Name: Avaliação da indução de depressão em longo prazo em fatias Cerebelares adultas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Aprenda a avaliar a indução de depressão de longo prazo em células de Purkinje cerebelares usando fatias ex vivo e modelos animais geneticamente manipulados. Este método avança o conhecimento sobre plasticidade sináptica e aprendizado motor.

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Agradecemos A A. Oba por sua assistência técnica. Esta pesquisa foi parcialmente apoiada por Grant-in-Aid para pesquisa científica (C) 17K01982 para KY

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê RIKEN sobre o cuidado e uso de animais em experimentos. Os camundongos foram mantidos na instalação animal do centro de RIKEN para a ciência do cérebro temperatura bem controlada (23 – 25 ° c) e umidade (45% – 65%) Condições. Foram utilizados camundongos do peso masculino e feminino (C57BL/6, 3 – 6 meses).
1. preparação de soluções utilizadas nos experimentos
Nota: Todas as soluções devem ser feitas em água ultrapura livre de metais (resistividade > 18,2 MΩ) e outras impurezas (carbono orgânico total (TOC) < 5,0 ppb). O líquido cerebrospinal artificial de trabalho (ACSF) para cortar-corte e a gravação são feitos recentemente no dia da experiência de um estoque de 10 vezes (X10) de ACSF. Bubble as soluções com 5% CO2/95% o2 gás mistura antes de usar. O pH do ACSF é ajustado para 7,4 ± 0,1, e a osmolaridade é ajustada 315 ± 5 mOsm/kg adicionando água ultrapura.
<ol><li>Prepare o estoque 10x de ACSF contendo 1250 mM de NaCl, 30 mM KCl, 12,5 mM NaH2po4e 260 mm NaHCO3. Esta solução pode ser armazenada a 4 ° c.</li>
	<li>
Prepare o trabalho ACSF contendo 125 mM NaCl, 3 mM KCl, 2 mM CaCl1,2mm mg2so4, 1,25 mm NaH2po4, 26 mm NaHCO3 e 20 mm glicose.
	<ol>
<li>Em primeiro lugar, adicionar 1 mL de 2 M CaCl2 solução seguida de 1 ml de 1 m mg2so4 solução em torno de 800 ml de água ultrapura, para evitar a precipitação. Em seguida, adicione 100 mL de 10x ACSF e glicose. Finalmente, compo a um volume total de 1.000 ml adicionando a água ultrapura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare 3,3% de agar para manuseio cerebral. Dissolva 1 g de agar em 30 mL de solução de NaCl a 0,9% e aqueça-o num microondas até ferver. Mexa para misturar, em seguida, despeje-o em uma caixa de plástico estéril de 4 cm x 10 cm e deixe solidificar. Guarde a placa de agar (~8 mm de espessura) num frigorífico.</li>
	<li>
Prepare a solução interna.
	<ol>
<li>Prepare a solução interna baseada em K+contendo 60 mm kcl, 60 mm k-gluconato, 0,3 mm EGTA, 4 mm MgCl2, 4 mM ATP, 0,4 mm GTP e 30 mm hepes (pH 7,2). Nota: Baixa concentração (0,3 mM) de EGTA, um lento CA2 +-chelator, é adicionado ao quelato possivelmente contaminado CA2 + em água pura, mas esta baixa concentração de EGTA na solução interna nunca bloqueia a indução de Ltd (Figura 3, Figura 4, Figura 5) durante a gravação de células inteiras. A pressão osmótica medida é 285 mOsm/kg.</li>
		<li>Prepare a solução interna baseada em cs+contendo 60 mm de cscl, 46 mm D-gluconato, cloreto de tetraetilamónio de 27 mm (Tea-CL), 0,3 mm EGTA, 4 mm MgCl2, 4 mM ATP, 0,4 mm GTP e 30 mm hepes (pH 7,2, ajustado usando CsOH). Nota: Cs+ bloqueia os canais K dependentes de tensão e melhora as condições de fixação do espaço em dendritos remotos, aumentando o comprimento-constante. A pressão osmótica medida é 285 mOsm/kg.</li>
		<li>Prepare 200 μL de alíquotas das soluções e armazene a-30 ° c.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. dissecção e corte cerebral
<ol><li>Chill e oxigenar 2 50 mL copos de ACSF no gelo até que a temperatura é menor do que 4 ° c. Adicionar 50 μL de tetrodotoxina (TTX, 1 mM) em um dos copos gelados de ACSF e reservá-lo para corte de fatias. Para obter a fatia cerebelar do rato reservando a habilidade indutora de LTD, a adição de TTX ao ACSF normal é necessária.</li>
	<li>Resfriar a bandeja de amostra de metal preenchendo uma área de banho de gelo da câmara de corte com gelo.</li>
	<li>Despeje 1 mL de isoflurano em um frasco de anestesia (~1000 ml), em seguida, coloque um mouse nele por 30 – 45 s. Certifique-se de que o rato está profundamente anestesiado confirmando a sua incapacidade de responder à estimulação mecânica.</li>
	<li>Decapitar o rato usando tesouras cirúrgicas. Segure a cabeça e corte a pele superficial ao longo da linha média usando uma tesoura oftalmológica. Puxe a pele segurando com os dedos para expor amplamente a superfície do crânio.</li>
	<li>Corte o crânio horizontalmente ao longo de uma linha do furo spinocerebellar principal apenas acima da orelha e do olho usando uma tesoura oftalmológico. Corte o crânio ao longo de uma linha acima dos dois olhos e retire para isolar o crânio.</li>
	<li>Corte o cérebro no meio do encéfalo usando um bisturi, em seguida, isolar a parte caudal do cérebro, incluindo o cerebelo do crânio. Mergulhe-o em uma taça gelada de ACSF. Geralmente, o tempo total da decapitação à imersão do bloco do cérebro na Taça pre-refrigerada de ACSF deve ser menos do que 60 s.</li>
	<li>A posição da tubulação de borbulhagem deve ser ajustada de modo a para não agitar o bloco do cérebro no béquer. Danos mecânicos podem causar inchaço da fatia durante a gravação. Deixe-o por pelo menos 7 min e deixe o cérebro esfriar.</li>
	<li>Para aparar o bloco cerebral, corte uma peça de agar retangular (2 cm x 2 cm) de uma grande placa de agar (4 cm x 10 cm, armazenada a 4 ° c) e coloque-a em um papel de filtro para absorver o excesso de líquido.</li>
	<li>Gire a parte de agar de cabeça para baixo no papel de filtro e coloque a peça de agar em um papel de filtro em uma bandeja de amostra de metal pré-refrigerada (16 cm x 20 cm). Pegar o bloco de cérebro usando uma espátula e absorver o líquido excessivo em torno dele com um pedaço de papel de filtro.</li>
	<li>Monte o bloco do cérebro no bloco do agar usando a colagem (adesivo imediato do cianoacrilato médico). Certifique-se de anexar o fundo (lado ventral) do bloco cerebral para o agar.</li>
	<li>Corte o hemisfério direito com uma lâmina. Certifique-se de que o lado do plano de corte seja o mais paralelo possível ao plano dendrítico do PC, pois este lado está anexado à superfície da bandeja de amostra. Corte e retire o outro lado do hemisfério. Em seguida, cortar o cérebro entre o colliculi superior e inferior, e cortar a medula espinhal.</li>
	<li>Cole o lado direito do cerebelo cortado com o bloco de agar na bandeja de amostra pré-refrigerada. Espalhe o excesso de cola em torno do cerebelo com a parte plana de uma espátula, para evitar o excesso de cola de anexar à superfície cerebelar. Incline a bandeja de metal e despeje ACSF a fim de fixar a cola e lavar o excesso de cola.</li>
</ol>3. corte cerebral
<ol><li>Orientar a amostra de tal forma que o lado dorsal do cerebelo está na parte da frente. Despeje o corte gelo-frio ACSF, contendo 1 μM TTX, suficiente para mergulhar o cerebelo completamente. Coloque um tubo de gás no ACSF e comece a borbulhar com O2/co2 mistura de gás.</li>
	<li>Remova o Mater do do arachnoid usando um pinça fino binóculos. Corte o pedúnculo cerebelar com uma lâmina, e remova o tronco cerebral e o bloco de agar. Gire a bandeja 180 °, de modo que a superfície dorsal do cerebelo enfrenta um Razorblade.</li>
	<li>Defina a lâmina e ajuste o primeiro local de corte. Defina os parâmetros de corte do do para o seguinte: amplitude para 5,5, frequência para 85 Hz, velocidade para 3 – 4 e espessura de fatia para 300 μm.</li>
	<li>Transfira a fatia cerebelar em uma nylon-rede em uma incubadora acrílica e mergulhe a fatia completamente no ACSF oxigenado. A incubadora deve ser coloc em um água-banho que mantenha uma temperatura em 26 ° c.</li>
	<li>Armazene as fatias por pelo menos 1 h para permitir a recuperação do dano durante a fatiagem.</li>
</ol>4. gravação da remendo-braçadeira da inteiro-pilha
Nota: Uma gravação da remendo-braçadeira exige o seguinte equipamento: um microscópio ereto com óptica infravermelha do contraste da interferência diferencial (IR-DIC), um amplificador da remendo-braçadeira, digitador dos dados, stimulator digital, isolador, computador, software para a aquisição de dados e análise, manipulator motorizado, plataforma do microscópio, tabela da isolação da vibração, gaiola de Faraday, sistema de aquecimento da solução, bombas peristáltica e extrator do elétrodo.
<ol><li>Adicionar o (0,1 mm) para ACSF e resolvê-lo usando ultra-sonication por 3 min.</li>
	<li>Perfuse uma câmara de gravação com a Picrotoxina contendo, O2-co2-saturado ACSF na taxa de 2 ml/min. manter a temperatura da câmara de gravação em torno de 30 ° c.</li>
	<li>Faça um eletrodo de gravação puxando um vidro de borosilicato capilar com filamento (diâmetro externo = 1,5 mm) usando um extrator com 4 degraus. A ponta-diâmetro deve ser em torno de 1 μm.</li>
	<li>Faça um elétrodo de estimulação puxando o mesmo capilar usando o extrator com 2 etapas, a seguir quebre para produzir uma ponta fina golpeando a ponta de encontro a um bloco do ferro um microscópio binocular. O diâmetro final deve ser de 3 – 5 μm.</li>
	<li>Transfira a fatia cerebelar para a câmara de gravação e fixe-a com um peso pt com fios de nylon. Encha um eletrodo estimulante com ACSF.</li>
	<li>Para a estimulação dos PFs, coloc o elétrodo de estimulação na superfície da camada molecular, em torno de 50 μm longe da camada da pilha de Purkinje.</li>
	<li>Para a estimulação do CF, coloc o elétrodo de estimulação na parte inferior da camada da pilha de Purkinje (etapas 5,3, 5,4).</li>
	<li>Filtrar K+-based ou cs+-based solução interna com um filtro de 0,45 μm. Use uma microcarregadeira para encher um eletrodo de gravação com 8 μL de solução interna.</li>
	<li>Aplique uma fraca pressão positiva no eletrodo de gravação antes de mergulhá-la no ACSF. Sua resistência deve ser 2 – 4 MΩ e o potencial juncional líquido deve ser corrigido.</li>
	<li>Aproxime o corpo sadio, brilhante da pilha do PC com o elétrodo da gravação. Empurre a superfície da pilha de Purkinje ligeiramente, pare de aplicar a pressão positiva, a seguir aplique a pressão negativa até formar um selo do giga-ohm. Em seguida, estabeleça a configuração da célula inteira usando pressão negativa.</li>
	<li>Segure o potencial de membrana em-70 mV, e aplique-2 mV pulso (duração, 100 ms) em 0,1 Hz para monitorar a resistência de entrada, resistência da série e capacitância de entrada, continuamente. Não use a compensação de resistência da série. Descarte os dados quando a resistência da série varia em mais de 15%.</li>
</ol>5. indução de LTD
<ol><li>Estimular a camada molecular com um pulso (duração, 0,1 ms). Identifique as correntes pós-sinápticas PF-excitatórias (EPSC) aplicando um estímulo de pulso duplo (intervalo interspike (ISI) de 50 ms). O PF-EPSC deve apresentar facilitação de pulso pareado e aumento gradual da amplitude em relação ao aumento da intensidade de estimulação.</li>
	<li>Registre a resposta de teste do PF-EPSC aplicando um único pulso em 0,1 Hz. Ajuste a intensidade do estímulo de modo que a amplitude evocada de EPSC seja em torno de 200 pA. Evite a contaminação da corrente através do canal iônico dependente da voltagem.</li>
	<li>Estimular a FC na parte inferior da camada de células de Purkinje, e identificar o EPSC eliciado pela ativação CF (aplicando um estímulo de pulso duplo). O CF-EPSC deve mostrar a depressão do pulso emparelhado e uma maneira All-or-None de acordo com o aumento na intensidade da estimulação. Para a indução do LTD, um único estímulo deve ser usado.</li>
	<li>
Protocolo de indução de LTD 1
	<ol>
<li>Usando um eletrodo contendo solução interna baseada em K+condições de aperto atual, aplique um único estímulo PF e um único estímulo CF simultaneamente a 1 Hz por 5 min (300 pulsos) (Figura 1a).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Protocolo de indução de LTD 2
	<ol>
<li>Usando uma solução interna com base em K+contendo eletrodo condições de aperto atual, aplique duplo PF-ESTÍMULOS (ISI de 50 ms) e único estímulo CF, pois o segundo estímulo PF é coincidente com estímulos CF a 1 Hz por 5 min (Figura 1b).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Protocolo de indução de LTD 3
	<ol>
<li>Usando um elétrodo que contem a solução interna de cs+-based condições da tensão-braçadeira, aplique um PF-estímulo dobro (ISI de 50 ms) e uma única tensão-etapa despolarizantes (-70 a 0 MV, 50 ms) ao soma em 1 Hertz por 3 minutos, de modo que o segundo PF-estímulo seja equivalente ao início da etapa de tensão despolarizante (Figura 1C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
LTD-induzindo Protocol-4
	<ol>
<li>Usando um elétrodo que contem a solução interna de cs+-based condições da tensão-braçadeira, aplique os PF-estímulos (5x em 100 hertz) e uma única tensão-etapa despolarizantes (-70 a 0 milivolt, 50 ms) ao soma em 0,5 hertz por 3 minutos, simultaneamente (Figura 1D ).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+cerebellar+engrams+in+short-term+and+long-term+motor+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Distinct cerebellar engrams in short-term and long-term motor learning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), E188-E193 (2014).</li>
<li>Inoshita, T., Hirano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence+of+long-term+depression+in+the+cerebellar+flocculus+during+adaptation+of+optokinetic+response%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Occurrence of long-term depression in the cerebellar flocculus during adaptation of optokinetic response.</a> eLife. 27, 36209(2018).</li>
<li>Belmeguenai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+plasticity+complements+long-term+potentiation+in+parallel+fiber+input+gain+control+in+cerebellar+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Intrinsic plasticity complements long-term potentiation in parallel fiber input gain control in cerebellar Purkinje cells.</a> Journal of Neuroscience. 30 (41), 13630-13643 (2010).</li>
<li>Ohtsuki, G., Piochon, C., Adelman, J. P., Hansel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SK2+channel+modulation+contributes+to+compartment+specific+dendritic+plasticity+in+cerebellar+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">SK2 channel modulation contributes to compartment specific dendritic plasticity in cerebellar Purkinje cells.</a> Neuron. 75, 108-120 (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Diferenças entre os quatro protocolos
Nos protocolos de indução de LTD 1 e 2, CJS 300 vezes em 1 Hz é suficiente para induzir cerebelar LTD. a frequência de estimulação da FC pareceu estar em uma faixa fisiológica, pois a taxa de queima de espiga complexa em camundongos adultos alertas ("") foi relatada como sendo 1,25 Hz36. No entanto, a estimulação da FC isoladamente não ocasionou a plasticidade a longo prazo na sinapse PF-CF, conforme utilizado nos protocolos 1 e 2 (<s...

A organização sináptica das redes neuronais elaboradas do córtex cerebelar, composta por PCs, interneurônios de camada molecular (cesta e células esteladas), células de Golgi, PFs de células de grânulos, fibras Mossy e fibras de escalada (CFs), foram elucidados em termos de excitação/inibição e divergência/convergência, e o diagrama de circuitos bem organizados sugeriu que o cerebelo é uma "máquina neuronal"1, embora não houvesse anteriormente nenhuma idéia sobre a finalidade desta "máquina". Posteriormente, a Marr propôs que a entrada de PFs em PCs constitua uma rede de aprendizagem associativa de camada tripla2. Ele também sugeriu que cada CF transmite uma instrução cerebral para o movimento elementar2. Ele assumiu que a ativação simultânea de PFs e CF melhoraria a atividade da sinapse PF-PC, e causava potenciação a longo prazo (LTP) da sinapse PF-PC. Por outro lado, a Albus assumiu que a ativação síncrona de PFs e CF resultou em LTD nas sinapses PF-PC3. Ambos os estudos acima interpretam o cerebelo como um dispositivo original da memória, a incorporação de que na rede cortical cerebelar conduz à formação do modelo da máquina da aprendizagem do modelo de Marr-Albus.
Seguindo estas predições teóricas, duas linhas de evidência sugerem a presença de plasticidade sináptica no cerebelo. A primeira linha de evidência foi sugerida pela organização anatômica do floculus; aqui as vias MF de origem de órgãos vestibulares e vias CF de origem retiniana convergem nos PCs4. Este teste padrão original da convergência sugere que uma plasticidade sináptica que ocorre no flocculus cause a adaptação notável do reflexo vestíbulo-ocular. Segundo, a gravação da resposta dos PCs no floculado e o lesioning do floculus também apoiaram a hipótese acima de5,6,7. Além disso, o padrão de descarga do PC durante a adaptação do movimento da mão de um macaco8 apoiou a hipótese da plasticidade sináptica, especialmente a hipótese de Albus Ltd-3.
Para determinar a natureza da plasticidade sináptica diretamente, a estimulação conjuntivo repetida (CJS) de um pacote de PFS e o CF que inervam especificamente o PC in vivo foi mostrado para induzir o Ltd para a eficácia da transmissão do PF-PC sinapses9, 10,11. Nas explorações subseqüentes in vitro usando uma fatia cerebelar12 e PCes cultivados, a conjunção da estimulação cocultivada da pilha do grânulo e da estimulação da pilha verde-oliva13 ou a conjunção do glutamato após aplicado e somático despolarização14,15causou Ltd . O mecanismo de transdução de sinal subjacente à indução Ltd também foi intensivamente investigado por meio de preparações in vitro16,17.
As adaptações do VOR e do OKR foram usadas frequentemente para a avaliação quantitativa de efeitos da gene-manipulação na aprendizagem do motor cerebelar, porque o córtice vestibule-cerebelar foi provado ser a origem essencial na aprendizagem adaptativa do VOR18 ,19,20 e o okr19,21 a correlação entre a falha da indução do Ltd e o prejuízo da aprendizagem motora comportamental foi tomada como a evidência que Ltd desempenha um papel essencial no motor mecanismos de aprendizagem22. Essas visões são coletivamente referidas como a hipótese de Ltd de aprendizagem motora, ou hipótese de Marr-Albus-Ito23,24,25,26.
A aprendizagem adaptativa do movimento ocular foi mensurada por protocolos semelhantes, enquanto várias condições experimentais foram utilizadas para induzir o Ltd na preparação da fatia27,28,29,30,31 . Recentemente, Schonewille et al.26 relataram que alguns camundongos manipulados por genes demonstraram aprendizagem motora normal, mas as fatias Cerebelares não mostraram o Ltd e, assim, concluíram que a Ltd não era essencial para a aprendizagem motora. Entretanto, a indução de LTD foi tentada somente usando um tipo de protocolo na temperatura ambiente. Daqui, nós usamos diversos tipos de protocolos LTD-induzindo condições da gravação em torno de 30 ° c, e nós confirmamos que o LTD estêve induzido confiantemente nos ratos gene-manipulados usando estes protocolos em temperaturas physiological próximas32.
No entanto, permanecem algumas questões sobre as propriedades básicas da estimulação conjuntiva. O primeiro é a relação entre a forma do pico complexo e a amplitude de LTD. Em segundo lugar, em conjunto com a PF-estimulação e a despolarização somática, se o número de estímulos utilizados era necessário ou não era elusivo. No presente estudo, essas questões foram investigadas com camundongos tipo Wild (WT).

<table><tbody><tr><td>Amplificador</td><td>Molecular Devices-Axon</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Capilar de vidro de borosilicato</td><td>Sutter</td><td>BF150-110-10</td><td></td></tr><tr><td>Digitador</td><td>Molecular Devices-Axon</td><td>Digidata1322A</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de eletrodos</td><td>Sutter</td><td>Modelo P-97</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td><td>26675-46-7</td><td></td></tr><tr><td>Isolador</td><td>A.M.P.I.</td><td>ISOflex</td><td></td></tr><tr><td>Linear slicer</td><td>Dosaka EM</td><td>PRO7N</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>NIKON</td><td>Eclipse E600FN</td><td></td></tr><tr><td>Bomba peristáltica</td><td>Gilson</td><td>MP1 Bomba</td><td></td>de canal único</tr><tr><td>Picrotoxina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1675</td><td></td></tr><tr><td>Fabricante de água pura</td><td>Merck-Millipore</td><td>MilliQ 7000</td><td></td></tr><tr><td>Software para experimento</td><td>Sonda molecular-Axônio</td><td>pClamp 10</td><td></td></tr><tr><td>Software para estatísticas</td><td>KyensLab</td><td>KyPlot 5.0</td><td></td></tr><tr><td>Estimulador</td><td>WPI</td><td>DS8000</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de temperatura</td><td>Warner</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>Tetrodotoxina</td><td>Tocris</td><td>1078</td><td></td></tr></tbody></table>

avaliação da indução de depressão em longo prazo em fatias cerebelares adultas

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

A plasticidade sináptica fornece um mecanismo de aprendizado e memória. Para a aprendizagem do motor cerebelar, a depressão a longo prazo (Ltd) de transmissões sináptica das fibras paralelas (PF) às pilhas de Purkinje (PC) é considerada a base para a aprendizagem do motor, e as deficiências do Ltd e da aprendizagem do motor são observadas em vários animais manipulados por genes. Conjuntos de aprendizagem motora comum, como a adaptação do reflexo optocinético (okr), o reflexo vestibular-ocular (VOR) e o teste de do foram utilizados para avaliação da capacidade de aprendizagem motora. Entretanto, os resultados obtidos dos camundongos Knock-in modificados no término do GluA2-carboxy demonstraram a adaptação normal do VOR e do OKR, apesar da falta de PF-LTD. Nesse relatório, a indução do LTD foi tentada somente usando um tipo de protocolo da estimulação na temperatura ambiente. Assim, as condições para induzir o LTD cerebelar foram exploradas nos mesmos mutantes do Knock-in que usam vários protocolos na temperatura fisiológica próxima. Finalmente, nós encontramos protocolos da estimulação, por que LTD poderia ser induzida nestes ratos gene-manipulados. Neste estudo, um conjunto de protocolos é proposto para avaliar a indução de LTD, o que permitirá um exame mais preciso da relação causal entre o LTD e a aprendizagem motora. Em conclusão, as condições experimentais são cruciais na avaliação de LTD em camundongos manipulados por genes.

Quatro protocolos foram utilizados neste estudo para induzir o cerebelar LTD. Nos dois primeiros protocolos (protocolo 1 e 2), aplicou-se a conjunção da PF-estimulação e a CF-estimulação condições de aperto atual. Nos outros dois protocolos (protocolo 3 e 4), a despolarização somática foi substituída para a CF-estimulação condições da tensão-braçadeira. Os traços de tensão ou traços de corrente durante a estimulação conjuntiva foram comparados (Figura 2).
A junção...

Em alguns animais gene-manipulados, usar um único protocolo pode não induzir o LTD em pilhas Cerebelares de Purkinje, e pode haver uma discrepância entre o LTD e a aprendizagem do motor. Os protocolos múltiplos são necessários avaliar a LTD-indução em animais gene-manipulados. Os protocolos padrão são mostrados.

Avaliação da indução de depressão em longo prazo em fatias Cerebelares adultas

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...

Quando uma determinada função proteica é modificada por manipulação genética, a coordenação da falha irritante e do comprometimento do funcionamento motor é considerada uma condição necessária para a relação causal entre a LTD e a aprendizagem motora. Aqui demonstramos o uso de múltiplos protocolos para avaliar a LTD que pode ser induzida através de mecanismos compensatórios em animais manipulados por genes. Antes de colher o cérebro, esfrie e oxigene dois 50 mililitros de ACSF no gelo.Quando a temperatura da solução atingir abaixo de quatro graus celsius, adicione 50 microliters de uma tetrodotoxina mililitro a um dos béquers frios de gelo. Para colher o cérebro, segure a cabeça e use uma tesoura oftalmológica para cortar a pele superficial ao longo da linha média. Retrair manualmente a pele para expor amplamente a superfície do crânio e usar a tesoura para cortar ao longo horizontalmente do crânio do grande buraco spinocerebellar para pouco acima dos olhos e ouvidos antes de cortar o crânio ao longo de uma linha acima de ambos os olhos.Use um bisturi para cortar o cérebro no meio do cerebrum e isolar a parte caudal do cérebro, incluindo o cerebelo, do crânio. Mergulhe a amostra no béquer gelado do ACSF e ajuste a tubulação de bolha para que não mexa o bloco cerebral no béquer. Após pelo menos sete minutos, use uma espátula para pegar o bloco cerebral e use um pedaço de papel filtro para absorver qualquer excesso de ACSF.Monte o lado ventral do tecido para baixo em um pedaço de ágar de dois por dois centímetros com um adesivo médico apropriado. Use uma lâmina para cortar o hemisfério direito do tecido cerebral o mais paralelo ao plano dendrático das células Purkinje possível. Corte e remova o outro lado do hemisfério e corte o cérebro entre o coliculi superior e inferior.Corte a medula espinhal e cole o lado direito do cerebelo aparado com o bloco de ágar na bandeja de espécimes pré-refrigerados. Em seguida, inclinando a bandeja do espécime, despeje ACSF na amostra para fixar o tecido e lavar qualquer excesso de cola. Para cortar a amostra cerebral, oriente o espécime de tal forma que o lado dorsal do cerebelo esteja na frente e despeje o suficiente do acsf de corte frio de gelo complementado com tetrodotoxina para imergir completamente o cerebelo.Coloque um tubo de gás na solução de corte e inicie borbulhando com uma mistura de gás oxigênio-carbono. Usando pinças finas e lupas, remova o aracnoide mater e extire o peduncle cerebelar. Depois de remover o tronco cerebral e o bloco de ágar, gire a bandeja 180 graus para que a superfície dorsal do cerebelo fique de frente para a lâmina de barbear do vibratome e ajuste o primeiro local de corte.Ajuste a amplitude do vibratome para 5,5 e frequência para 85 Hertz, a velocidade para três a quatro, e a espessura da fatia para 300 micrômetros. À medida que as fatias cerebelares são obtidas, use uma rede de nylon para transferir as seções para uma incubadora de acrílico em um banho de água de 26 graus celsius e imergir completamente as amostras em ACSF oxigenado fresco por pelo menos uma hora. Para relatórios inteiros de grampos de remendo celular, dissolva uma picrotoxina micromolar em ACSF por ultasonicação por três minutos antes de perfundir uma câmara de gravação de 30 graus celsius com a solução de toxina a uma taxa de fluxo de dois mililitros por minuto.Depois de alguns minutos, transfira uma fatia cerebelar para a câmara de gravação e fixe o tecido com um peso de platina e fios de nylon. Em seguida, encha um eletrodo estimulante com ACSF fresco. Para estimular as fibras paralelas, coloque o eletrodo estimulante na superfície da camada molecular a cerca de 50 micrômetros da camada celular purkinje.Para estimular as fibras de escalada, coloque o eletrodo estimulante na parte inferior da camada celular Purkinje e use um microcarregador para encher um eletrodo de gravação com oito microliters de 0,45 micrômetros filtrados de potássio ou solução interna baseada em césio. Aplique uma pressão positiva fraca no eletrodo de gravação antes de mergulhar o eletrodo no ACSF. A resistência ao eletrodo deve ser de dois a quatro megaohms e o potencial de junção líquida deve ser corrigido.Aproxime-se do corpo celular saudável e brilhante de uma célula Purkinje com o eletrodo de gravação e empurre ligeiramente a superfície da célula Purkinje. Em seguida, pare de aplicar a pressão positiva e aplique pressão negativa até que uma vedação gigaohm seja formada. Em seguida, use pressão negativa para estabelecer uma configuração celular inteira, mantendo o potencial da membrana em menos 70 milivolts e aplicando um menos dois milivolt 100 milissegundos pulsos a 0,1 hertz, monitoramento contínuo da resistência de entrada, resistência à série e capacitância de entrada.Para indução de depressão de longo prazo, estimule a camada molecular com um pulso de 0,1 milissegundo e aplique um estímulo de pulso duplo para identificar as correntes pós-sinápticas de fibra paralela. Deve-se observar uma facilitação de pulso emparelhada e um aumento gradual da amplitude em relação ao aumento da intensidade de estimulação. Para registrar a resposta ao teste, aplique um único pulso de 0,1 hertz e ajuste a intensidade do estímulo para que a amplitude evocada seja de cerca de 200 picoamps.Estimular as fibras de escalada na parte inferior da camada celular Purkinje e identificar as correntes pós-sinápticas de fibras paralelas provocadas pela ativação da fibra de escalada, aplique um estímulo de pulso duplo. Uma depressão de pulso pareada deve ser observada de forma total ou nenhuma em correlação com o aumento da intensidade de estimulação. Neste experimento representativo, foi utilizada uma conjunção de uma estimulação de fibras paralelas e uma estimulação de fibra de escalada sob as condições atuais do grampo.A forma do pico complexo provocado pela estimulação conjuntiva foi semelhante à provocada apenas pela estimulação da fibra de escalada com a primeira espeto íngreme seguida de dois a três espinhos. Um pico complexo de forma semelhante foi observado quando uma estimulação de fibras paralelas foi seguida 50 milissegundos mais tarde por um segundo paralelo conjuntivo e estimulação de fibras de escalada. Neste teste sob condições de grampo de tensão utilizando uma solução interna baseada em césio, uma estimulação de fibras paralelas foi seguida 50 milissegundos mais tarde por uma aplicação concomitante de uma segunda estimulação de fibras paralelas e despolarização somática.Uma corrente interior foi provocada após despolarização somática de menos 70 a zero milvolts e a corrente traseira também foi evocada após a repolarização. Finalmente, cinco estímulos paralelos de fibra a 100 hertz foram dados simultaneamente com a despolarização somática sob condições de grampo de tensão. Mais uma vez, uma geração repetitiva de correntes interiores foi provocada durante a despolarização e a corrente traseira foi induzida após a repolarização.Para avaliar a relação entre cerebelar LTD e aprendizagem motora em animais manipulados por genes, vários protocolos devem ser usados para induzir LTD em condições fisiológicas aconchegantes. Se a Cerebellar LTD for visualizada em animais manipulados por genes após o aprendizado motor, a relação causal entre eles pode ser mais diretamente examinada.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Este é um protocolo para preparação aguda de fatias de hipocampi de camundongos adultos e envelhecidos que se aproveita da perfusão transcárrica e corte de fatias com NMDG-aCSF gelado para reduzir danos hipóxicos ao tecido. As fatias resultantes permanecem saudáveis durante muitas horas, e são adequadas para grampos de remendo de longo prazo e gravações de campo.

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Aqui, é demonstrado como um modelo de traumatismo cranioencefálico fechado acordado pode ser usado para examinar os efeitos do traumatismo cranioencefálico leve repetido (r-mTBI) na plasticidade sináptica no hipocampo. O modelo replica características importantes do r-mTBI em pacientes e é usado em conjunto com a eletrofisiologia in vitro .

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