Uma novela nicotinamida adenina dinucleotídeo método de correção para CA intracelular2 + medição com fura-2-analógico em células ao vivo
20 de setembro de 2019
Devido à sobreposição espectral dos comprimentos de onda da excitação e da emissão de análogos de NADH e de fura-2, a interferência do sinal de ambos os produtos químicos em pilhas vivos é inevitável durante a medida quantitativa de [Ca2 +]. Assim, um novo método de correção on-line de interferência de sinal NADH para medir [Ca2 +] foi desenvolvido.
Sondas plurais excitáveis UV, têm uma contaminação inerente ao sinal, por causa dos sons auto-plurais. A maior parte do problema com o NADH é limitar o uso de uma sonda plural. Um método pode ser usado, para corrigir precisamente a florescence externa do NADH, a fim de extrair um sinal de sonda plural verdadeiro e não contaminado.
Demonstrando o procedimento estará Jeong Hoon Lee, nosso professor assistente de pesquisa do meu laboratório. Depois de permitir que os miócitos se acomodem no fundo do tubo, aspire o supernatante. Rotule as células com dois mililitros de solução de diluição de fura-2-FFAM recém-preparada por 60 minutos a quatro graus Celsius.
No final da incubação, coloque o tubo em um banho de água de 37 graus Celsius por 30 minutos na posição vertical antes de remover o sobrenante. Em seguida, adicione quatro mililitros de cultura de temperatura ambiente para armazenamento à temperatura ambiente. Para in situ isobestic fura-2-ffa identificação ponto montar as células diluídas no estágio microscópio e esperar três minutos para que as células afundem até o fundo.
Profuse solução sem NADH sem cálcio de 37 graus Celsius na cultura celular e localize uma célula alvo. Solução de saponina profusa por 60 segundos antes de reformular com a solução livre de cálcio sem NADH. Meça simultaneamente os sinais emitidos fura-2-ff a 450 e 500 nanômetros, usando uma varredura de excitação de 350 a 365 nanômetros com um passo de 0,1 nanômetro e reaproveitamento com solução livre de cálcio sem NADH.
Em seguida subtraia os sinais na solução saturada de cálcio a partir dos sinais nas condições livres de cálcio. Em seguida, calcule os desvios padrão da emissão em cada excitação e selecione o comprimento de onda de excitação mostrando os valores mínimos de desvio padrão como pontos isobesticos individuais. Para usar um sistema de medição multi-paramétrico para detectar o sinal de fundo e corrigir o sinal dentro da área celular, monte células livres de corantes no banho de microscópio e permita que as células se acomodem por três minutos.
Profuse solução sem cálcio NADH no banho por cerca de cinco minutos a uma taxa de dois a três mililitros por minuto e defina o campo objeto para cobrir a célula alvo. Depois de mover a célula para fora do campo, meça os sinais de fundo da janela livre de células e defina os sinais como deslocamentos. Em seguida, devolva a célula à posição inicial e meça os sinais de fundo da célula e a área celular.
Para calcular o fator R use o fundo celular adquirido e os sinais de área antes de remontar as células livres de corantes ao microscópio e profusar com solução livre de cálcio. Meça os sinais como indicado antes de profusar a suspensão da célula com solução de malate. Depois de medir os sinais profuse as células com solução piruvato seguida de profusão com solução de malate-pirudo e solução rotenone.
Em seguida, calcule a inclinação para cada sinal. Aqui são mostradas as mudanças no cálcio mitocondrial antes e depois da correção. Os resultados revelam claramente mudanças substanciais no cálcio mitocondrial com uma concentração mitocondrial de cálcio de repouso sem cálcio citosolico de 1,03 mais ou menos 0,13 micromolar e cálcio mitocondrial máximo em um micromolar de cálcio de 29,6 mais ou menos 1,61 micromolar.
O potencial transmembrano mitocondrial foi monitorado com uma profusão de dois nanomolars TMRE. A mudança no potencial mitocondrial foi calculada com base em um suposto potencial inicial inicial de membrana mitocondrial de menos 150 milivolts, demonstrando uma diminuição do NADH em resposta à adição de cálcio, com um efeito negliável sobre o potencial da membrana mitocondrial. O pH mitochondiral não foi efetuado pelo aumento do cálcio mitocondrial induzido pelo carregamento carboxy SNARF-1.
Pontos isobesticos incorretos resultam em correção incorreta de R e NADH. Por isso, tome cuidado para medir sempre corretamente o fundo livre de células e a área celular. Esta técnica é usada para preparar estudos dinâmicos mitocondriais de cálcio nos derramamentos bioanalíticos.
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Visão Geral
Este estudo aborda o desafio da interferência de sinal proveniente de NADH e análogos de fura-2 ao medir concentrações de cálcio em células vivas. Foi desenvolvido um novo método de correção online para melhorar a precisão das medições de [Ca2+] na presença de contaminação pelo sinal de NADH.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Interferência de sinal em medições de fluorescência
- Medição de cálcio em células vivas
- Desenvolvimento de técnicas de correção
Contexto
- A sobreposição espectral dos comprimentos de onda de excitação e emissão complica as medições.
- O NADH pode limitar a utilidade de múltiplos sondas na microscopia de fluorescência.
- Medições precisas de [Ca2+] são cruciais em estudos celulares.
Métodos Utilizados
- Medição de fluorescência com fura-2
- Ensaios celulares com miócitos
- Técnicas de correção de sinal e medição de fundo
Resultados Principais
- Alterações significativas nas concentrações de cálcio mitocondrial observadas.
- Desenvolveu-se uma abordagem sistemática para corrigir a interferência de NADH.
- Técnica validada por meio de procedimentos experimentais rigorosos.
Conclusões
- O estudo demonstra com sucesso um método para melhorar a precisão da medição de fluorescência.
- Isso tem implicações para análises quantitativas em biologia celular.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A medição precisa do cálcio intracelular é fundamental para a validação de alvos no descobrimento de fármacos, particularmente nas vias de sinalização mitocondrial. A autofluorescência de NADH introduz interferência significativa em ensaios baseados em fura-2, comprometendo a confiabilidade dos dados e aumentando as taxas de falsos positivos na triagem inicial. Este método de correção de NADH aumenta a confiança preditiva ao isolar sinais verdadeiros de cálcio, apoiando a desmistificação mecanicista em programas de alvos cardiovasculares e metabólicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Valor Científico: Permite investigar o manuseio de cálcio mitocondrial como hipótese terapêutica em modelos de doenças.
- Valor Operacional: Reduz a ambiguidade mecanicista ao separar a autofluorescência de NADH dos sinais verdadeiros de fura-2.
- Valor Preditivo: Melhora a confiança no alvo por meio de medições quantitativas de fluxo de cálcio livres de interferência.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Prontidão do Ensaio: Prepara sistemas biológicos validados para triagem de compostos em etapas subsequentes, estabelecendo a fluorescência corrigida por NADH como referência inicial.
- Reprodutibilidade: Padroniza a seleção do comprimento de onda de excitação por meio da determinação do ponto isobéstico, minimizando a variabilidade entre ensaios.
- Capacidade de Multiplexação: Permite a medição simultânea de NADH, cálcio e pH ou potencial de membrana utilizando conjuntos distintos de excitação/emissão.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Aplicável diretamente a modelos de disfunção mitocondrial em distúrbios neurodegenerativos e metabólicos.
- Continuidade Translacional: Conecta observações de fluxo de cálcio na fase de descoberta à validação pré-clínica utilizando sinais corrigidos de fura-2-FF.
- Avanço Ajustado ao Risco: Permite decisões mais confiáveis de avançar/não avançar ao reduzir sinais falsos em ensaios de cálcio mitocondrial.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método insere-se no continuum de descoberta que vai da verificação da hipótese do alvo até a identificação de compostos líderes e a validação mecanicista pré-clínica, especificamente para alvos mitocondriais.
- Biologia da Descoberta: Apoia a clarificação de vias ao isolar sinais dependentes de cálcio da interferência metabólica em ensaios com células vivas.
- Triagem: Melhora a prontidão do ensaio por meio da subtração do fundo e correção de deslocamento, aumentando a relação sinal-ruído para avaliação de compostos.
- Análises: Permite medições quantitativas ratiométricas por meio do cálculo do fator R utilizando emissão corrigida em 450 nm e 500 nm.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se a trabalhos pré-clínicos por meio do monitoramento simultâneo de cálcio e potencial da membrana mitocondrial utilizando TMRE.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um framework de correção reutilizável, aplicável entre diferentes tipos celulares e sondas fluorescentes suscetíveis à interferência de NADH.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao eliminar falsos positivos induzidos por NADH na sinalização de cálcio.
- Valor Operacional: Melhora a padronização e reprodutibilidade do ensaio por meio da identificação sistemática do ponto isobéstico e subtração do fundo.
- Valor Estratégico: Apoia decisões mais precisas de prosseguir/interromper ao reduzir o ruído biológico nas etapas iniciais de triagem.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos mitocondriais por meio de leituras funcionais confiáveis e livres de interferências.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em microscopia de fluorescência e manipulação de sondas ratiométricas.
- Necessita de instrumentação capaz de varredura de excitação em comprimentos de onda (350–365 nm) e detecção de emissão dupla (450 nm, 500 nm).
- Exige padronização entre equipes nos protocolos de medição de sinal de fundo e correção de deslocamento.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar o método a diferentes fluxos de trabalho de preparação de células livres de corante.
- Depende de medições cuidadosas dos sinais de fundo sem células e da área celular para evitar seleção incorreta do ponto isobéstico.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:04
Title
0:41
Mitochondrial Fluoroprobe Loading
1:22
In Situ Isosbestic Fura-2-FF Point Identification
2:40
Background Signal Detection and Cell Area Correction
3:30
R Factor Measurement
4:12
Results: Representative Intracellular Ca2+ Measurement
5:15
Conclusion
