Caracterização e enumeração semiautomáticas de PD-L1 de células tumorais circulantes de pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas por imunofluorescência

Com base na tecnologia microfluida, o isolamento e a caracterização dos CTCs a partir de células sanguíneas normais não exigem o uso de biomarcadores CTC específicos, e é compatível com a cultura celular. Este protocolo facilita uma alta taxa de extração de CTC, e fornece uma extensa análise citológica dos CTCs, avaliando características citomorfológicas malignas. A expressão PD-L1 por CTCs tem um valor preditivo no gerenciamento do câncer de pulmão.

A melhoria de sua detecção usando este teste poderia promover uma melhor gestão do paciente a longo prazo. Outras aplicações deste protocolo incluem a detecção de aberrações genéticas usando FISH, ou a realização de análises transcriômicas em CTCs, bem como a isolação de células de origem fetal em mães. Demonstrando o procedimento estará Julie Balandier, uma técnica do nosso laboratório.

Para o enriquecimento pré-analítica das células tumorais circulantes, primeiro colete 7,5 mililitros de sangue em um tubo EDTA de potássio, e mantenha a amostra sob agitação suave para evitar sedimentação celular e coagulação. Dentro de seis horas após a coleta, use uma pipeta sorológica sob um armário de segurança microbiológica, para transferir até 7,5 mililitros de sangue inteiro para um novo tubo de centrífuga de 50 mililitros, e centrifugar a amostra por 10 minutos a 1600 vezes G, à temperatura ambiente. No final da centrifugação, use uma pipeta de transferência para coletar a fração de plasma sem perturbar o casaco de buffy, e diluir o plasma com um volume equivalente de PBS, até 7,5 mililitros.

Em seguida, adicione cuidadosamente o tampão de lise de glóbulos vermelhos à amostra de sangue, a um volume final de 30 mililitros, e inverta suavemente o tubo de coleta de sangue três vezes, antes de colocar o tubo em temperatura ambiente por 10 minutos. No final da incubação, colete as células por centrifugação, e remova cuidadosamente todos, exceto os últimos quatro a cinco mililitros de supernascedor. Use uma micropipette filtrada para remover o supernatante restante e use uma micropipette P1000 com uma ponta filtrada para adicionar um mililitro de tampão de resuspensão na parede do tubo.

Para evitar a introdução de bolhas, resuspenja a pelota celular com tubulação suave, até que a amostra seja homogênea. Quando a pelota for resuspended, adicione mais três mililitros de tampão de ressuspensão na parede do tubo, sem introduzir bolhas, e misture suavemente as células novamente. Para o enriquecimento celular tumoral de 50 mililitros em espiral, carregue primeiro um novo chip microfluido espiral no dispositivo e carregue um tubo vazio de centrífuga de 50 mililitros em cada uma das portas de entrada e saída.

Clique no prime para preparar o dispositivo microfluido em espiral por três minutos. Removendo os tubos de entrada e saída no final do ciclo. Carregue a amostra de sangue resuspended na porta de entrada e carregue um tubo cônico claro de 15 mililitros na porta de saída.

Em seguida, clique em executar e selecione programa três para iniciar o programa de enriquecimento de células tumorais que circulam 31 minutos. No final do ciclo, transfira o tubo de saída para a centrífuga, e use uma pipeta sorológica de cinco mililitros para remover todos, exceto os dois últimos mililitros do supernatante. Em seguida, use uma micropipette para remover todos, exceto os últimos 100 microliters de supernacer.

Para coloração de imunofluorescência, conte as células em um hemocitometro e dilua a amostra enriquecida para uma única célula de dez a cinco células por 100 microlitadores de concentração de solução anti-vinculação de 0,2%. Em seguida, use um cotonete encharcado com 50 microliters de solução anti-vinculação para umedecer o contorno da câmara de amostra, e coloque um deslizamento de vidro de polilise na câmara de amostra. Feche a câmara, e pipeta para cima e para baixo três vezes para revestir uma ponta de micropipette com a solução de ligação antes de reutilizar a amostra nos últimos 100 microliters do supernante.

Transfira a solução celular para a câmara de amostra e citospin a amostra em uma centrífuga dedicada a 400 rotações por minuto durante quatro minutos, em uma aceleração baixa. No final da centrifugação, coloque um isolador de silicone ao redor da área de deposição e deixe o slide secar sob um armário de segurança microbiológica por dois minutos, em seguida, fixar a amostra citospun com 100 microliters de 4% paraformaldeído por 10 minutos à temperatura ambiente, seguido por três lavagens de dois minutos com 200 microliters de PBS por lavagem, à temperatura ambiente. Após a última lavagem, bloqueie qualquer ligação não específica com incubação de 30 minutos no bloqueio do reagente à temperatura ambiente, seguido de rotulagem com 100 microliters da solução de anticorpos de interesse.

Coloque o slide rotulado em uma placa de petri de 100 por 15 mililitros em um pedaço de papel absorvente umedecido com dois mililitros de água estéril, e coloque a placa fechada, a quatro graus Celsius durante a noite, protegida da luz. Na manhã seguinte, lave a amostra três vezes com PBS como demonstrado, e monte a amostra com 10 microliters de uma solução de montagem apropriada e um deslizamento de tampa de vidro. Em seguida, sele o deslizamento da tampa com esmalte claro.

Para imaginar as amostras citospun, carregue o slide em um microscópio fluorescente reto com uma plataforma motorizada X Y, e selecione um objetivo de 20x e os canais apropriados de acordo com os fluoroforos usados para a rotulagem de anticorpos. Ligue a lâmpada de mercúrio e adapte o microscópio e o software associado a uma filmagem semiautomática. Quando a lâmpada estiver pronta, no menu de aquisição, defina os quatro canais, defina o tempo de exposição e defina as telhas para digitalizar.

Clique em ladrilhos e experimento avançado e defina a área para digitalizar. Em seguida, ajuste o foco na tela e clique em iniciar o experimento. No final do experimento, exporte os arquivos TIF para cada canal e nomeie especificamente o arquivo para incluir a amostra, número de vezes, corante e número de sub-telhas.

Para análise de imagens, abra o software de análise de imagens do site do Broad Institute e clique em arquivo, pipeline de arquivos e análise de quatro canais CTC. Solte arquivos na lista de arquivos e atualize os metadados para agrupar os arquivos por telhas. Em seguida, clique em analisar imagens para abrir o arquivo da planilha correspondente aos parâmetros de intensidade da medida.

Sem o protocolo de descontaminação otimizado, a alta contaminação bacteriana é observada nas culturas teciduais de linhas celulares A549 enriquecidas após apenas 24 horas, causando morte e alterações citomorfológicas nas células eucarióticas. Em contrapartida, após o protocolo de limpeza, as células A549 vivas são obtidas em culturas 2D após 10 horas de cultura tecidual e remoção média, sob condições de cultura 3D e dentro de amostras de pacientes. Utilizando um ensaio de coloração imunofluorescente líquido ou um ensaio de coloração imunofluorescente em lâminas revestidas de polilise com citospina, pode-se observar uma clara distinção no número de núcleos enumerados entre os dois ensaios.

Sem o passo do citospino, é difícil diferenciar os glóbulos brancos das células tumorais, devido aos contornos embaçados nos preps celulares não citospin. Aqui podem ser observados diferentes achados representativos de diferentes amostras de pacientes, com a contagem residual dos glóbulos brancos, em particular, determinada a ser fortemente variável, e dependente de toda a amostra de sangue. Também foi observada alta variabilidade nas subsu populações de células tumorais circulantes obtidas.

Cada célula no citospin é identificada pelo software de análise de imagens, e permite o rastreamento de células e manualmente para confirmar os resultados conforme necessário. De fato, uma análise piloto demonstrou uma concordância entre a enumeração manual e a enumeração do software de análise de imagens. A configuração da placa de petri úmida projetada internamente para a hibridização proteína-anticorpo é fundamental, pois o dispositivo permanece suficientemente úmido durante todo o tempo de incubação.