Name: Métodos para testes biomecânicos in vivo em plexo braquial em leitões neonatais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Aprenda métodos de testes biomecânicos in vivo no plexo braquial usando leitões neonatais. Esta técnica ajuda a compreender mecanismos de lesão por estiramento e determinar limiares de lesão em modelos neonatais.

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A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development dos Institutos Nacionais de Saúde o Prêmio Número R15HD093024 e pelo National Science Foundation CAREER Award Número 1752513.

Institutional Animal Care and Use Committee da Universidade Drexel aprovou todos os procedimentos (#20704).
1. Chegada e Aclimatação animal
<ol><li>Quarentena de 1 a 2 dias de idade leitões por pelo menos 24 h após a chegada.</li>
	<li>Leitão da casa em gaiolas limpas e higienizadas de aço inoxidável (36 em x 48 em x 36 polegadas) na cama de chip de álamo e alimentar ad libitum com substituídor de leite de porco.</li>
	<li>Mantenha a temperatura ambiente a 85 °F para garantir um ambiente termoneutro.</li>
</ol>2. Dia da Experiência
<ol><li>Retire a alimentação 2 h antes do experimento.</li>
	<li>Injete leitões com uma injeção intramuscular de cetamina (10-40 mg/kg)/xilazine (1,5-3,0 mg/kg IM) e transporte através de uma gaiola de transporte para o espaço cirúrgico.</li>
</ol>3. Indução e Manutenção da Anestesia
<ol><li>Administrar 4% de anestésico de inalação de isofluranos misturado em oxigênio por cone de nariz e confirme que o animal é profundamente anestesiado, avaliando a ausência de reflexos palpebrais e de retirada.</li>
	<li>Entubar o animal, colocando-o na posição supina e usar um laringoscópio (lâmina reta) para ajudar a guiar o tubo de intubação (diâmetro 2,5-2 mm) na traqueia.</li>
	<li>Coloque o animal no ventilador uma vez que o tubo de intubação esteja protegido.</li>
	<li>Certifique-se de que os leitões recebam uma mistura de isoflurano (0,25%-3% de manutenção), oxigênio e óxido nitroso.</li>
	<li>Forneça uma dose de fentanil (10 μg/kg) e continue dando uma dose a cada 1-2 h para garantir a profundidade adequada contínua de analgesia e sedação e para evitar artefatos de movimento que poderiam arriscar o descrédito do tubo endotraheal.</li>
	<li>Estabelecer acesso intravenoso (IV) na veia abdominal subcutânea ou qualquer outra veia periférica.</li>
	<li>Estabelecer a linha arterial através da artéria femoral. Isso pode ser feito de forma não invasiva ou realizando um corte.</li>
</ol>4. Monitoramento e Cuidados
<ol><li>Monitore a profundidade da anestesia, confirmando a ausência de reflexo de cantal e ausência de resposta à retirada para beliscar os dedos do dedo do dedo do lado.</li>
	<li>Realizar monitoramento contínuo de parâmetros fisiológicos durante a anestesia e durante todo o experimento, que inclui pressão arterial, eletrocardiografia (ECG), CO2das marés finais, oximetria do pulso e a temperatura corporal.</li>
	<li>Monitore gases no sangue e açúcares no sangue a cada 0,5-1 h e dê fluidos intravenosos (50% dextrose e 50% soro fisiológico normal) para animais anestesiados por mais de 1 h em ~100 cc/kg/dia, conforme necessário, para garantir a euglicemia.</li>
	<li>Monitore o plano anestésico do animal de perto e com freqüência. Fornecer analgesia e/ou aumentar a anestesia inalalant.</li>
	<li>Mantenha o animal na tensão normal do oxigênio controlando os parâmetros do ventilador e as doses da droga como necessário para assegurar normoxia, a seguir coloc o animal em um cobertor de água circulante temperatura-regulado de tal modo que a temperatura de corpo normal esteja mantida em 39 °C durante o período do experimento.</li>
</ol>5. Cirurgia de Plexo Brachial
<ol><li>Coloque o animal em uma posição supina na mesa de operação após anestesia adequada, como descrito na seção 3, com o membro superior em sequestro, expondo a região axillary.</li>
	<li>Use qualquer cortina cirúrgica para cobrir o animal. Use técnicas limpas, mas não estéreis.</li>
	<li>Exponha o complexo de plexo braquial em ambos os lados da coluna vertebral, fazendo uma incisão midline (usando uma lâmina #10) sobre a pele e fáscia sobrepondo a traqueia, até o terço superior do esterno, correspondendo aos níveis da coluna vertebral entre C3-T3.</li>
	<li>Extrapolar a incisão usando os fórceps e o hemostat horizontalmente em cada lado do entalhe suprasternal ao longo da borda da clavícula ao braço superior, ao poupar as veias cefálicas e basilic.</li>
	<li>Libere as abas superiores e inferiores por dissecção contundente usando tesoura e fórceps, permitindo o acesso às regiões cervical e torácica do plexo braquial, respectivamente.</li>
	<li>Identifique o eixo (C2) e a primeira costela no T1. Usando esses marcos, identifique os três inferiores cervicais (C6-C8) e o primeiro foramen espinhal vertebral (T1), em seguida, examine o plexo cuidadosamente para localizar bifurcações das divisões (forma M) para alcançar a exposição.</li>
	<li>Etiqueta (usando laços do nervo) as regiões brachial do plexo acima destas bifurcations mais perto da espinha como a raiz/tronco e etiquetam aquelas abaixo destas bifurcations como a corda seguida pelo nervo, que são ficados situados mais perto do braço.</li>
</ol>6. Testes biomecânicos
<ol><li>Configuração do dispositivo de teste biomecânico Nota: Um dispositivo de teste mecânico personalizado foi projetado e fabricado para realizar trecho in vivo da BP (Figura 1).<ol>
<li>Anexar a base da configuração para um carrinho.</li>
		<li>Anexe o atuador eletromecânico na base usando grandes grampos C. O atuador é capaz de fornecer 150 libras de força, 10 " acidente vascular cerebral, e velocidade de 15 mm / s. A velocidade pode ser reduzida para 0,2 mm/s e ainda funcionar como desejado.</li>
		<li>Anexe a célula de carga 200 N ao atuador.</li>
		<li>Anexar (parafuso-in) uma braçadeira para a célula de carga que consiste em plexiglass acolchoado, o que impede a concentração de estresse no local de fixação.</li>
		<li>Anexe uma câmera a um tripé. Certifique-se de que a câmera tem a capacidade de gravar até 120 f/s em uma resolução de 658 x 4926 pixels.</li>
		<li>Anexar cabos USB da câmera, atuador e célula de carga para o computador para integrar e sincronizar todos os componentes da configuração.</li>
		<li>Ligue o computador, atuador e carregue a célula em uma fonte de energia.</li>
	</ol></li>
	<li>Calibrar a célula de carga antes de gravar as cargas aplicadas. Para fazer isso, execute os passos abaixo:<ol>
<li>Defina o atuador em um ângulo de 90° usando a alça ajustável e verificando o ângulo com um trator.</li>
		<li>Abra o software que funciona com a célula de carga(Tabela de Materiais). Pressione o botão Iniciar para mostrar uma leitura ao vivo de tensão.</li>
		<li>Pendure pesos da braçadeira que variam de 0-1.000 g em incrementos de 100 g da configuração e gravar as tensões medidas.</li>
		<li>Calcule a equação linear das tensões e pesos encontrando a inclinação (m) e intercepte (b). Isso é feito usando um programa de planilha e a função de inclinação incluída para calcular b da Equação 1 abaixo. Insira equação 2 mostrada abaixo no código de configuração mecânica. Equação 1: b = y - mx Onde: y é o peso, x é a tensão, m é a inclinação, e b é a interceptação (constante). Equação 2: y = mx + b Onde: y é o peso, x é a tensão, m é a inclinação, e b é a constante.</li>
	</ol></li>
	<li>Teste: o nervo BP é cortado e ancorado à configuração de teste por grampo personalizado.<ol>
<li>Corte o nervo BP usando uma tesoura fina.</li>
		<li>Aperte o lado cortado do nervo BP na braçadeira personalizada, como mostrado na Figura 1.</li>
		<li>Coloque manualmente tinta acrílica preta ou tinta da Índia no segmento bp apertado(Figura 2).</li>
		<li>Coloque uma grade de calibração, que é uma régua de 1 cm, plana dentro do animal para definir a escala para análise de dados.</li>
		<li>Use o software da câmera para visualizar a colocação da câmera diretamente sobre os segmentos testados, permitindo assim o monitoramento do movimento/deslocamento dos marcadores e determinando a tensão do tecido real a qualquer momento.</li>
		<li>Registre as medidas iniciais, como a altura em que o nervo se insere no corpo a partir da mesa e a altura da braçadeira da mesa, o ângulo do atuador e o comprimento total do tecido.</li>
		<li>Abra o software de programação (tabela contendo a interface gráfica do usuário [GUI] como mostrado na Figura 3).</li>
		<li>Executar o GUI pressionando o botão Run.</li>
		<li>Ininicialize o sistema pressionando o botão Initialize.</li>
		<li>Tare o sistema, pressionando o botão Tare.</li>
		<li>Estique o segmento bp pressionando o botão de teste de início. Isso puxa o tecido a uma taxa atribuída de 500 mm/min até que a falha completa ocorra em qualquer segmento da BP. Essa taxa de alongamento é selecionada com base na literatura disponível4,8,18. O programa também salva um arquivo de vídeo, a carga de tração aplicada, deslocamento do tecido e duração do teste.</li>
		<li>Registre o local da falha, que é o ponto em que o tecido se rompe.</li>
	</ol></li>
	<li>Eutanásia: eutanásia leitões no final do experimento com uma dose letal de pentobarbital (120 mg/kg i.v.).</li>
	<li>Análise de dados: use o software de rastreamento de movimento para a análise dos vídeos adquiridos durante os testes.<ol>
<li>Abra o arquivo de vídeo do experimento dentro do software de rastreamento de movimento, selecionando Arquivo | Arquivo de vídeo aberto.</li>
		<li>Use a grade de calibração para configurar a escala no software de rastreamento de movimento usando a ferramenta linha, clicando direito na linha depois que ela é desenhada, selecionando calibrar medida,e digitando um valor conhecido em centímetros (Figura 4).</li>
		<li>Acompanhe os marcadores no tecido dentro do software de rastreamento de movimento clicando no vídeo e selecionando track path e alinhando o centro do marcador com o marcador no tecido e alinhando-o até a ruptura.</li>
		<li>Exportar as coordenadas x e y dos marcadores selecionando a exportação da lima à planilha de modo que possa ser usada para calcular as tensões.</li>
		<li>Importe os dados em um software de programação para calcular a distância entre as coordenadas x e y ao longo do tempo para calcular as cepas.</li>
		<li>Calcule os valores da tensão em cada ponto de tempo dividindo a mudança na distância pela distância original após a contabilidade para mudanças na inclinação durante o estiramento. Os valores reais da tensão são determinados entre cada par de marcadores adjacentes em cada ponto de tempo. A média dessas cepas também é calculada.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

A literatura disponível sobre as respostas biomecânicas do trecho no tecido da BP exibe malargada gama de valores limiares, bem como discrepâncias metodológicas4,6,8,18,19,21,22,23. Variações nos resultados publicados pode...

Apesar dos recentes avanços na obstetrícia, o problema da NBPP causado por lesões no esticão do complexo de BP continua a ser um fardo de saúde global, com uma incidência de 1,5 casos por 1.000 nascidos vivos1,2. Os fatores de risco associados podem ser maternos (ou seja, peso excessivo, diabetes materno, anormalidades uterinas, história de paralisia da BP), fetal (ou seja, macrosomia fetal) ou macrosomia fetal (ou seja, distocia de ombro, trabalho prolongado, parto assistido com fórceps ou extratores de vácuo, apresentação de culatra3). Embora essas complicações sejam inevitáveis em determinadas circunstâncias, a prevenção e o tratamento do NBPP justificam uma compreensão das respostas biomecânicas e fisiológicas da BP neonatal quando submetidas a alongamento.
Estudos biomecânicos relatados sobre a BP utilizaram animais adultos e tecido sumérico humano e mostram discrepâncias significativas4,5,6,7,8,9,10,12,13,14,15. A relevância clínica das propriedades biomecânicas do complexo tecido BP justifica um modelo animal neonatal, bem como uma abordagem de teste biomecânico in vivo. Além disso, as limitações com o estudo da lesão no trecho da BP em cenários complicados de entrega no mundo real aumentam a dependência de modelos computacionais que fornecem métodos que permitem a investigação dos efeitos de várias complicações e técnicas de entrega. A chave para a relevância clínica desses modelos é sua biofidelidade (resposta humana). Modelos computacionais disponíveis por Gonik et al.16 e Grimm et al.17 dependem de tecido nervoso de coelho e rato, mas não tecido neonatal da BP. Realizar testes biomecânicos in vivo em um modelo animal neonatal clinicamente relevante pode preencher a lacuna crítica de dados de BP neonatais indisponíveis.
O estudo atual descreve um dispositivo e um procedimento in vivo do teste mecânico para conduzir o teste biomecânico em leitão neonatal masculinos de Yorkshire 3-5 day-old. O dispositivo consiste em um grampo, atuador, célula de carga e sistema de câmera que aplicam e monitoram cepas e cargas in vivo durante a falha. O sistema da câmera igualmente permite a monitoração da posição da falha durante a ruptura. Em geral, o sistema permite a caracterização biomecânica detalhada da BP neonatal quando submetido ao alongamento, proporcionando assim as tensões limiares da BP e tensões para falha mecânica in vivo. Os dados obtidos podem melhorar ainda mais o comportamento humano (biofidelidade) dos modelos computacionais existentes que são projetados para investigar os efeitos de forças exógenas e endógenas no estiramento da BP em cenários de entrega associados à NBPP.

<table><tbody><tr><td>Omega Subminature Tensão & Célula de carga de compressão</td><td>Omega</td><td>LCM201-200N</td><td>200N célula de carga</td></tr><tr><td>Basler acA640-120uc câmera Basler acA640-120uc</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Atuador Linear de Feedback</td><td>Automações Progressivas</td><td>PA-14P</td><td>10" curso, força de 150lb, velocidade de 15mm/s</td></tr><tr><td>Software de rastreamento de movimento</td><td>Kinovea</td><td>N/A</td> Software de programação <td>de código aberto</td></tr><tr><td>- MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>N/A</td><td>versão 2018A</td></tr><tr><td>Instrumentos</td><td></td><td></td><td></td>cirúrgicos</tr><tr><td>Fórceps</td><td>Fine Science Tools Inc</td><td>11006-12 e 11027-12 ou 11506-12</td><td></td></tr><tr><td>Hemostats</td><td>Fine Science Tools Inc</td><td>13009-12</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura</td><td>Fine Science Tools Inc</td><td>14094-11 ou 14060-09</td><td></td></tr></tbody></table>

métodos para testes biomecânicos in vivo em plexo braquial em leitões neonatais

Methods for In Vivo Biomechanical Testing on Brachial Plexus in Neonatal Piglets

A paralisia neonatal do plexo braquial (NBPP) é uma lesão por alongamento que ocorre durante o processo de parto em complexos nervosos localizados nas regiões do pescoço e ombro, coletivamente referido como plexo braquial (BP). Apesar dos recentes avanços no atendimento obstétrico, o problema da NBPP continua a ser um fardo de saúde global com uma incidência de 1,5 casos por 1.000 nascidos vivos. Tipos mais graves desta lesão podem causar paralisia permanente do braço do ombro para baixo. Prevenção e tratamento do NBPP garante uma compreensão das respostas biomecânicas e fisiológicas dos nervos recém-nascidos bp quando submetidos a alongamento. O conhecimento atual da BP recém-nascida é extrapolado a partir de animais adultos ou tecido soráveis da BP em vez de tecido in vivo da BP neonatal. Este estudo descreve um dispositivo de teste mecânico in vivo e procedimento para realizar testes biomecânicos in vivo em leitões neonatais. O dispositivo consiste em um grampo, atuador, célula de carga e sistema de câmera que se aplicam e monitoram cepas e cargas in vivo até a falha. O sistema da câmera igualmente permite a monitoração da posição da falha durante a ruptura. No geral, o método apresentado permite uma caracterização biomecânica detalhada da BP neonatal quando submetido ao alongamento.

Um gráfico de tempo de carregamento representativo e cepas de quatro segmentos de plexo BP (entre quatro marcadores) são mostrados na Figura 5 e Figura 6, respectivamente. A carga de falha obtida de 8,3 N em 35% de cepa de falha média relata as respostas biomecânicas da BP neonatal quando submetida ao alongamento. Algumas regiões do nervo submetem-se a umas tensões mais elevadas do que outro, indicando de ferimento non-uniform ao...

Aqui são apresentados métodos para realizar testes biomecânicos in vivo em plexo braquial em um modelo de leitão neonatal.

Métodos para testes biomecânicos in vivo em plexo braquial em leitões neonatais

Neonatal brachial plexus palsy (NBPP) is a stretch injury that occurs during the birthing process in nerve complexes located in the neck and shoulder ...

Esta técnica replica testes de estiramento biomecânico in vivo do plexo braquial em um leitão, servindo como um modelo animal clínico de grande porte altamente relevante. Esses métodos podem não apenas ajudar na compreensão dos mecanismos de lesão estuada, mas também podem relatar os valores do limiar de lesão para déficits funcionais e estruturais dentro do plexo braquial neonatal. Demonstrando o procedimento será Rachel Magee, uma estudante de pós-graduação do meu laboratório.Após a confirmação da falta de reflexos palpebrais e de abstinência, coloque o porco anestesiado na posição supina na mesa de operação, com o membro superior em abdução para expor à região axilar. Coloque uma cortina sobre o animal e use uma lâmina de bisturi número 10 para fazer incisões sobre a pele marcada. A incisão midline está sobrepondo a traqueia até o terço superior do esterno, expondo o complexo de plexo braquial em ambos os lados da coluna.Para expor um lado do plexo braquial do animal, uma incisão superior é feita da extremidade superior da incisão da linha média, correspondente ao C3, ao braço superior, e uma incisão inferior é feita a partir da extremidade inferior da incisão da linha média, correspondente ao T3, até o braço superior. Use fórceps em cada lado da incisão para separar o tecido do entalhe suprasternal ao longo da borda da clavícula para o braço superior enquanto poupa as veias cefálicas e maníacos. Utilizando tesoura, fórceps e dissecção contundente, solte o retalho superior para acessar a região cervical do plexo braquial, e a aba inferior para acessar a região torácica do plexo braquial.Realize dissecção contundente em músculos superficiais para expor o plexo braquial. Em seguida, examine o plexo cuidadosamente para localizar bifurcações das divisões e identificar as regiões do plexo braquial abaixo das bifurcações, mais próximas do braço, como o cordão e o nervo e as regiões acima das bifurcações, mais próximas da coluna vertebral, como a raiz ou tronco. Para configurar o dispositivo de teste biomecânico, conecte a base do dispositivo a um carrinho e use grandes grampos C para anexar o atuador eletromecânico à base.Conecte uma célula de carga de 200 newtons ao atuador e enrosque em um grampo com plexiglass acolchoado para evitar a concentração de estresse no local da fixação. Usando um tripé, conecte uma câmera que pode gravar até 100 quadros por segundo em uma resolução de 658 por 492 pixels e anexar cabos USB da câmera, atuador e célula de carga ao computador para integrar e sincronizar todos os componentes da configuração. Em seguida, conecte o computador, o atuador e carregue a célula em uma fonte de energia.Para calibrar a célula de carga antes de gravar as cargas aplicadas, use a alça ajustável para definir o atuador em um ângulo de 90 graus, de modo que esteja alinhado verticalmente e verifique o ângulo com um prolongador. Abra o software da célula de carga e clique em Iniciar para mostrar uma leitura ao vivo da tensão. Em seguida, pendure pesos de zero a 1.000 gramas do grampo em incrementos de 100 gramas, registrando as tensões medidas em cada carga.Quando as tensões tiverem sido registradas para todos os 10 pesos, calcule a inclinação e intercepte para determinar a equação linear das tensões e pesos. Para testes biomecânicos do nervo plexo braquial isolado, use uma tesoura fina para cortar o nervo e use um grampo personalizado para fixar o lado do corte do nervo. Rotule o segmento nervoso preso com tinta acrílica preta e coloque uma régua de um centímetro plana dentro do animal para definir a escala para a análise dos dados.No software da câmera, coloque o campo de visão da câmera diretamente sobre os segmentos testados para permitir o monitoramento do movimento e/ou deslocamento dos marcadores e determinar a tensão real do tecido em um ponto de tempo específico. Regissore as medidas da linha de base, como a altura em que o nervo se insere no corpo a partir da mesa, a altura do grampo da mesa, o ângulo do atuador e o comprimento total do tecido. Abra o software de programação e clique em Executar.Digite o nome do arquivo e o deslocamento e clique em Initialize e TARE. Clique em Iniciar para esticar o segmento plexo braquial. O tecido será puxado a uma taxa atribuída de 500 milímetros por minuto até que ocorra uma falha completa em qualquer segmento do tecido nervoso.Em seguida, salve um arquivo de vídeo, a carga de tração aplicada, o deslocamento do tecido e a duração do teste, e registe o local de falha como o segmento em que o tecido se rompe. Neste teste representativo de quatro segmentos do plexo braquial, a carga de falha obtida foi de 8,3 newtons e a falha média da tensão foi de 35% para as amostras de tecido nervoso neonatal quando submetidas ao alongamento. Algumas regiões do nervo sofreram uma tensão maior do que outras, indicando uma lesão não uniforme ao longo do comprimento do nervo.Os dados da câmera permitiram a identificação da localização da falha neste experimento como proximal ao foramen. É importante garantir que primeiro, o animal esteja profundamente anestesiado e não mostre sinais de dor ou desconforto, segundo, para calibrar a célula de carga, e terceiro, para fixar o tecido firmemente. Este modelo animal in vivo pode ser usado para estudar alterações funcionais e histológicas no tecido plexo braquial após diferentes graus de alongamentos e estudar cenários complicados de nascimento.

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Research

JoVE Journal

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