Análise de marcha de baixo custo para fenotipagem comportamental de modelos de camundongo de doença neuromuscular

A análise da pegada é uma alternativa de baixo custo para digitalizar programas de análise de marcha para pesquisadores quantificando anormalidades de movimento em camundongos. Devido à sua velocidade, simplicidade e potencial longitudinal, este método é ideal para o fenotismo comportamental de modelos de camundongos, incluindo modelos de doença neurodegenerativa, doença neuromuscular ou acidente vascular cerebral. Demonstrando o procedimento será Virginia Wertman, uma técnica de pesquisa do meu laboratório.

Antes de iniciar o experimento, aclimam camundongos que estiveram totalmente acordados e alertam por pelo menos cinco minutos para a sala de ensaios por 30 minutos. Posicione o túnel sobre uma faixa de papel ligeiramente maior e mais longa que o comprimento e largura do túnel. Marque o papel com a ID do mouse e a data do teste.

Adicione sementes de girassol à câmara de gol para motivação conforme necessário e escroto firmemente o primeiro rato a ser testado. Usando pontas de pincel afiladas de aproximadamente 0,5 centímetros de diâmetro, pinte toda a parte inferior de todos os dedos dos dedos dos dedos dos dedos e o centro de cada previu com uma cor de tinta nãotóxica à base de água. Cubra as patas traseiras com uma cor de tinta nãotóxica nãotóxica contrastante à base de água de forma semelhante.

Use um pano úmido limpo para remover qualquer tinta que o rato obtenha em outras partes do corpo para evitar manchas que possam interferir na coleta de dados. Em seguida, coloque o rato no início do túnel. Deixe o rato andar todo o caminho até a câmara do gol antes de recuperar o animal para limpar suavemente seus pés com um pano umedecido com água.

Em seguida, devolva o rato para sua gaiola doméstica e limpe a área de teste e túnel com um desinfetante antes de testar o próximo animal. Para uma pontuação precisa, permita que as pegadas sequem completamente antes de selecionar etapas que são consistentemente espaçadas com pegadas claras e não borradas. Para gerar dados de pontuação suficientes, deve haver pelo menos dois passos consecutivos de cada pé.

Não inclua as primeira e últimas pegadas no papel, pois é improvável que representem uma marcha normal porque o mouse estava mudando sua velocidade de caminhada. Para definir o comprimento do passo como a distância entre duas pegadas sequenciais criadas pelo mesmo pé, use um lápis para desenhar um círculo de dois a quatro milímetros em torno da região do antepé de ambas as pegadas de primeiro passo em um único passo e use uma régua para desenhar uma linha entre os círculos. Registo a distância entre duas impressões do meio de cada círculo como um ante a frente direita ou um da frente esquerda, conforme apropriado e repita a medição para cada uma das etapas que podem ser pontuadas.

Em seguida, média de todos os indivíduos registrados distâncias de passo para cada membro média de pontuações individuais dentro de uma coorte juntos como experimentalmente apropriado. Para definir a largura do passo como a distância entre os membros dianteiros esquerdo e direito ou os blocos traseiros, desenhe e meça uma linha da região do antepé círculo de um passo traseiro que se cruza perpendicularmente com a linha para o comprimento do passo na linha traseira contralateral. Repita esta medição para todas as impressões de subida traseira que podem ser pontuadas e a média das medidas.

Para definir o dedo do pé espalhado como a distância entre o primeiro e o último dedo do pé em um único anteir ou pegada de subida traseira, use pinças para medir a distância entre a ponta da primeira impressão do dedo do pé e a ponta da impressão do último dedo do pé. Em seguida, repita a medição para todas as impressões de subida traseira que podem ser pontuadas e a média das medidas. Com um número suficiente de animais, este procedimento é capaz de detectar diferenças de marcha entre genótipos de camundongos dentro da mesma cepa ao longo do tempo.

Por exemplo, aqui são mostrados traços representativos de imagens de pegada coletadas usando um modelo de rato de atrofia muscular espinhal e bulbar ligada a x, uma desordem neurodegenerativa que afeta neurônios motores inferiores e músculo esquelético. A análise de marcha de transgênicos pré-sintomáticos e pós-sintomáticos e controle de erva-de-ninhada camundongos masculinos revela que antes do início da doença, os camundongos transgênicos apresentam um comprimento de passo semelhante, largura de passo e propagação do dedo do pé em comparação com seus controles não transgênicos. Após o início da doença, no entanto, os animais transgênicos apresentam comprimentos de passo significativamente mais curtos.

Análises longitudinais semelhantes não revelaram diferenças na largura do passo em nenhuma das idades testadas. Camundongos transgênicos pós-sintomáticos também têm uma propagação traseira significativamente mais estreita do que os controles de ninhada da idade. Uma aplicação adequada da tinta nas patas produzirá os melhores resultados.

Lembre-se que apenas passos que são consistentemente espaçados com pegadas claras não borradas devem ser pontuados. Esta técnica é sensível o suficiente para detectar pequenas alterações no passo. E devido à sua abordagem não invasiva, permite testar grupos ao longo de sua vida apresentação fenotípica e intervenções terapêuticas.