herz-kreislauf-Tage e.V., b) "Habilitationsförderprogramm für Frauen", faculdade de medicina Carl Gustav Carus Dresden e c) else Kröner-Forschungskolleg (EKFK) faculdade de medicina Carl Gustav Carus Dresden. Agradecemos o financiamento e o apoio.

O seguinte protocolo segue as diretrizes institucionais de cuidados com os animais da Technische Universität Dresden, Alemanha (número do arquivo: T 2014/4), bem como as diretrizes de cuidados com os animais internacionalmente aceites (FELASA)17. A Figura 1 visualiza o processo de isolamento da célula.
1. preparando a configuração, material e mídia
<ol><li>Prepare o meio de cultura celular, solução de PBS, solução de estoque de mistura de colagenase (reconstituir 50 mg de mistura de colagenase liofilizada em 12 ml de água ultrapura estéril) e solução de tripsina de 0,25%.</li>
	<li>Aqueça o meio, a PBS e a solução de tripsina para 37 ° c.</li>
	<li>Pré-aqueça o banho de água Ultrassônico a 37 ° c.</li>
	<li>Desinfete fórceps, uma espátula de aço inoxidável, bipéis (2x bipels por órgão) e 2 copos de vidro com 70% de etanol e coloque esses materiais a capa de cultura celular.</li>
	<li>Encha um copo com 70% de etanol e outro com água estéril ou solução de PBS. Estes copos são obrigados a desinfectar e lavar o instrumento após cada procissão de órgão.</li>
	<li>Coloque tubos de plástico estéreis de 15 mL contendo PBS frio em gelo molhado. O número de tubos depende do número de órgãos que você deseja isolar os fibroblastos.</li>
</ol>2. dissecção do rato e remoção de órgãos
<ol><li>Use dois pares de luvas um acima do outro, assim que o primeiro par pode ser removido assim que o animal for dissecado. Nota: este procedimento impede que as bactérias do animal peles e pele de espalhar sobre os órgãos.</li>
	<li>Eutanizar o rato (por exemplo, luxação cervical) e fixar a carcaça com agulhas para cada membro a uma almofada de poliestireno.</li>
	<li>Desinfete a carcaça do rato usando 70% de spray de etanol. Certifique-se que a pele está encharcada em etanol para que o cabelo não vai girar para cima.</li>
	<li>Corte a pele direita acima do trato urogenital usando fórceps cirúrgico e tesouras atraumatic. Corte a pele ao lado da linha do meio desde o ponto da incisão inicial até o pescoço (3-4 cm) e adicione cortes de alívio nos membros. Cuidado: não perfurar a camada muscular nesta etapa para evitar a contaminação bacteriana!</li>
	<li>Fixe a pele à almofada da espuma de poliestireno para ter o acesso óptimo à musculatura que cobre a cavidade abdominal.</li>
	<li>Desinfecte a musculatura abdominal duas vezes usando 70% de etanol. Deixe o etanol secar antes de prosseguir para o próximo passo.</li>
	<li>Retire o primeiro par de luvas. Use um novo, estéril conjunto de fórceps e tesouras.</li>
	<li>Abra a cavidade abdominal e o tórax, incitando a camada muscular com tesoura cirúrgica para remover suavemente os órgãos de escolha. Portanto, segure o órgão suavemente com fórceps cirúrgico (não furar o órgão, usar a pressão mínima) e cortar os vasos sanguíneos de fornecimento perto do ponto de entrada no órgão com tesouras.</li>
	<li>Coloque os órgãos nos tubos estéreis contendo PBS frio. Feche os tubos firmemente. Coloque os tubos em gelo molhado até continuar com a etapa 3,1.</li>
</ol>3. tecido mincing, digestão e extração celular
<ol><li>Transfira os tubos a capa estéril da cultura de pilha. Cuidado: usar um par de luvas frescas e desinfectar os tubos com 70% de etanol antes de transferi-los o capô!</li>
	<li>Leve o órgão para fora do tubo de 15 mL usando fórceps estéril. Coloque o órgão em uma metade de um prato de Petri estéril de 6 cm e lave o órgão brevemente com PBS para remover o excesso de sangue. Transfira o órgão para a segunda metade do prato de Petri, retire o excesso de PBS.</li>
	<li>Mince o tecido usando dois bipels estéreis. Os fragmentos restantes do tecido não devem ser maiores do que 1-2 milímetros.</li>
	<li>Transfira o tecido picado para um novo tubo estéril de 15 mL utilizando a espátula estéril e adicione 2 mL de solução de tripsina a 0,25%. Coloc o tubo em uma incubadora da cultura de pilha em 37 ° c por 5 minutos.</li>
	<li>Vórtice do tubo suavemente (circa 1400/min) para 10 s.</li>
	<li>Pare a reação da tripsina a capa de cultura celular adicionando 4 mL de meio de cultura de células contendo FCS (meio de águia modificada de Dulbecco (DMEM), por exemplo).</li>
	<li>Adicionar 250 μL de solução de mistura de colagenases a cada tubo contendo tecido cardíaco ou pulmonar e 100 μL para rim ou fígado, respetivamente.</li>
	<li>Coloque os tubos em um banho de água Ultrassônico (37 ° c) e ative o sonicador ultra-sônico por 10 min. Nota: o banho de água Ultrassônico utilizado neste protocolo tem uma frequência de operação de 35 kHz e uma potência máxima de 320 W.</li>
	<li>Vórtice os tubos suavemente (circa 1400/min) para 10 s.</li>
	<li>Coloque os tubos novamente no banho de água ultra-sônica por 10 min.</li>
	<li>Vortex suavemente (cerca de 1400/min) para 10 s.</li>
	<li>Desinfete os tubos com 70% de etanol e transfira-os a capa de cultura celular estéril.</li>
	<li>Filtre a solução com uma malha de 40 μm em um novo tubo estéril de 15 mL.</li>
	<li>Centrifugue o tubo a 500 x g durante 5 min.</li>
	<li>Retire o sobrenadante e ressuscitem o pellet em 1 mL de meio fresco.</li>
	<li>Transfira as pilhas em uma embarcação apropriada da cultura da pilha (por exemplo, placa de 6 poços) e coloc a embarcação na incubadora da cultura da pilha durante a noite em 37 ° c e em 5% CO2.</li>
	<li>No dia seguinte, retire o meio, lave 3 vezes com PBS, em seguida, adicione o meio fresco (o volume adicionado depende da embarcação de cultura de células de escolha, 2 mL por poço de uma placa de 6 poços, etc.).</li>
	<li>Mude o meio a cada outro dia. Nota: os fibroblastos podem ser divididos depois de atingir a confluência óptica de 90% (geralmente após 5-7 dias).</li>
</ol>

<ol><li>Baum, J., Duffy, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+and+myofibroblasts%3A+what+are+we+talking+about%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts and myofibroblasts: what are we talking about.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 376-379 (2011).</li>
<li>Tallquist, M. D., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+the+identity+of+cardiac+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Redefining the identity of cardiac fibroblasts.</a> Nature Reviews. Cardiology. 14 (8), 484-491 (2017).</li>
<li>Weissman-Shomer, P., Fry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+embryo+fibroblasts+senscence+in+vitro%3A+pattern+of+cell+division+and+life+span+as+a+function+of+cell+density%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Chick embryo fibroblasts senscence in vitro: pattern of cell division and life span as a function of cell density.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 4 (2), 159-166 (1975).</li>
<li>Angello, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicative+potential+and+the+duration+of+the+cell+cycle+in+human+fibroblasts%3A+coordinate+stimulation+by+epidermal+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Replicative potential and the duration of the cell cycle in human fibroblasts: coordinate stimulation by epidermal growth factor.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 62 (1), 1-12 (1992).</li>
<li>Serra, V., von Zglinicki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+fibroblasts+in+vitro+senesce+with+a+donor-specific+telomere+length%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Human fibroblasts in vitro senesce with a donor-specific telomere length.</a> FEBS Letters. 516 (1), 71-74 (2002).</li>
<li>Mateu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+differences+between+neonatal+and+adult+fibroblasts+and+keratinocytes%3A+Donor+age+affects+epithelial-mesenchymal+crosstalk+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Functional differences between neonatal and adult fibroblasts and keratinocytes: Donor age affects epithelial-mesenchymal crosstalk in vitro.</a> International Journal of Molecular Medicine. 38 (4), 1063-1074 (2016).</li>
<li>Ivey, M. J., Tallquist, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+Cardiac+Fibroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Journal%3A+Official+Journal+of+the+Japanese+Circulation+Society%22%5BJournal%5D)">Defining the Cardiac Fibroblast.</a> Circulation Journal: Official Journal of the Japanese Circulation Society. 80 (11), 2269-2276 (2016).</li>
<li>Kanisicak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+lineage+tracing+defines+myofibroblast+origin+and+function+in+the+injured+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart.</a> Nature Communications. 7, 12260(2016).</li>
<li>Kuenzel, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-induced+epigenetic+silencing+of+polo-like+kinase+2+promotes+fibrosis+in+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-induced epigenetic silencing of polo-like kinase 2 promotes fibrosis in atrial fibrillation.</a> bioRxiv. , 445098(2018).</li>
<li>Van Linthout, S., Miteva, K., Tschöpe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+fibroblasts+and+inflammatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between fibroblasts and inflammatory cells.</a> Cardiovascular Research. 102 (2), 258-269 (2014).</li>
<li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+and+function+of+fibroblasts+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">The biology and function of fibroblasts in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).</li>
<li>Poulet, C., Künzel, S., Büttner, E., Lindner, D., Westermann, D., Ravens, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+physiological+functions+and+ion+currents+in+atrial+fibroblasts+from+patients+with+chronic+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Altered physiological functions and ion currents in atrial fibroblasts from patients with chronic atrial fibrillation.</a> Physiological Reports. 4 (2), (2016).</li>
<li>Gündüz, D., Hamm, C. W., Aslam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Isolation+of+High+Quality+Cardiomyocytes%2C+Endothelial+Cells%2C+and+Fibroblasts+from+an+Adult+Rat+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55601(2017).</li>
<li>Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+efficient+method+for+the+isolation+of+postnatal+murine+cardiac+myocyte+and+fibroblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Physiology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96 (5), 535-539 (2018).</li>
<li>Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+enzymatic+isolation+of+fibroblasts+for+the+creation+of+autologous+skin+substitutes%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology.+Animal%22%5BJournal%5D)">Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 40 (8-9), 268-277 (2004).</li>
<li>El-Armouche, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatase+inhibitor-1-deficient+mice+are+protected+from+catecholamine-induced+arrhythmias+and+myocardial+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Phosphatase inhibitor-1-deficient mice are protected from catecholamine-induced arrhythmias and myocardial hypertrophy.</a> Cardiovascular Research. 80 (3), 396-406 (2008).</li>
<li>Guillen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FELASA+Guidelines+and+Recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">FELASA Guidelines and Recommendations.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 51 (3), 311-321 (2012).</li>
<li>Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+primary+adult+fibroblast+cultures+from+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), 2033(2010).</li>
<li>Masur, S. K., Dewal, H. S., Dinh, T. T., Erenburg, I., Petridou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myofibroblasts+differentiate+from+fibroblasts+when+plated+at+low+density%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Myofibroblasts differentiate from fibroblasts when plated at low density.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (9), 4219-4223 (1996).</li>
<li>Rohr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+fibroblasts+in+cell+culture+systems%3A+myofibroblasts+all+along%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Cardiac fibroblasts in cell culture systems: myofibroblasts all along.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 389-399 (2011).</li>
<li>Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. PubMed - NCBI. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22553484">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22553484</a> (2019).</li>
<li>Coppé, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+secretory+phenotypes+reveal+cell-nonautonomous+functions+of+oncogenic+RAS+and+the+p53+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor.</a> PLoS biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).</li>
<li>Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence+in+aging+and+age-related+disease%3A+from+mechanisms+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy.</a> Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).</li>
<li>Singh, M., Sharma, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outgrowth+of+fibroblast+cells+from+goat+skin+explants+in+three+different+culture+media+and+the+establishment+of+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology.+Animal%22%5BJournal%5D)">Outgrowth of fibroblast cells from goat skin explants in three different culture media and the establishment of cell lines.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 47 (2), 83-88 (2011).</li>
<li>Linge, C., Green, M. R., Brooks, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+removal+of+fibroblasts+from+human+tissue+culture+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">A method for removal of fibroblasts from human tissue culture systems.</a> Experimental Cell Research. 185 (2), 519-528 (1989).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse para declarar.

Comparado às linhas de pilha imortalizado do fibroblasto, os fibroblastos preliminares oferecem diversas vantagens. Eles podem ser isolados custo efetivamente em alta qualidade e quantidade. Além disso, as culturas primárias oferecem a possibilidade de estudar células de múltiplos indivíduos, o que aumenta a confiabilidade dos resultados obtidos e diminui a probabilidade de meramente estudar artefatos de cultura celular. A geração contínua de novas culturas primárias previne alterações genéticas que comumente ocorrem apó...

Os fibroblastos são células planas, em forma de fuso, com múltiplos processos de stellate e um retículo endoplasmático áspero1,2. Um fibroblasto médio mede 30-100 μm e tem uma esperança de vida de 57 ± 3 dias1,3. A duração média do ciclo celular de fibroblastos humanos varia de 16-48 h, dependendo das condições de cultura4. Há evidências de que a capacidade replicativa e a qualidade funcional dos fibroblastos primários cultivados se correlacionam negativamente com a idade do doador, sugerindo que os doadores mais jovens (animais ou pacientes) devam ser preferidos se possível5,6 .
Os fibroblastos constituem um tipo de célula predominante da maioria dos tecidos corporais de mamíferos. Apesar de sua presença onipresente, a identificação molecular dos fibroblastos ainda é um desafio7. Os fibroblastos migram para desenvolver tecidos e órgãos de diferentes fontes durante o desenvolvimento embrionário8. Por esta razão, há uma pletora de proteínas do marcador que podem ser encontradas nos fibroblasto visto que as proteínas originais do marcador, que estão atuais em cada população do fibroblasto e exclusivas para fibroblastos, são ainda ausentes. Assim, os padrões de expressão de vários marcadores reconhecidos são geralmente usados para identificar fibroblastos. Entre os marcadores mais reconhecidos estão vimentina, proteína de superfície fibroblástica humana (hfsp), receptor de domínio filhote 2 (DDR2) e actina de músculo liso alfa (αsma).
Os fibroblastos são os principais tipos de células produtoras de matriz extracelular (ECM). Assim, os fibroblastos mantêm uma arquitetura de tecido ordenada e fornecem suporte mecânico para as células vizinhas1. O equilíbrio entre a síntese e a degradação do ECM é um processo bem regulado. Os deslocamentos para a síntese marcam o começo do depósito excessivo do ECM que, se não terminado, conduz à fibrose. A fibrose é mediada por miofibroblastos, que se originam de fibroblastos ativados submetidos a alterações moleculares e fenotípicas. Uma indicação dos miofibroblastos é secretion realçado do ECM e dos citocinas e a expressão de microfilamentos arranjados ordenadamente de αsma9.
Os fibroblastos primários têm sido os holofotes de pesquisas recentes com foco em fibrose, inflamação tecidual e interações fibroblastos-câncer-células10,11. Entretanto, para estudar eficazmente Propriedades do fibroblasto na saúde e na doença, é necessário isolar fibroblastos adultos preliminares viáveis em uma base regular. Existem vários métodos disponíveis para isolar os fibroblastos12,13,14. Os três principais métodos de isolamento de fibroblastos são o crescimento dos pedaçosde tecido12, a digestão enzimática do tecido15e a perfusão enzimática de órgãos ocos9,13,16. A vantagem do crescimento é um processo de isolamento suave sem degradação celular enzimática. De um lado, as culturas do conseqüência exigem geralmente períodos prolongados da cultura até que as pilhas possam ser usadas para experiências. A digestão enzimática comum é rápida, mas tem um risco de contaminação com outros tipos de células (por exemplo, células endoteliais) ou bactérias no processo de agitação, o que é necessário para dissolver mecanicamente o tecido. Além disso, esses métodos são muitas vezes elaborados e exigem tempo e habilidade para aprender.
Em relação à importância dos fibroblastos primários na pesquisa, ainda há a necessidade de otimizar as abordagens de isolamento de células existentes em termos de rapidez, simplicidade e confiabilidade. Aqui, um novo método de isolamento de fibroblastos enzimáticos baseados em ultra-som que fornece células de alta qualidade é fornecido.

<table><tbody><tr><td>0,25% Tripsina-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA</td><td>T4049-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Antibióticos</td><td>Gibco-Life Technologies, Carlsbad, EUA</td><td>Gibco LS15140148&nbsp;</td><td>Penicilina/estreptomicina (10.000 U/mL)</td></tr><tr><td>Coupa de cultura de células</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA</td><td>51023608</td><td>HeraSafe KSP15</td></tr><tr><td>Incubadora de cultura de células</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA</td><td>50049176</td><td>BBD 6220</td></tr><tr><td>Placas de cultura de células</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA</td><td>depende do vaso</td><td>6, 12, 24 poços Superfície Nunclon</td></tr><tr><td>Sucção de cultura de células</td><td>VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Alemanha</td><td>20727400</td><td>BVC sucção profissional</td></tr><tr><td>Cell strainer (mesh)</td><td>Corning, Tewksbury, USA</td><td>431750</td><td>40 &micro; m Centrífuga de</td></tr><tr><td>Nylon</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA</td><td>75007213</td><td>Megafuge</td></tr><tr><td>8R Controlador de pipetagem sem fio</td><td>Hirschmann, Eberstadt, Alemanha</td><td>9907200</td><td>Ponteiras</td></tr><tr><td>de pipeta descartáveis</td> Pipetus <td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA</td><td>depende do volume</td><td>Ponteiras SafeSeal para pipetas (10 &micro; L, 20 &micro; L, 100 &micro; L, 200 &micro; L, 1000 &micro; L)</td></tr> <tr><td>Pipetas de plástico descartáveis</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA</td><td>depende do volume</td><td>5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL</td></tr><tr><td>Bisturi estéril descartável</td><td>Myco Medical, Cary, EUA</td><td>n.a.Techno</td> <td>cut</td></tr><tr><td>Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>41965-062</td> Tubos Eppendorf <td>de alta glicose</td></tr><tr><td>Eppendorf</td><td>, Hamburgo, Alemanha&nbsp;</td><td>depende do volume</td><td>50 e micro; L, 500 e micro; L, 1.500&micro; L, 2.000 &micro; L</td></tr><tr><td>Soro fetal de bezerro (FCS)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA</td><td>F2442-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Mistura de colagenase</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA</td><td>5401020001</td><td>Liberase TL Placa de Petri de grau de pesquisa</td></tr><tr><td>6 cm</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA</td><td>P5481-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA</td><td>D8537-500ML</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Kit de detecção de senescência</td><td>Abcam, Cambridge, Reino Unido</td><td>ab65351</td><td></td></tr><tr><td>Shaker/ Vortex</td><td>IKA, Staufen im Breisgau, Alemanha</td><td>n.a.MS2</td> <td>Minishaker (modelo subsequente: Ident-Nr.: 0020016017)</td></tr><tr><td>Tubos de plástico estéreis</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA</td><td>Falcon 352095</td><td>BD Tubos Falcon (15 mL, 50 mL)</td></tr><tr><td>Banho-maria ultrassônico</td><td>BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlim, Alemanha</td><td>312</td><td>Sonorex RK100H</td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica (atraumática)</td><td>Aesculap AG, Tuttlingen, Alemanha</td><td>NR 82</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica&nbsp;</td><td>Aesculap AG, Tuttlingen, Alemanha</td><td>eq 1060.09</td><td></td></tr><tr><td>Pinça cirúrgica</td><td>Aesculap AG, Tuttlingen, Alemanha</td><td>BD577</td><td></td></tr></tbody></table>

isolação adulta preliminar ultra-som-aumentada do fibroblasto

Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation

Os fibroblastos adultos primários tornaram-se uma importante ferramenta para estudar fibrose, interações fibroblásticas e inflamação em todos os tecidos do corpo. Desde que os fibroblastos preliminares não podem dividir indefinidamente devido à diferenciação do Miofibroblasto ou à indução da senescência, as culturas novas devem ser estabelecidas regularmente. No entanto, existem vários obstáculos a superar durante os processos de desenvolvimento de um protocolo de isolamento confiável e isolamento primário de fibroblastos: o grau de dificuldade do método (especialmente para iniciantes), o risco de contaminação bacteriana, o tempo necessário até que os fibroblastos primários possam ser utilizados para experimentos, e subsequente qualidade e viabilidade celular. Neste estudo, um protocolo rápido, confiável e fácil de aprender para isolar e cultura fibroblastos adultos primários do coração do mouse, pulmão, fígado e rim combinando digestão enzimática e agitação ultra-sônica é fornecido.

A habilidade deste protocolo de isolar fibroblasto adultos do tecido murino contínuo foi demonstrada. Foram obtidos fibroblastos viáveis que poderiam ser utilizados para experimentos subsequentes, como coloração por imunofluorescência ou experimentos de proliferação (Figura 2D-F, Figura 5A).
Os fibroblastos adultos são células planas em forma de eixo com múltiplos processos celulares que tipicamente c...

Nós apresentamos um protocolo para isolar fibroblastos adultos preliminares em uma maneira fácil, rápida e de confiança, performable por novatos (por exemplo, estudantes). O procedimento combina a digestão enzimática do tecido e a agitação mecânica com ondas ultra-sônicas para obter fibroblastos primários. O protocolo pode facilmente ser adaptado às exigências experimentais específicas (por exemplo, tecido humano).

Isolação adulta preliminar ultra-som-aumentada do fibroblasto

Primary adult fibroblasts have become an important tool to study fibrosis, fibroblast interactions and inflammation in all body tissues. Since primary ...

Nosso protocolo fornece uma abordagem fácil e rápida para o isolamento do fibroblasto primário com um foco claro em evitar a contaminação de bactérias, o que pode ser um grande problema. Especialmente para iniciantes. A principal vantagem de nossa técnica é sua simplicidade.Uma vez que não requer extensas habilidades manuais ou experiência e pode ser facilmente aprendido por todos em um curto período de treinamento. Apresentando a técnica estará Manja Newe, técnica de fora do laboratório. Antes de começar a dissecção, coloque dois pares de luvas descartáveis, um em cima do outro.E fixar o mouse em uma almofada de poliestireno. Desinfete a pele com 70% de etanol, certificando-se de que o animal está encharcado. E use fórceps cirúrgicos esterilizados com etanol e tesouras atraumáticas para acoar a pele bem acima do trato urogenital.Corte de três a quatro centímetros ao longo da linha média da incisão inicial ao pescoço, adicionando cortes de alívio nos membros. E fixar a pele na almofada para obter acesso ideal à musculatura que cobre a cavidade abdominal. Em seguida, desinfete a musculatura abdominal duas vezes com 70% de etanol fresco.Quando o etanol secar, retire o primeiro par de luvas. E use um novo conjunto estéril de fórceps e tesouras para incisar a camada muscular para abrir a cavidade abdominal e o tórax. Para remover os órgãos de interesse, segure suavemente cada órgão com os fórceps cirúrgicos sem perfurar o tecido.E use a tesoura para cortar cuidadosamente os vasos sanguíneos perto do ponto de entrada do órgão. Coloque cada órgão em um tubo de PBS estéril e frio e feche o tubo firmemente. Colocando cada tubo no gelo molhado à medida que os órgãos são coletados.Quando todos os órgãos tiverem sido colhidos, pulverize os tubos com 70% de etanol antes de colocá-los em uma capa de cultura celular estéril. Usando um par de luvas frescas, use fórceps estéreis para transferir cada órgão para metade de uma placa de Petri estéril de seis centímetros. E lave brevemente os órgãos com PBS fresco para remover o excesso de sangue.Transfira os órgãos enxaguados para a segunda metade de cada placa de Petri e remova o excesso de PBS. Usando dois bisturis estéreis, pica os órgãos em fragmentos de um a dois milímetros. E use uma espátula estéril para transferir os pedaços de tecido em novos tubos individuais, estéreis, de 15 mililitros.Adicione dois mililitros de solução de trypsin de 0,25% a cada tubo. E coloque os tubos em uma incubadora de cultura celular a 37 graus Celsius por cinco minutos. No final da incubação, o vórtice dos tubos a cerca de 1400 rotações por minuto durante dez segundos.E prenda a reação de Trypsin com quatro mililitros de um meio de cultura apropriado suplementado com soro de bezerro fetal por tubo. Em seguida, adicione o volume apropriado de solução de mistura de colagenase a cada tubo. E coloque os tubos em um banho de água ultrassônica de 37 graus Celsius por 10 minutos.No final da sônicação, gentilmente vórtice os tubos por 10 segundos. Antes de colocar os tubos de volta no banho de água ultrassônica por mais 10 minutos. No final da segunda sônicação, vórtice os tubos por mais 10 segundos.E desinfetar os tubos com 70% de etanol. Na capa de cultura celular, filtrar as suspensões celulares através de filtros individuais de 40 micrômetros em um novo tubo de 15 mililitros. E coletar as células por centrifugação.Suspenda as pelotas em um mililitro de meio fresco por tubo. E ver as células em vasos de cultura celular adequados em densidades apropriadas de revestimento. Em seguida, coloque as células na incubadora de cultura celular durante a noite.Na manhã seguinte, lave cada cultura três vezes com PBS antes de adicionar meio fresco e devolver as células à incubadora. Usando este protocolo, fibroblastos viáveis podem ser obtidos para uso em experimentos subsequentes. Como testes de coloração amino-fluorescente ou proliferação.Os fibroblastos adultos são células planas em forma de fuso com múltiplos processos celulares que normalmente crescem em monocamadas. No entanto, podem ser observadas diferenças morfológicas distintas em populações de fibroblastos de diferentes órgãos. Por exemplo, os fibroblastos renais são menores e crescem em densidades maiores do que os fibroblastos cardíacos, pulmonares ou hepáticos.Os fibroblastos isolados apresentam altas taxas de proliferação, atingindo uma confluência óptica superior a 90% após aproximadamente seis dias. Aqui, pode-se observar um myofibroblast diferenciado com microfilamentos de actina muscular alfa liso distintos. Essas células são encontradas em abundância nas culturas cardíaca, renal, hepática e celular pulmonar.Enquanto apenas cerca de 20 a 30% das células isoladas e cultivadas expressam microfilamentos de actina muscular suave, organizados e suaves, praticamente todas as células são positivas para Vimentin e Dom-receptor de domínio discoidina 2 após sete dias na cultura. O mais importante a ser lembrado é usar a técnica certa durante todo o procedimento, pois a contaminação por bactérias deve ser evitada. Após o isolamento do fibroblasto primário, as células podem ser usadas para todos os tipos de experimentos de psiquiatria e caracterização.Como a proliferação da química imunocítica ou ensaios de cura de feridas, ou avaliações biológicas moleculares.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

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Naïve Adult Stem Cells isolamento de culturas primárias de fibroblastos humanos

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Isolamento de fibroblastos dérmicos humanos adultos da pele abdominal e geração de células-tronco pluripotentes induzidas usando um método não integrador

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