Name: Análise de conteúdo de gotas lipídicas em leveduras de fissão e brotamento usando processamento automatizado de imagens (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Aprenda a analisar gotas lipídicas em leveduras de fissão e brotamento usando microscopia de fluorescência e processamento automatizado de imagens. Este método padronizado permite quantificação imparcial e de alta vazão.

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Este trabalho foi apoiado pela Universidade Charles concede PRIMUS/MED/26, GAUK 1308217 e SVV 260310. Agradecemos a Ondřej Šebesta pela ajuda com microscopia e desenvolvimento do pipeline de análise de imagem. Agradecemos ao laboratório ReGenEx por cepas de s. cerevisiae e ao laboratório Japonet e Hironori Niki para cepas de s. japonicus . A cepa custos ppc1-88 foi fornecida pelo centro de recursos genéticos de levedura do Japão. A microscopia foi realizada no laboratório de microscopia confocal e de fluorescência cofinanciada pelo Fundo Europeu de desenvolvimento regional e pelo orçamento do estado da República Tcheca (projeto n º CZ. 1.05/4.1.00/16.0347 e CZ. 2.16/3.1.00/21515).

1. preparação de soluções e mídia
<ol><li>
Prepare a solução de coloração lipídica.
	<ol>
<li>Para preparar a solução de coloração lipídica de estoque dissolva 10 mg de BODIPY 493/503 em 10 mL de DMSO anidro (concentração final de 1 mg/mL). Dissolva todo o conteúdo de um frasco para injetáveis de 10 mg BODIPY 493/503 para evitar a perda de material durante a pesagem. Atenção: DMSO pode passar através da pele. Use equipamento de proteção individual apropriado.</li>
		<li>Prepare a solução de coloração lipídica de trabalho misturando 100 μL da solução de estoque de 1 mg/mL BODIPY 493/503 e 900 μL de DMSO anidro (concentração final 0,1 mg/mL).</li>
		<li>Aliquot as ações e soluções de trabalho, e armazenar a-20 ° c. Nota: O BODIPY dissolvido 493/503 é estável por vários anos a-20 ° c. No entanto, a solução tem de ser protegida da humidade e da luz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para preparar a solução de estoque para visualização de limite celular, dissolva 25 mg de cascata azul dextrano (frasco inteiro) em 2,5 mL de água desionizada (concentração final 10 mg/mL). Aliquot a solução de estoque e armazene a-20 ° c protegida da luz.</li>
	<li>Para preparar a solução de revestimento de slides de microscópio, dissolva 5 mg de lectina de soja em 5 mL de água desionizada (concentração final de 1 mg/mL). Aliquot a solução do lectina e armazene em-80 ° c. Nota: A solução de lectina é estável por vários anos a-80 ° c. As alíquotas atualmente em uso podem ser armazenadas a-20 ° c.</li>
	<li>
Prepare meios de cultivo.
	<ol>
<li>Para preparar 400 mL de meio de cultivo complexo Sim para s. pombe e s. japonicus, dissolver 2 g de extrato de levedura e 0,1 g de suplementos de SP (se necessário para mutantes auxotróficos) em 340 ml de água desionizada em um frasco de 500 ml e autoclave. Adicionar 60 mL de 20% (p/v) de glicose esterilizada ou autoclavada separadamente em condições assépticas.</li>
		<li>Para preparar 400 mL de meio de cultivo de EMM definido para s. pombe e s. japonicus, dissolver 4,9 g de caldo EMM sem dextrose em 360 ml de água desionizada em um frasco de 500 ml e autoclave. Adicionar 40 mL de 20% (p/v) de glicose esterilizada ou autoclavada separadamente em condições assépticas. Nota: Para as orientações gerais sobre o cultivo de s. pombe e s. japonicus ver25 e26, respectivamente.</li>
		<li>Para preparar 300 mL de meio complexo de cultivo de YPAD para Saccharomyces cerevisiae, dissolver 3 g de extrato de levedura, 6 g de peptona e 30 mg de sulfato de adenina em 270 ml de água desionizada em um frasco de 500 ml e autoclave. Adicione 30 mL de 20% (w/v) de glicose esterilizada separadamente ou esterilização por filtro em condições assépticas.</li>
		<li>Para preparar 300 mL de meio mínimo definido para S. cerevisiae, dissolver 2 g de base de nitrogênio de levedura (sem aminoácidos) em 270 ml de água desionizada em um frasco de 500 ml e autoclave. Adicione 30 mL de 20% (w/v) de glicose esterilizada separadamente ou esterilização por filtro em condições assépticas. Nota: Para directrizes gerais no cultivation de S. cerevisiae Veja27.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. cultivo de células
<ol><li>
Crescendo s. pombe ou s. japonicus para fase estacionária exponencial ou precoce.
	<ol>
<li>Pela manhã, inocular 5 mL de meio sim com biomassa de levedura de fissão fresca. Incubar a 32 ° c com agitação (180 rpm) por várias horas. Nota: Para todos os cultivations, use frascos de Erlenmeyer que têm 10 vezes o volume de cultura para assegurar a aeração apropriada. Alguns laboratórios preferem cultivar leveduras de fissão a 30 ° c, mas a temperatura de cultivo de 32 ° c resulta em tempos de duplicação mais curtos sem efeitos prejudiciais para as células, reduzindo assim o tempo total necessário para realizar um experimento25,28 .</li>
		<li>No final da tarde do mesmo dia (após pelo menos 6 horas de cultivo), diluir a cultura com meio Sim fresco para um volume de cultura final de 10 mL para que atinja a densidade óptica desejada (OD) (ou número de células/mL) na manhã seguinte, e incubar a 32 ° c com s haking (180 rpm). É vantajoso saber o tempo de duplicação de cada cepa usada para determinar com precisão o fator de diluição (use a equação 1). <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59889/59889eq01v3.jpg"> Onde vcultura é o volume de pré-cultura necessário para a diluição, vfinal é o volume total da nova cultura (10 ml para cultivações padrão), ODfinal é o OD desejado para ser atingido o manhã seguinte, ODatual é o OD atualmente medido da pré-cultura, t é o tempo de crescimento celular até a colheita, tlag é a duração da fase lag (depende de condições de laboratório, precisa ser empiricamente definido) e tdt é o tempo de duplicação da estirpe. Nota: Quando as células de fase exponencial devem ser analisadas, não deixe que as pré-culturas atinjam a fase estacionária, pois isso altera drasticamente a fisiologia celular (incluindo o conteúdo de LD) para várias gerações subsequentes.</li>
		<li>Na manhã do dia da imagem latente, se a cultura alcangou um OD ligeiramente mais elevado do que exigido (em caso das pilhas da exponencial-fase), dilui-o com Sim fresco e continue a incubação pelo menos mais dois tempos de duplicação antes de manchar de LDs. caso contrário, prossiga diretamente para coloração (secção 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Crescendo S. cerevisiae para fase exponencial e estacionária.
	<ol>
<li>À tarde, inocular 10 mL de meio YPAD com uma pequena quantidade de biomassa de levedura de brotamento fresco e incubar durante a noite a 30 ° c com agitação (180 rpm).</li>
		<li>A manhã do dia da imagem latente, diluir a cultura a OD 0,1 em 10 mL do meio de YPAD e crescer ao OD exigido (por exemplo, OD 1 para a fase exponencial). Realize quaisquer diluições de cultura, conforme descrito na etapa 2.1.2. Proceder à coloração (secção 3).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. coloração do droplet do lipido
<ol><li>Prepare um deslizamento da tampa do microscópio para que cada amostra seja imaged. Espalhe 1 μL de solução de revestimento deslizante para um deslizamento de cobertura limpo usando o lado longo de uma ponta de pipeta posicionada horizontalmente. Permita que a solução de revestimento seque completamente e armazene os deslizamentos da tampa em um ambiente Dust-Free. Nota: As lâminas de vidro e as coberturas podem ser limpas antes da utilização, se necessário. O procedimento de limpeza consiste em lavar com detergente para lavar louça, enxaguar com água, imersão durante a noite em ácido clorídrico a 3% e lavagem com água destilada. Os slides limpos e as coberturas são armazenadas em etanol puro até o uso.</li>
	<li>Medir o OD da cultura da célula ou número de células/mL, conforme necessário. Tente alcançar valores semelhantes entre todas as cepas testadas para garantir condições experimentais comparáveis.</li>
	<li>Pipete 1 mL de cada cultura de células para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Apenas para S. cerevisiae , adicione 5 μL da solução de revestimento da lâmina, vórtice brevemente e incubar a 30 ° c com agitação durante 5 min.</li>
	<li>Adicione 1 μL da solução de coloração lipídica a cada alíquota de cultura e Vortex brevemente. Em seguida, adicione 10 μL da solução de visualização de limite de célula e vórtice brevemente. Nota: Não Prepare soluções pre-misturadas de ambas as manchas porque esta conduz à têmpera da fluorescência de BODIPY 493/503.</li>
	<li>Recolher as células por centrifugação (1.000 x g, 3 min, RT) e remover quase todos os sobrenadantes (~ 950 μL). Ressuscitem as células no sobrenadante remanescente.</li>
	<li>Pipetar 2 μL da suspensão de células densas num deslizamento de cobertura revestido com lectina e colocar numa lâmina de microscópio limpa. As células devem formar uma monocamada. Proceder à microscopia (secção 4) o mais rapidamente possível para minimizar artefactos em imagens; processo máximo de duas amostras de cada vez.</li>
</ol>4. Configurando o microscópio e imagem
<ol><li>
Otimize as condições de imagem. Nota: a configuração do microscópio requer longas exposições a fontes de luz fortes que podem causar danos à amostra e distorcer os resultados. Portanto, configure as condições de imagem usando um slide de amostra dedicado que não será mais usado para quantificação de LD.<ol>
<li>Concentre-se nas células usando contraste de fase ou contraste de interferência diferencial (DIC). Nota: Contraste de fase ou imagens DIC podem ser tomadas para referência, mas eles não são usados durante a etapa de análise de imagem automatizada.</li>
		<li>Defina as configurações da pilha z para abranger todo o volume da célula. A distância vertical total depende do tamanho da célula; o número de fatias ópticas depende da abertura numérica do objetivo (função de propagação de pontos no eixo z). Defina o foco para mover em relação ao plano focal central. Nota: O número ideal de fatias é muitas vezes definido pelo software de controle do microscópio e não precisa ser calculado manualmente. As larguras de células típicas são 3-5 μm para s. pombe, 4-7 μm para s. japonicuse 3-7 μm para s. cerevisiae.</li>
		<li>Para imagem LDs, definir a intensidade da luz e tempo de exposição no canal verde (excitação e emissão Maxima de BODIPY são 493 e 503 nm, respectivamente). Nota: BODIPY 493/503 é um fluorochrome muito brilhante; Entretanto, pode começ descorado ràpida com intensidade de luz excessivamente forte. Além disso, os LDs são móveis em células ao vivo, assim minimizam o tempo de exposição e capturam a pilha z de canal verde em primeiro lugar (antes de mudar para o canal azul) para evitar desfoque de artefatos. Além disso, leve em conta o intervalo linear da câmera para a intensidade do sinal para evitar pixels saturados.</li>
		<li>Para os limites da célula de imagem, defina a intensidade da luz e o tempo de exposição no canal azul (a excitação e o Maxima de emissão do dextrano azul de cascata são 400 e 420 nm, respectivamente). Nota: A intensidade do sinal na canaleta azul é exigida para a segmentação da imagem, mas não é usada para a quantificação do LD própria. Portanto, as configurações ideais neste canal não são cruciais para análise.</li>
		<li>Se possível, crie um fluxo de trabalho experimental automatizado no software de controle do microscópio para facilitar a imagem latente de amostras múltiplas circunstâncias estandardizadas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Uma vez que as condições de imagem foram otimizadas, amostras de imagens a serem usadas para quantificação. Concentre-se nas células e imagem-los em canais verdes e azuis, conforme descrito na etapa 4,1. Nota: Todas as imagens devem ser adquiridas usando as mesmas configurações para permitir a comparação entre as amostras. Imagem vários campos de visão por amostra para obter dados robustos e representativos.</li>
	<li>Salve as imagens de pilha z de canal azul e verde como arquivos TIFF de várias camadas de 16 bits (ou seja, dois arquivos por campo de visão). Inclua palavras "verde" ou "azul" nos nomes de arquivo correspondentes. Proceder à análise da imagem (secção 5).</li>
</ol>5. análise de imagem
<ol><li>
Verifique visualmente a qualidade das imagens adquiridas.
	<ol>
<li>Abra imagens microscópicas em ImageJ29,30 ou outro software de análise de imagem adequado.</li>
		<li>Remova todas as pilhas de imagens que contenham um número considerável de células que foram movidas durante a aquisição (e, portanto, criaram artefatos de desfocagem).</li>
		<li>Remova todas as pilhas da imagem que contêm partículas altamente fluorescentes da não-pilha no canal azul (por exemplo, sujeira na corrediça do microscópio ou no deslizamento da tampa, impurezas no meio do cultivo). Nota: Objetos não-célula muito brilhantes no canal azul podem criar artefatos de detecção de células ou podem interferir com a detecção de células em sua vizinhança.</li>
		<li>Remova todas as pilhas da imagem que contêm uma grande proporção de pilhas inoperantes (isto é, pilhas com fluorescência azul aumentada comparada às pilhas vivos). Nota: Enquanto a presença de uma pequena proporção de células mortas na amostra normalmente não é um problema e essas células são automaticamente descartadas durante a análise, algumas células mortas ou morrendo podem ocasionalmente ser reconhecidas como células ao vivo pelo algoritmo de segmentação e, portanto, distorcer os resultados relatados.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Analise imagens no software MATLAB.
	<ol>
<li>Crie uma pasta principal e copie todos os scripts MATLAB para este local.</li>
		<li>Crie uma subpasta ("pombe", "cerevisiae" ou "japonicus") e copie os arquivos de imagem TIFF de entrada para este local.</li>
		<li>Inicie o MATLAB, abra o script MAIN. m e execute-o. No menu, selecione as espécies de levedura a serem analisadas e inicie o processamento da imagem. Nota: Alguns dos parâmetros necessários para a detecção de células e LD são pré-definidos para as espécies específicas, outros são determinados automaticamente durante o processamento de imagens. Os valores pré-estabelecidos foram determinados empiricamente e dependem de vários fatores, como ampliação objetiva, tipo de câmera e sensibilidade, e configurações de imagem. Se necessário, os usuários podem editar os arquivos de script para alterar as predefinições específicas do organismo para refletir melhor sua configuração experimental. Ou seja, durante o reconhecimento de células, os tamanhos de objetos aceitáveis são fornecidos pelos parâmetros "minArea" e "maxArea", e a fração mínima do volume preenchido dentro dos limites do objeto é dada pelo parâmetro "solidez". Para o reconhecimento LD, o limiar de luminosidade é dado pelo parâmetro "th" (o seu valor é afetado principalmente por profundidade de bits de imagem e intensidade do sinal de fluorescência), e o tamanho máximo aceitável de LD é dado pelo parâmetro "MaxArea".</li>
		<li>Inspecione e processe os arquivos de saída conforme necessário usando um editor de planilhas ou um pacote estatístico; o fluxo de trabalho produz arquivos CSV separados por ponto-e-vírgula e segmentado arquivos TIFF com objetos de célula detectados e LDs. Nota: O fluxo de trabalho segmenta imagens em objetos de plano de fundo e de célula, onde cada objeto de célula pode ser composto de várias células adjacentes. Portanto, a saída em arquivos "xxxx_cells. csv" não representa dados de célula única e só deve ser usada para calcular métricas de volume por unidade de célula.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A compreensão do metabolismo lipídico e sua regulação é importante tanto para a biologia básica, quanto para aplicações clínicas e biotecnológicas. O teor de LD representa uma leitura conveniente do estado de metabolismo lipídico da célula, sendo a microscopia de fluorescência um dos principais métodos utilizados para determinação do teor de LD. O protocolo apresentado permite a deteção automatizada e a descrição quantitativa de LDs individuais em três espécies diferentes e morfològica distintas do fermento. A nosso conh...

Os lipídios desempenham papéis cruciais na energia celular e no metabolismo do carbono, na síntese dos componentes da membrana e na produção de substâncias bioativas. O metabolismo lipídico é ajustado de acordo com as condições ambientais, a disponibilidade de nutrientes e a fase1do ciclo celular. Nos seres humanos, o metabolismo lipídico tem sido ligado a doenças, tais como obesidade, diabetes tipo II e câncer2. Na indústria, os lipídios produzidos por microrganismos, como leveduras, representam uma fonte promissora de combustíveis diesel renováveis3. As células armazenam lipídios neutros nas chamadas gotículas lipídicas (LDs). Estes corpos evolutivamente conservados são compostos de triacilgliceróis, ésteres de esterilo, monocamada fosfolipídica externa e proteínas associadas1. Os LDs se originam no retículo endoplasmático, exercem dinâmicas de ciclo celular ou de fase de crescimento e são importantes para a homeostase lipídica celular1. O número e a morfologia do LD podem ser usados como um proxy conveniente ao ensaio o metabolismo do lipido várias condições de crescimento ou ao selecionar um painel dos mutantes. Dada a sua natureza dinâmica, as técnicas capazes de analisar as propriedades dos LDs individuais são de particular interesse em estudos de metabolismo lipídico.
Várias espécies de leveduras têm sido usadas para descrever as vias metabólicas relacionadas a lipídios e sua regulação, ou usadas em biotecnologia para produzir compostos ou combustíveis interessantes1. Além disso, para leveduras modelo, como a levedura brotamento Saccharomyces cerevisiae ou o fermento de fissão distante relacionados Schizosaccharomyces pombe, bibliotecas de deformação de exclusão de todo o genoma estão disponíveis que podem ser usados para alta taxa de transferência telas4,5. Recentemente a composição e a dinâmica do LD foram descritas em S. pombe6, 7,8,9, e os mutantes relativos ao metabolismo lipídico foram isolados no fermento modelo emergente Schizosaccharomyces japonicus10.
As técnicas numerosas estão disponíveis para estudar o índice e a dinâmica do LD. A maioria emprega algum tipo de coloração de LDs com corantes lipofílicos como o Nilo vermelho ou BODIPY 493/503. Este último apresenta espectros de excitação e emissão mais estreitos e especificidade aumentada em relação aos lipídios neutros (LDs) em oposição aos fosfolipídeos (membranas)11. Métodos fluimétricos e de fluxo-citometria têm sido utilizados com sucesso em várias espécies fúngicas para descobrir genes e condições de crescimento que afetam o conteúdo lipídico do armazenamento12,13,14,15. Embora esses métodos sejam adequados para aplicativos de alta taxa de transferência, eles não podem medir os números e a morfologia de LDs individuais nas células, o que pode diferir drasticamente entre as condições de crescimento e os genótipos. A dispersão coerente de Raman ou a microscopia holográfica digital são métodos Label-Free que produzem dados do LD-nível, mas exigem o equipamento caro especializado16,17,18. A microscopia de fluorescência, de um lado, pode fornecer dados detalhados no índice do LD, ao utilizar instrumentos geralmente disponíveis e ferramentas de software da análise de imagem. Existem vários fluxos de trabalho de análise que apresentam vários graus de sofisticação e automação na detecção de células/LD a partir de dados de imagem, e são otimizados para tipos de células diferentes, como células metazoários com grandes LDS19,20 , 21, ou leveduras de brotamento17,22,23. Algumas dessas abordagens só funcionam em 2D (por exemplo, em imagens de projeção máxima), o que pode não conseguir descrever de forma confiável o conteúdo de LD celular. A nosso conhecimento, nenhumas ferramentas existem para a determinação do índice do LD e da morfologia dos dados microscópicos da levedura da fissão. O desenvolvimento de análises automatizadas e robustas de nível LD traria maior sensibilidade e maior poder estatístico, e forneceria informações ricas sobre o teor de lipídios neutros, idealmente em várias espécies de leveduras.
Desenvolvemos um fluxo de trabalho para análise de conteúdo de LD a partir de imagens de microscopia de fluorescência 3D de células de levedura. Células ao vivo são manchadas com BODIPY 493/503 e Cascade Blue dextrano para visualizar os LDs e determinar os limites das células, respectivamente. As células são imobilizadas em lâminas de vidro e submetidas à imagem de pilha z usando um microscópio de epifluorescência padrão. As imagens são então processadas por um pipeline automatizado implementado no MATLAB, um pacote amplamente utilizado (comercial) para análises estatísticas. O pipeline realiza pré-processamento de imagens, segmentação (células versus fundo, remoção de células mortas) e identificação de LD. Os dados ricos do LD-nível, tais como o tamanho do LD e a intensidade da fluorescência, são fornecidos então em um formato tabular compatível com as ferramentas de software principais da folha de cálculo. O fluxo de trabalho foi utilizado com sucesso para determinar o impacto da disponibilidade da fonte de nitrogênio no metabolismo lipídico em S. pombe24. Agora Demonstramos a funcionalidade do fluxo de trabalho em s. pombe, s. japonicus e s. cerevisiae, usando condições de crescimento ou mutantes que afetam o conteúdo de LD celular.

<table><tbody><tr><td>Câmera CCD monocromática de 12 bits Hamamatsu ORCA C4742-80-12AG</td><td>Hamamatsu</td><td>&nbsp;</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>Sal de hemissulfato de adenina, &ge; 99%</td><td>Merck</td><td>A9126-25G</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>BODIPY 493/503 (4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3922</td><td>para coloração lipídica neutra</td></tr><tr><td>D-(+) - Glicose, &ge; 99,5%</td> <td>Merck</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Cascade Blue, 10.000 MW, Aniônico, Lisina Fixável</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1976</td><td>para coloração negativa de células</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido, &ge; 99,5%</td> <td>Merck</td><td>D4540</td><td>ou pureza superior, mantenha anidro em peneiras moleculares</td></tr><tr><td>Caldo EMM sem dextrose</td><td>Para meio</td><td>PMD0405</td><td>meio também pode ser preparado a partir de componentes individuais</td></tr><tr><td>Software Fiji/ImageJ</td><td>NIH</td><td>&nbsp;</td><td>ou equivalente; para inspeção visual de dados microscópicos</td></tr><tr><td>Vidros de cobertura de alta precisão, 22 mm x 22 mm, No 1.5</td><td>VWR</td><td>630-2186</td><td>use qualquer vidro de cobertura # 1.5</td></tr><tr><td>Caixa de ferramentas de processamento de imagem para MATLAB, versão 10.0</td><td>Mathworks</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Lectina de Glycine max (soja)</td><td>Merck</td><td>L1395</td><td>para imobilização celular em lâminas</td></tr><tr><td>Software MATLAB, versão 9.2</td><td>Mathworks</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Lâmina de microscópio, 26 mm x 76 mm, espessura de 1 mm</td><td>Vidro de malha</td><td>L762601.2</td><td>use qualquer lâmina de microscópio que se ajuste ao seu estágio de microscópio, limpe completamente antes de carregar as células</td></tr><tr><td>Microscópio Olympus CellR com movimento automático de objetiva do eixo z</td><td>Olympus</td><td>&nbsp;</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>Conjunto de filtros</td><td>Pentaband Semrock</td><td>F66-985</td><td>canais de campo claro, verde e azul são suficientes</td></tr><tr><td>Caixa de Ferramentas de Processamento de Sinal para MATLAB, versão 7.4</td><td>Mathworks</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Suplementos</td><td>SP Formedium</td><td>PSU0101</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Computador de escritório padrão capaz de executar MATLAB&</td><td>nbsp;</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Caixa de ferramentas de estatística e aprendizado de máquina para MATLAB, versão 11.1</td><td>Mathworks</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Peptona universal M66 para microbiologia</td><td>Merck</td><td>1070431000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Objetivo UPLSAPO 60XO</td><td>Olympus</td><td>&nbsp;</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>para meio</td><td>YEA03</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos</td><td>Para o meio</td><td>CYN0405</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

análise de conteúdo de gotas lipídicas em leveduras de fissão e brotamento usando processamento automatizado de imagens

Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing

O metabolismo lipídico e seu regulamento são de interesse para as Ciências da vida básica e aplicada e biotecnologia. A este respeito, várias espécies de leveduras são usadas como modelos na pesquisa metabólica lipídica ou para a produção de lipídios industriais. Gotículas lipídicas são corpos de armazenamento altamente dinâmicos e seu conteúdo celular representa uma leitura conveniente do estado metabólico lipídico. A microscopia de fluorescência é um método de escolha para a análise quantitativa de gotas lipídicas celulares, pois depende de equipamentos amplamente disponíveis e permite a análise de gotas lipídicas individuais. Além disso, a análise de imagem microscópica pode ser automatizada, aumentando consideravelmente a taxa de transferência geral. Aqui, nós descrevemos um fluxo de trabalho experimental e analítico para a deteção automatizada e a descrição quantitativa de gotas lipídicas individuais em três espécies modelo diferentes do fermento: as leveduras da fissão Schizosaccharomyces pombe e Schizosaccharomyces japonicus, e o fermento brotamento Saccharomyces cerevisiae. As gotas do lipido são visualizadas com BODIPY 493/503, e o dextrano fluorescente Cell-impermeable é adicionado aos meios de cultura para ajudar a identificar limites da pilha. As células são submetidas à microscopia de epifluorescência 3D em canais verdes e azuis e as imagens de pilha z resultantes são processadas automaticamente por um pipeline MATLAB. O procedimento produz dados quantitativos ricos sobre o conteúdo de gotas lipídicas celulares e características individuais de gotas lipídicas em um formato tabular adequado para análises a jusante em grandes planilhas ou pacotes estatísticos. Nós fornecemos exemplos de análises de conteúdo de gotículo lipídico várias condições que afetam o metabolismo lipídico celular.

Todo o procedimento é resumido na Figura 1 para as leveduras de fissão (o fluxo de trabalho de levedura de brotamento é análogo), e abaixo fornecemos exemplos de como o fluxo de trabalho pode ser usado para estudar o conteúdo de LD em três diferentes espécies de leveduras várias condições conhecidas afetar o conteúdo da LD celular. Cada exemplo representa um experimento biológico único.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/fil...

Aqui, apresentamos uma implementação de MATLAB de detecção automatizada e descrição quantitativa de gotas lipídicas em imagens de microscopia de fluorescência de fissão e brotamento de células de levedura.

Análise de conteúdo de gotas lipídicas em leveduras de fissão e brotamento usando processamento automatizado de imagens

Lipid metabolism and its regulation are of interest to both basic and applied life sciences and biotechnology. In this regard, various yeast species are ...

Este protocolo facilita análises quantitativas de pequeno a grande porte do conteúdo lipídado de armazenamento celular em uma variedade de espécies de leveduras e o faz de forma imparcial e padronizada. A técnica permite o processamento rápido de imagens microscópicas e fornece saídas quantitativas detalhadas para comparar facilmente amostras como vários mutantes e células cultivadas em diversas condições. Para começar, acompanhe o protocolo de texto que acompanha as soluções de coloração, mídia cultural e células.Certifique-se de que as células estão saudáveis e na fase de crescimento desejada antes de executar o experimento. Em seguida, prepare uma mancha de microscópio para que cada amostra seja imageda. Espalhe um microliter de solução de revestimento deslizante em uma tampa limpa usando o lado longo de uma ponta de pipeta posicionada horizontalmente.Deixe a solução de revestimento secar completamente e, em seguida, armazene as tampas em um ambiente sem poeira. Em seguida, medir as densidades ópticas das culturas celulares, e para que as culturas sejam analisadas na mesma fase de crescimento, tente alcançar valores semelhantes entre todas as culturas testadas para garantir condições experimentais comparáveis. Então, pipeta um mililitro da cultura celular em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.Somente para as células S.cerevisiae, adicione cinco microliters da solução de revestimento de slides ao tubo também. Em seguida, brevemente vórtice todos os tubos de microcentrifuuge, e incuba-los a 30 graus Celsius com agitação por cinco minutos. Em seguida, adicione um microliter da solução de coloração lipídica a cada alíquota de cultura, e vórtice-los brevemente.Em seguida, adicione 10 microliters da solução de visualização do limite celular, e o vórtice-os brevemente uma segunda vez. Colete as células centrifugando-as a 1.000 vezes a gravidade por três minutos à temperatura ambiente. Quando terminar de girar, remova 950 microliters do supernascer e resuspense as células no restante do supernatante usando uma pipeta.Em seguida, pipeta dois microliters da densa suspensão celular em um deslizamento revestido de lectina. Em seguida, coloque a mancha de cobertura em um slide de microscópio limpo para formar uma monocamada celular, e prossiga para microscopia o mais rápido possível para minimizar artefatos em imagens. A configuração do microscópio requer longas exposições a fontes de luz fortes que podem causar danos à amostra e distorcer resultados.Portanto, configure as condições de imagem usando um slide de amostra dedicado que não será mais utilizado para quantificação de gotículas lipídicas. Coloque a amostra dedicada no estágio de uma configuração de microscópio de contraste de contraste de fase ou interferência diferencial e foque nas células. No software do microscópio, defina as configurações de pilha Z para que elas abrangem todo o volume celular.A distância vertical total depende do tamanho da célula, e o número de fatias ópticas depende da abertura numérica do objetivo. Em seguida, defina o foco para mover-se em relação ao plano focal central. Para imagens de gotículas lipídicas, ajuste experimentalmente a intensidade da luz e o tempo de exposição no canal verde.Tenha cuidado ao fotografar, pois o BODIPY é um fluorocromo muito brilhante que pode ser rapidamente fotobleachado. Além disso, minimize o tempo de exposição para evitar a supersaturação. Capture o canal verde z-stack primeiro antes de mudar para o canal azul para evitar desfocar as gotículas lipídicas móveis.Para os limites das células de imagem, defina experimentalmente a intensidade da luz e o tempo de exposição no canal azul. Se possível, configure e use um fluxo de trabalho experimental automatizado no software de controle de microscópio para facilitar a imagem de várias amostras em condições padronizadas. É importante ressaltar que todas as imagens devem ser adquiridas usando as mesmas configurações para permitir a comparação adequada entre as amostras.Uma vez otimizadas as condições de imagem, concentre-se nas células e as imagem nos canais verde e azul. Imagem múltiplos campos de exibição por amostra para obter dados robustos e representativos. Salve as imagens Z-stack do canal azul e verde como arquivos TIFF multicamadas de 16 bits.Certifique-se de incluir as palavras verde ou azul nos nomes de arquivo correspondentes. Abra imagens microscópicas no ImageJ e remova quaisquer pilhas de imagens contendo um número considerável de células que se moveram durante a aquisição. Estes aparecem em posições diferentes em seções individuais Z.Em seguida, remova todas as pilhas de imagens que contenham partículas não-celulares altamente fluorescentes no canal azul. Isso é frequentemente causado por sujeira na superfície de imagem ou impurezas no meio de cultivo e pode interferir na detecção de células em suas proximidades. Além disso, remova quaisquer pilhas de imagens que contenham uma grande proporção de células mortas.Essas imagens exibirão células com fluorescência azul aumentada em comparação com as células vivas. Embora a presença de algumas células mortas na amostra não seja tipicamente um problema e essas células sejam automaticamente descartadas durante a análise, algumas células mortas ou moribundas podem ocasionalmente ser reconhecidas como células vivas pelo algoritmo de segmentação e, portanto, distorcer os resultados relatados. Para começar a análise no MATLAB, primeiro crie uma pasta principal e copie todos os scripts MATLAB para este local.Em seguida, crie subpastas com os nomes das várias espécies de leveduras e copie as respectivas imagens TIFF para esses locais. Agora, inicie o MATLAB, abra o script PRINCIPAL. m, e executar o script.No menu, selecione as espécies de leveduras a serem analisadas e inicie o processamento da imagem. Inspecione e processe os arquivos de saída conforme necessário usando um editor de planilhas ou um pacote estatístico. O fluxo de trabalho produz arquivos CSV separados por ponto e vírgula e arquivos TIFF segmentados com objetos celulares detectados e gotículas lipídicas.São mostradas aqui células S.pombe do tipo selvagem que foram cultivadas no complexo meio YES ou no meio EMM definido. Em comparação com as células cultivadas no meio YES, foram detectadas menos gotículas lipídicas e maior intensidade de coloração por unidade de volume celular no meio EMM. Além disso, as gotículas lipídicas individuais formadas no meio EMM foram maiores e apresentaram maior intensidade total de coloração.Isso está de acordo com os achados anteriores do aumento do conteúdo lipídudo armazenado em células cultivadas em EMM. Em seguida, essas imagens mostram células S.japonicus de culturas exponenciais e estacionárias primitivas cultivadas em meio SIM. As células que entraram em fase estacionária mostraram um número significativamente reduzido de gotículas lipídicas por unidade de volume celular, enquanto a intensidade de fluorescência de gotículas lipídicas normalizada em volume diminuiu ligeiramente entre as duas condições.As gotículas lipídicas de fase estacionária inicial eram tipicamente moderadamente maiores em tamanho e tinham intensidade de fluorescência total moderadamente maior em comparação com gotículas de células em crescimento exponencial. Em S.cerevisiae as células cresceram para fase exponencial versus estacionária, as células estacionárias continham um pouco menos gotículas lipídicas por unidade de volume em comparação com células em crescimento exponencial. No entanto, sua intensidade de fluorescência de gotícula normalizada em volume quase dobrou.Este aumento acentuado no teor geral de gotículas lipídicas deveu-se à intensidade de fluorescência muito maior e ao volume de gotículas lipídicas individuais em fase estacionária. Após este procedimento, os dados de saída podem ser agregados em um pacote estatístico como R para criar parcelas de resultados resumidos e executar testes estatísticos sobre quaisquer diferenças observadas no conteúdo de gotículas lipídicas. Em princípio, o pipeline de processamento de imagens pode ser usado para análise de conteúdo de gotículas lipídicas em outros microrganismos ou para analisar outras estruturas subcelulares semelhantes a ponto.

analysis-lipid-droplet-content-fission-budding-yeasts-using-automated

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Descrevemos um novo método lipidomics quantitativos para identificação de espécies de lipídios numerosos em levedura utilizando pesquisa scan-espectrometria de massa de ionização electrospray (ESI / MS). Este método ultrapassa atualmente os métodos disponíveis para identificação e quantificação de lipídios na capacidade de resolver diversas formas moleculares de lipídeos, sensibilidade e velocidade.

A avaliação quantitativa do Lipidome fermento usando Electrospray Espectrometria de Massa de Ionização

Duas técnicas de isolamento de gotículas lipídicas celulares a partir de 1) células de levedura e 2) placentas humanas estão apresentadas. A peça central de ambos os processos é a centrifugação de gradiente de densidade, onde a camada flutuante resultante contendo as gotículas podem ser facilmente visualizadas por olho, extraiu-se, e quantificada por análise de Western Blot quanto à pureza.

Isolamento de celulares lipídicas Gotas: Duas técnicas de purificação Começando a partir de células de levedura e placentas humanas

Aqui, descrevemos um protocolo para obter o índice de gotículas lipídicas (índice de LD) para estudar a dinâmica de triglicérides nas células cultivadas em experimentos de alta produtividade. O ensaio de índice de LD é um método fácil e confiável que usa BODIPY 493/503. Este ensaio não precisa de extração de lipídios dispendious ou análise de microscopia.

Determinação de índice de lipídios pela recuperação de fluorescência líquido no patógeno fungo Ustilago Maydis

Este protocolo descreve a análise de compartimentos intracelular cDNAs etiquetados no fermento de brotamento usando a microscopia confocal 4D (Time-Lapse 3D) multi-color. Os parâmetros de imagem são escolhidos para capturar sinais adequados, limitando o Fotodano. Os plugins personalizados do ImageJ permitem que as estruturas rotuladas sejam rastreadas e analisadas quantitativamente.

4D microscopia de levedura

Aqui, nós apresentamos a imagem latente da viver-pilha que é um método não-tóxico da microscopia que permita investigadores de estudar o comportamento da proteína e a dinâmica nuclear em pilhas vivas do fermento da fissão durante o mitose e o meiosis.

Examinação da dinâmica nuclear do fermento mitotic e Meiotic da fissão pela microscopia viva-pilha da fluorescência

Apresentamos um protocolo utilizando cromatografia líquida juntamente com espectrometria de massa tandem para identificar e quantificar os principais lipídios celulares em Saccharomyces cerevisiae. O método descrito para uma avaliação quantitativa das principais classes lipídicas dentro de uma célula de levedura é versátil, robusto e sensível.

Análise Quantitativa do Lipidome Celular de Saccharomyces Cerevisiae Usando Cromatografia Líquida Juntamente com Espectrometria de Massa de Tandem

Neste artigo, demonstramos um protocolo otimizado baseado em fluorescência BODIPY 493/503 para caracterização de gotículas lipídicas em tecido hepático. Através do uso de projeções ortogonais e reconstruções 3D, o fluoróforo permite o sucesso da discriminação entre esteatose microvesicular e macrovesicular e pode representar uma abordagem complementar aos protocolos histológicos clássicos para avaliação da esteatose hepática.

Análise de Gotículas Lipídicas Coradas por Fluorescência com Reconstrução 3D para Avaliação da Esteatose Hepática

O presente estudo descreve metodologias baseadas na decelularização para visualizar e quantificar a deposição de tecido adiposo intramuscular (IMAT) através do volume muscular intacto, bem como quantificar métricas de adipócitos individuais que compõem o IMAT.

Quantificação da Infiltração Gordurosa do Músculo Esquelético Baseada na Decelularização

A levedura de fissão é usada aqui como um hospedeiro heterólogo para expressar proteínas bacterianas do citoesqueleto, como FtsZ e MreB, como proteínas de fusão translacional com GFP para visualizar sua polimerização. Além disso, os compostos que afetam a polimerização são identificados por imagens usando um microscópio de fluorescência.

Levedura de fissão como plataforma para triagens de drogas antibacterianas direcionadas a proteínas do citoesqueleto bacteriano

A lipofagia é uma forma seletiva de autofagia que envolve a degradação de gotículas lipídicas. Disfunções nesse processo estão associadas ao desenvolvimento do câncer. No entanto, os mecanismos precisos ainda não são totalmente compreendidos. Este protocolo descreve abordagens quantitativas de imagem para entender melhor a interação entre autofagia, metabolismo lipídico e progressão do câncer.

Explorando a regulação do catabolismo de gotículas lipídicas por meio da lipofagia

Este protocolo detalha dois métodos de parada do ciclo celular de levedura e liberação opcional, e elabora o uso de microscopia de fluorescência para estudar processos dependentes do ciclo celular em S. cerevisiae.

Manipulação e Análise de Processos Dependentes do Ciclo Celular em Leveduras de Brotamento

Aprenda a analisar gotas lipídicas em leveduras de fissão e brotamento usando microscopia de fluorescência e processamento automatizado de imagens. Este método padronizado permite quantificação imparcial e de alta vazão.

Análise de conteúdo de gotas lipídicas em leveduras de fissão e brotamento usando processamento automatizado de imagens

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