Name: Um luciferase-vírus da gripe do repórter fluorescente para A imagem latente viva e a quantificação da infecção viral (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-14T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 21 s
Description: Aprenda a usar o sistema BIRFLU de duplo repórter para rastrear infecções pelo vírus influenza A em camundongos. Este método permite análises simultâneas in vitro e in vivo com luciferase e fluorescência.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

A pesquisa sobre o vírus da gripe no laboratório de LM-S é parcialmente financiada pelo centro de excelência da gripe de Nova York (NYICE) (NIH 272201400005C), um membro dos centros de excelência do NIAID para o contrato de pesquisa e vigilância da gripe (CHERDEIROS) não. HHSN272201400005C (NYICE) e pelo departamento de defesa (DoD) peer revisado programa de pesquisa médica (PRMRP) conceder W81XWH-18-1-0460.

Os autores não têm nada a revelar.

Os investigadores confiaram em vírus de expressão de repórter recombinante como ferramentas moleculares vitais para compreender e expandir sobre a compreensão atual da replicação viral e da patogénese26,27,28, 29. º , 30 anos de , 31 de dezembro , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 54. os genes de repórter mais comumente favorecidos são luciferases e proteínas fluorescentes, principalmente devido aos avanços tecnológicos em sua identificação, desenvolvimento de variantes melhoradas e detecção por tecnologias de imagem43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48. os vírus do repórter recombinante são frequentemente utilizados para acelerar os ensaios virológicos, estudar a dinâmica dos vírus in vitro e in vivo, e testar a eficácia de vacinas e abordagens terapêuticas atualmente aprovadas ou novas26, 27,28,29,30,31,32,33,34,35, 36,37,38,39,40, 41,54. Infelizmente, no caso do IAV, estudos passados limitaram-se à expressão de um único gene repórter, o que dificulta o tipo de estudo que poderia ser conduzido 26,27,28,29 , 30 anos de , 31 de dezembro , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 54. para evitar esta limitação, nós geramos uma replicação-competente bi-repórter IAV que expressa uma luciferase nluc e uma proteína fluorescente Venus (birflu).
Neste relato, descrevemos a caracterização in vitro de BIRFLU e as abordagens experimentais para o uso de BIRFLU para rastrear a infecção viral in vivo usando um modelo de camundongo de infecção por IAV. A expressão de BIRFLU nluc e de Venus correlacionou com os Titers virais. Além disso, BIRFLU permaneceu estável e continuou a expressar ambos os genes de repórter após ser recuperado dos pulmões de camundongos infectados. Esta abordagem oferece aos pesquisadores uma excelente oportunidade para estudar IAV em células cultivadas e em modelos animais, incluindo a identificação e desenvolvimento de novas alternativas terapêuticas para o tratamento de infecções por IAV.
Embora o BIRFLU tenha sido gerado usando a espinha dorsal de PR8, outro IAV recombinante usando o tipo diferente, o subtipo ou os backbones virais da tensão poderiam ser gerados usando a mesma aproximação experimental. Da mesma forma, neste relato descrevemos os procedimentos experimentais para o uso de BIRFLU em um modelo de camundongo do IAV. No entanto, BIRFLU poderia ser uma tecnologia valiosa para avaliar a infecção por IAV em outros modelos animais.

O vírus da gripe A (IAV) é um vírus de RNA segmentado de sentido negativo, de forma única e envolto,da família Orthomyxoviridae 1,2,3. A Organização Mundial da saúde (OMS) estima 3-5 milhões de casos anuais de gripe e mais de 250.000 mortes por influenza no mundo4,5,6. Os grupos que são particularmente vulneráveis à gripe incluem os idosos, os indivíduos imunocomprometidos e as crianças7,8,9,10,11. Embora as vacinas estejam disponíveis e representem a intervenção mais comum e efetiva contra a infecção viral, o IAV é capaz de evoluir rapidamente e escapar da imunidade preexistente3,12,13 , 14 anos de , 15. a re-emergência de uma cepa pandêmica de H1N1 em 2009 e o surgimento de IAV patogénico reitera a constante ameaça à saúde pública humana no mundo4,16.
Durante uma epidemia ou pandemia, é crucial determinar rapidamente a patogenicidade e a transmissibilidade de vírus recém-isolados. As técnicas atualmente disponíveis para detectar o vírus são demoradas e, às vezes, requerem o uso de abordagens laboriosas, o que pode atrasar a realização dessas análises17,18,19,20. Além disso, os ensaios virais atuais são difíceis de escalar acima, que poderiam ser necessários durante o evento de um Outbreak. Finalmente, o uso de modelos animais validados de infecção, como camundongos, cobaias e furões são usados rotineiramente e são vitais no estudo de infecções da gripe, respostas imunes, e a eficácia de novas vacinas e/ou antivirais. No entanto, esses modelos são restritivos devido à incapacidade de observar a dinâmica viral em tempo real; Isto limita os estudos à imagem latente de estática de infecções virais21,22,23,24,25. Os animais utilizados nesses ensaios também são eutanasiados para determinar a carga viral, aumentando assim o número de animais necessários para a conclusão desses estudos26. Para contornar todas essas limitações, muitos pesquisadores dependem do uso de IAVs de replicação-competente, de expressão de repórter recombinante, capazes de acelerar os ensaios virológicos e detectar a carga viral e a disseminação in vivo em tempo real26 ,27,28,29,30,31,32,33,34,35 ,36,37,38,39,40,41. Importante, estes iAVS repórter-expressando são capazes de replicar similarmente ao selvagem-tipo (WT) iAVS na cultura de pilha e em modelos animais da infecção33,42.
As proteínas fluorescentes e bioluminescentes são dois sistemas de repórter comumente utilizados por pesquisadores devido à sua sensibilidade, estabilidade e facilidade de uso. Além disso, há um tremendo apoio e avanço nas tecnologias de detecção de proteínas fluorescentes e bioluminescentes43,44,45,46,47,48 . As proteínas fluorescentes e a luciferase têm propriedades diferentes que lhes permitem brilhar, diferindo especificamente em como os Estados excitados são gerados e como a emitância é detectada43,44,45, 46,47,48. As proteínas fluorescentes são excitadas primeiramente absorvendo a energia, que é liberada subseqüentemente como a luz em um comprimento de onda diferente enquanto as moléculas diminuem a um estado de energia mais baixo43. Por outro lado, a bioluminescência é derivada de uma reação química exotérmica que envolve um substrato, oxigênio e, às vezes, ATP, a fim de produzir luz45. Devido às propriedades de variação destes dois tipos de proteínas do repórter, um talvez mais vantajoso do que o outro dependendo do estudo do interesse. Quando as proteínas fluorescentes forem amplamente utilizadas observar a localização celular28,41, seus sinais in vivo têm a intensidade inadequada e são obscurecidos frequentemente pelo autofluorescence em tecidos vivos49. Portanto, os pesquisadores confiam nas luciferases para avaliar a dinâmica viral em organismos vivos, embora as proteínas fluorescentes possam ser preferidas para estudos ex vivo50,51,52,53. Ao contrário das proteínas fluorescentes, as luciferases são mais convenientes para estudos in vivo e mais aplicáveis em abordagens não invasivas26,27,28,29,30 , 31 de dezembro , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 54. em última análise, com base no tipo de estudo, os investigadores devem escolher entre o uso de uma proteína de repórter fluorescente ou uma luciferase como a sua leitura, que submete o seu estudo a um trade-off de funcionalidades e sensibilidades, e severamente restringe a utilidade dos vírus do repórter recombinante. Além disso, há preocupações quanto à correlação entre a expressão de diferentes genes de repórter utilizando sistemas de fluorescência ou luciferase e replicação ou disseminação viral, o que pode comprometer a interpretação dos dados obtidos com repórter-expressando IAVs.
Nós superamos esta limitação gerando uma replicação recombinante-bi-repórter competente IAV (BIRFLU) que codifica para uma proteína fluorescente e uma luciferase no mesmo genoma viral55 (Figura 1). Aqui, nanoluc luciferase (nluc), uma proteína bioluminescente pequena e brilhante48, foi inserida a montante da seqüência de hemaglutinina (ha) no segmento de ha viral da influenza a/Puerto Rico/08/1934 H1N1 (PR8)24,33, 40,55,56,57. Além disso, Vênus, uma proteína fluorescente monomérica freqüentemente utilizada, foi inserida no segmento viral não estrutural (ns)32,33,36,41,55. Desde que o birflu codifica para genes do repórter fluorescente e do luciferase, o sinal da proteína do repórter pode ser usado como o leitura para determinar a replicação viral e a disseminação in vitro ou in vivo55. Informações adicionais sobre a geração e in vitro ou in vivo caracterização de BIRFLU pode ser encontrada em nossa recente publicação55. BIRFLU pode ser usado para testar a eficácia de medicamentos antivirais ou neutralizando anticorpos através de um novo ensaio de microneutralização à base de fluorescência e bioluminescente55. Além disso, BIRFLU pode igualmente ser usado para avaliar a dinâmica viral em um modelo do rato da infecção55. Neste manuscrito, nós descrevemos os procedimentos para caracterizar BIRFLU55 in vitro e como estudar a infecção do birflu nos ratos usando sistemas in vivo da imagem latente da luminescência para a deteção de nluc in vivo ou de Venus ex vivo.
A combinação de técnicas de ponta na biologia molecular, na pesquisa animal e nas tecnologias da imagem latente, traz a investigadores a oportunidade original de usar BIRFLU para a pesquisa de IAV, incluindo o estudo de interações do vírus-anfitrião, dinâmica da infecção viral; o desenvolvimento de novas abordagens vacinais para o tratamento terapêutico de infecções por IAV ou o uso potencial de IAV como um vetor de vacina para o tratamento de outras infecções patogênicos.

<table><tbody><tr><td>Placa de Cultura de Células de 12 poços</td><td>Greiner Bio-one</td><td>665102</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Cultura de Células de 24 poços</td><td>Greiner Bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Cultura de Células de 6 poços</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Cultura de Células de 96 poços</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655-180</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop CS4</td><td>Adobe</td><td></td><td>Este software é usado em 3.1.10 e 4.4.7</td></tr><tr><td>Solução de Bovin Albumina (BA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7409</td><td>Loja em 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Bovin Albumina Sérica (BSA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td>Loja em 4 &deg; Placas</td></tr> de <tr><td>Cultura de Células C 100mm</td><td>Greiner Bio-one</td><td>664-160</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc MP Imaging System</td><td>BioRad</td><td></td><td>Este instrumento é usado em 4.4.7</td></tr><tr><td>Cristal Violeta</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C581-100</td><td>Armazene em temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Dounce Tissue Grinders</td><td>Thomas Scientific</td><td>7722-7</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águia modificada' s médio (DMEM)</td> <td>Corning Cellgro</td><td>15-013-CV</td><td>Loja em 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Fetal Soro Bovino (FBS)</td> <td>Seradigm</td><td>1500-050</td><td>Armazenar a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>5 a 7 semanas de idade camundongos BALB/c fêmeas</td><td>Instituto Nacional do Câncer (NCI)</td><td>555</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Baxter</td><td>1001936040</td><td>Armazenar em temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Espectro IVIS</td><td>PerkinElmer</td><td>124262</td><td>Este instrumento é usado para imagens in vivo (4.2 e 4.3)</td></tr><tr><td>IX81 Microscópio Invertido Motorizado</td><td>Olympus</td><td>Olympus IX81</td><td></td></tr><tr><td>Imagem Viva 4.7.2 software</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Este instrumento é usado para imagens in vivo (4.2 e 4.3)</td></tr><tr><td>Lumicount</td><td>Packard</td><td></td><td>Este instrumento é usado para quantificar a atividade da luciferase (3.2.6)</td></tr><tr><td>Células epiteliais do Rim Canino de Madin-Darby (MDCK)</td><td>ATCC</td><td>CCL-34</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Monoclonal anti-NP Vírus da Influenza A HB-65</td><td>ATCC</td><td>H16-L10-4R5</td><td>Armazenar a -20 &deg; Reagente Promega</td></tr><tr><td>N1110</td><td>do ensaio do Luciferase de C Nano-Glo</td><td></td><td>Este reagente é usado para medir a atividade do Nluc. Armazene a -20 > C</td></tr><tr><td>Formalina Tamponada Neutra 10%</td><td>EMD</td><td>65346-85</td><td>Armazenar na RT</td></tr><tr><td>Nunc MicroWell MicroPlacas de 96 Poços</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>269620</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina (PS) 100x</td><td>Corning</td><td>30-00-CI</td><td>Armazenar a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina/L-Glutamina (PSG) 100x</td><td>Corning</td><td>30-009-CI</td><td>Loja a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Retiga 20000R Fast1394 Câmera</td><td>Qimaging</td><td>Retiga 2000R</td><td></td></tr><tr><td>Scanner</td><td>HP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Texas Anticorpos secundários anti-rato conjugado com vermelho -coelho</td><td>Jackson</td><td>715-075-150</td><td>Armazene a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Tripsina tratada com tosilsulfonil fenilalanil clorometilcetona (TPCK)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8802</td><td>Armazenar a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>J.T.Baker</td><td>X198-07</td><td>Loja na RT</td></tr><tr><td>Vmax Leitor de placas cinéticas</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

um luciferase-vírus da gripe do repórter fluorescente para a imagem latente viva e a quantificação da infecção viral

A Luciferase-fluorescent Reporter Influenza Virus for Live Imaging and Quantification of Viral Infection

Vírus da gripe A (IAVs) causam doença respiratória humana que está associada a consequências económicas e de saúde significativas. Tal como com outros vírus, estudar IAV requer o uso de abordagens secundárias trabalhosas para detectar a presença do vírus em células infectadas e/ou em modelos animais de infecção. Essa limitação foi recentemente contornada com a geração de IAVs recombinantes expressando proteínas de repórter fluorescentes ou bioluminescentes (luciferase) facilmente rastreáveis. No entanto, os pesquisadores foram forçados a selecionar genes de repórter fluorescentes ou luciferases devido à capacidade restrita do genoma do IAV para incluir sequências estrangeiras. Para superar esta limitação, nós geramos uma replicação recombinante-o bi-repórter competente IAV (BIRFLU) que expressa estàvel um gene fluorescente e de um luciferase do repórter para controlar facilmente infecções de IAV in vitro e in vivo. Para tanto, os segmentos virais não estruturais (NS) e hemaglutinina (HA) viral da influenza A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8) foram modificados para codificar a Vênus fluorescente e as proteínas bioluminescentes da luciferase Nanoluc, respectivamente. Aqui, nós descrevemos o uso de BIRFLU em um modelo do rato da infecção de IAV e a deteção de ambos os genes do repórter usando um sistema in vivo da imagem latente. Notavelmente, observamos uma boa correlação entre as expressões de ambos os repórteres e a replicação viral. A combinação de técnicas de ponta em biologia molecular, pesquisa animal e tecnologias de imagem, fornece aos pesquisadores a oportunidade única de usar esta ferramenta para pesquisa de gripe, incluindo o estudo de interações vírus-hospedeiro e dinâmica de infecções virais. É importante ressaltar que a viabilidade de alterar geneticamente o genoma viral para expressar dois genes estrangeiros de diferentes segmentos virais abre oportunidades para usar essa abordagem para: (i) o desenvolvimento de novas vacinas IAV, (II) a geração de IAVs recombinantes que pode ser usado como vetores de vacinas para o tratamento de outras infecções do patógeno humano.

Geração e caracterização de BIRFLU in vitro (Figura 1 e Figura 2)
Uma IAV de replicação recombinante-competente expressando dois genes de repórter diferentes (BIRFLU) foi construída utilizando técnicas de biologia molecular de estado da arte e de genética reversa baseada em plasmídeo (Figura 1). Aqui, optou-se por usar nluc devido a várias vantagens sobre outras luciferases, incluindo seu tamanho pequeno, ATP-independência, maior intensidade e substrato otimizado48,60. Nluc foi clonado no segmento de HA do IAV PR8 seguido pelo site de clivagem (2A) do teschovirus porcino (PTV) 2A na frente do quadro de leitura aberto (ORF) de HA (Figura 1). O ORF do HA incluiu mutações silenciosas para remover os sinais originais da embalagem e para evitar todo o recombination possível. O sinal de empacotamento completo de HA foi adicionado na frente de nluc para permitir a incorporação apropriada do segmento modificado do HA no virion e na expressão de nluc e de HA do mesmo segmento viral do RNA (Figura 1). Além, a proteína fluorescente Venus foi clonada em um segmento modificado de IAV PR8 ns que codifica as duas proteínas virais ns1 e NEP de um único Transcript32,36,41,54, 57. Para esse fim, Vênus foi fundido para o C-terminal de NS1 e todo o NEP ORF foi clonado a jusante do site de clivagem PTV 2A que foi colocado entre as seqüências NS1-Venus e NEP (Figura 1). Em última análise, essas duas construções de plasmídeo viral de HA e NS modificadas foram utilizadas em combinação com o restante dos plasmínios de genética reversa do IAV PR8 para gerar BIRFLU (Figura 1). A caracterização in vitro e in vivo de BIRFLU tem sido descrita anteriormente55.
Na Figura 2, caracterizou-se in vitro birflu determinando os níveis de expressão de Vênus, NLUC e NP usando abordagens de fluorescência e imunofluorescência indireta (Figura 2a, B). Monocamadas confluentes de células MDCK foram simulados ou infectados (moi 0,1) com vírus WT ou birflu PR8 e, em 18 h pós-infecção, a expressão de Vênus foi diretamente avaliada por microscopia de fluorescência (Figura 2a, B). A expressão de nluc (Figura 2a) e NP (Figura 2b) foi visualizada por imunofluorescência indireta com anticorpos específicos para cada proteína. Como previsto, Vênus e expressão de nluc foram detectados apenas em células infectadas por BIRFLU e não em células infectadas pelo vírus WT PR8. Além, a microscopia indireta da imunofluorescência revelou a expressão do NP nas pilhas de WT e de BIRFLU PR8-infectadas. Nenhuma expressão de Vênus, nluc ou NP foi detectada, como esperado, em células infectadas (Figura A, B).
Para avaliar os níveis de expressão de nluc in vitro, as células de MDCK foram infectadas (MOI 0, 1) com vírus WT ou BIRFLU PR8 e a atividade de nluc em sobrenadantes de cultura tecidual foi avaliada em 24, 48, 72 e 96 h pós-infecção (Figura 2C). Somente a atividade de nluc foi detectada em sobrenadantes de cultura tecidual de células MDCK infectadas com BIRFLU (Figura 2C). A atividade de nluc nos sobrenadantes da cultura do tecido foi detectada tão cedo quanto 24 h borne-infecção com níveis mais elevados da expressão em 96 h borne-infecção, o mais provavelmente porque o efeito citopático (CPE) induzido durante a liberação da infecção viral a proteína de nluc retida na célula. Para avaliar a aptidão de BIRFLU em células cultivadas, a cinética de crescimento dos vírus WT e BIRFLU PR8 também foi avaliada (Figura 2D) e a presença de vírus infeccioso em sobrenadantes de cultura tecidual foi determinada pelo ensaio imunofoco (Figura 2D ). Notavelmente, a cinética de replicação do BIRFLU foi comparável à do vírus WT PR8, embora a replicação do BIRFLU tenha sido ligeiramente atrasada e não atinja os mesmos títulos virais que o WT PR8. No entanto, BIRFLU foi capaz de atingir títulos de 5 x 107 pfu/ml (Figura 2D), indicando que a expressão de dois genes de repórter no genoma viral não interfere significativamente com a replicação BIRFLU em células MDCK.
Rastreamento da infecção por BIRFLU em camundongos (Figura 3 e Figura 4)
A Figura 3 é um fluxograma esquemático para a avaliação da dinâmica de birflu em um modelo do rato da infecção de IAV. Os ratos BALB/C fêmeas de cinco-à-sete-semana-velhos eram ou mock-Infected com 1X PBS ou infected com 1 x 106 Pfu de birflu intranasally. Aos 3 dias após a infecção, os camundongos foram anestesiados com isoflurano e então injetados com substrato de nluc retrô-orbitalmente. Todos os camundongos foram imediatamente colocados no instrumento IVIS e o sinal de nluc foi avaliado in vivo utilizando o IVIS. Em seguida, os camundongos foram eutanasiados e os pulmões foram colhidos. Os pulmões extirpado foram então analisados ex vivo usando o Imager in vivo para determinar a intensidade da fluorescência através da expressão de Venus. Por fim, os pulmões dos camundongos foram homogeneizados, e os títulos virais e a estabilidade foram determinados pelo ensaio da placa. As chapas foram avaliadas pela fluorescência direta de Vênus, por imunocoloração usando anticorpos específicos para nluc e por coloração violeta cristalina.
Descrito previamente replicação-competente repórter-expressando IAVs expresse um único gene do repórter, o mais freqüentemente um fluorescente ou uma proteína bioluminescente, como o substituto para a infecção viral e a replicação. No entanto, BIRFLU, é capaz de expressar os dois tipos de genes repórter sobre a infecção viral. Para avaliar a correlação entre a bioluminescência (in vivo Imaging) e a fluorescência (ex vivo Imaging) após a infecção por BIRFLU, camundongos BALB/c fêmeas de cinco a sete semanas de idade foram simulados com 1X PBS ou inoculado com BIRFLU (106 Pfu) intranasalmente . A atividade de nluc (figura 4a) foi avaliada pela administração do substrato de nluc injetado retroorbitalmente aos 3 dias após a infecção por meio de um instrumento de imagem in vivo. Optou-se por avaliar a bioluminescência no 3º dia, pois estudos prévios indicaram que a replicação do IAV, incluindo PR8, picos entre os dias 2 e 4 pós-infecção24,54. A bioluminescência foi monitorada (figura 4a, Top) e utilizada para calcular o fluxo total médio (Flux (log10 p/s) (figura 4a, fundo). Como previsto, camundongos inoculados com BIRFLU exibiu alta atividade de bioluminescência, mas nenhum sinal foi detectado em camundongos infectados por mock. Posteriormente, os pulmões de camundongos infectados foram colhidos e a expressão de Vênus foi avaliada por meio de imagem ex vivo (Figura 4B, Top). Além disso, calculou-se a eficiência radiante média de fluorescência (Figura 4B, fundo). Os pulmões extirpado dos ratos foram homogeneizados igualmente para determinar os títulos virais e a estabilidade genética de birflu in vivo (Figura 4C, D). A estabilidade genética de BIRFLU foi analisada através do ensaio de placas utilizando os vírus isolados dos pulmões dos camundongos e da microscopia fluorescente (Venus, Top), imunocoloração (nluc, médio) e coloração violeta cristalina (fundo). BIRFLU recuperado dos pulmões dos ratos foi capaz de formar chapas e expressa de forma estável ambos os genes de repórter (Figura 4C). Observou-se, notavelmente, uma boa correlação entre a bioluminescência e os sinais de fluorescência com a replicação viral.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59890/59890fig1.jpg"> Figura 1: representação esquemática dos segmentos de estrutura e genoma do IAV PR8 WT e BIRFLU virion. IAV são cercados por uma bicamada lipídica contendo as duas principais glicoproteínas virais hemaglutinina (HA; preto) e neuraminidase (NA; azul). IAV contem oito único-encalhado, negativo-sentido, segmentos do RNA (PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M, e NS). Cada segmento viral contém regiões não codificantes (NCR) nas extremidades 3 ' e 5 ' (caixas pretas). Também, na extremidade 3 ' e 5 ' do viral (v) RNAs são os sinais de empacotamento, responsáveis para o encapsidation eficiente de vRNAs em virions nascente (caixas brancas). Os segmentos e produtos virais IAV PR8 HA e NS são indicados em preto. Sequências de nluc, Venus e PTV 2A são indicadas em caixas vermelhas, verdes e listradas, respectivamente. A representação esquemática dos segmentos de HA e NS modificados expressando nluc e Venus, respectivamente, em BIRFLU também são indicados. Este número foi adaptado de Nogales et al.55. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59890/59890fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59890/59890fig2.jpg"> Figura 2: caracterização in vitro de BIRFLU. (A, B) Análise da expressão protéica por fluorescência direta e imunofluorescência. As pilhas de MDCK eram mock-Infected ou infected (MOI 0,1) com PR8 WT ou vírus de BIRFLU. As pilhas contaminadas foram fixadas em 18 h borne-infecção para visualizar diretamente a expressão de Venus pela microscopia fluorescente direta e para visualizar a expressão de nluc (a) e de NP viral (B) usando anticorpos específicos e a imunofluorescência indireta. Os núcleos foram manchados com DAPI. Imagens representativas (ampliação de 20x) são mostradas. Barras de escala = 100 μm. (C, D) Cinética de crescimento de PR8 WT e BIRFLU. A atividade de nluc (C) e os títulos virais (D) em sobrenadantes de cultura tecidual de células de MDCK infectadas (moi 0, 1) com WT e birflu PR8 foram avaliados nos tempos indicados após a infecção. Os dados representam as médias ± DP dos triplicados. Os títulos virais foram determinados pelo ensaio do imune-foco (FFU/ml). A linha pontilhada denota o limite de detecção (200 FFU/ml). Este número foi adaptado de Nogales et al.55. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59890/59890fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59890/59890fig3.jpg"> Figura 3: representação esquemática para o estudo de BIRFLU em camundongos. A expressão dos genes do repórter de nluc e de Venus foi avaliada nos ratos contaminados com 1 x 106 Pfu de birflu usando a imagem latente in vivo ou ex vivo. Resumidamente, no dia 1, 5 a 7 ratos BALB/c fêmeas de uma semana de idade foram mock-infectados (1X PBS) ou inoculados com 1 x 106 Pfu de birflu intranasalmente. No dia 3 borne-infecção, os ratos foram anestesiados levemente usando o isoflurano e a carcaça de nluc foi injetada retro-Orbitally. O sinal de nluc foi avaliado diretamente usando a imagem latente in vivo. Imediatamente depois da imagem latente, os ratos foram eutanasiados e a expressão de Venus em pulmões extirpado inteiros foi analisada usando a imagem latente ex vivo. Os pulmões de camundongos recuperados foram homogeneizados para avaliar a replicação viral e a estabilidade por ensaio de placa. As setas indicam correlação entre fluorescência (Vênus), imunocoloração (nluc) e coloração violeta cristalina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59890/59890fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59890/59890fig4.jpg"> Figura 4: bioluminescência in vivo e expressão de fluorescência. Fêmeas de cinco a sete semanas de idade BALB/c camundongos foram mock-infectados (1X PBS) ou inoculados com 1 x 106 Pfu de birflu intranasally. No dia 3 borne-infecção, a atividade de nluc (a) no rato inteiro foi determinada. Imagens representativas de um único rato que mostra a escala do Radiance (p/sec/cm2/Sr). Os valores de radiância da bioluminescência foram quantificados e o fluxo total médio é mostrado (Flux (log10 p/s). Após a imagem latente de nluc, os pulmões foram colhidos para a imagem latente ex vivo (B). Imagens representativas de pulmões inteiros são mostradas. Para quantificar a expressão de Venus, os valores médios das regiões de interesse (ROIs) foram normalizados à auto-fluorescência do pulmão dos ratos mock-Infected e as mudanças da dobra foram calculadas. Para analisar a estabilidade genética do BIRFLU in vivo, os vírus recuperados dos pulmões de camundongos foram analisados por meio de microscopia fluorescente (Venus, Top), imunocoloração (nluc, meio) e coloração violeta cristalina (fundo) (C). Imagens representativas de um rato são mostradas. Para avaliar a replicação do vírus, os pulmões inteiros foram homogeneizados após a imagem e utilizados para infectar células MDCK e determinar títulos virais por ensaio de placa (PFU/mL) (D). As setas indicam correlação entre fluorescência (Vênus), imunocoloração (nluc) e coloração violeta cristalina. As barras representam a média ± DP dos títulos de vírus pulmonares. Este número foi adaptado de Logales et al.55. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59890/59890fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Meios e soluções da cultura do tecido</td>
			<td>Composição</td>
			<td>Armazenamento</td>
			<td>Usar</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Meios da cultura do tecido: O meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM), soro bovino fetal a 10% (FBS), 1% penicilina-estreptomicina-L-glutamina (PSG) (DMEM 10% FBS 1% PSG).</td>
			<td>445 ml DMEM, 50 mL de FBS e 5 mL de 100x PSG.</td>
			<td>4 ° c</td>
			<td>Manutenção de células MDCK</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Mídia pós-infecção: dmem 0,3% Albumina bovina (BA), 1% PSG (DMEM 0,3% ba 1% PSG).</td>
			<td>491 ml DMEM, 4,2 ml de 35% BA e 5 ml de 100x PSG</td>
			<td>4 ° c</td>
			<td>Manutenção de células MDCK após infecção viral</td>
		</tr>
<tr>
<td>soro fisiológico tamponado de fosfato 10x (PBS)</td>
			<td>80 g de NaCl, 2 g de KCl, 11,5 g de na2HPO4. 7h2O, 2 g de KH2po4. Adicionar ddH2O até 1 L. Ajuste o pH para 7,3</td>
			<td>Temperatura ambiente</td>
			<td>Para preparar 1X PBS</td>
		</tr>
<tr>
<td>1X PBS</td>
			<td>Diluir 10x PBS com ddH2O</td>
			<td>Temperatura ambiente</td>
			<td>Células de lavagem</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Meios de infecção: 1x pbs, 0,3% BA, 1% penicilina-ESTREPTOMICINA (PS) (PBS/BA/PS).</td>
			<td>487 mL 1X PBS estéril, 4,2 mL de 35% BA e 5 ml de 100x 1% PS (100 U/mL)</td>
			<td>4 ° c</td>
			<td>Infecções virais</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Solução de fixação/permeabilização: formaldeído a 4%, 0,5% Triton X-100 diluído em 1X PBS.</td>
			<td>400 mL de formalina tamponada neutra 10%, 5 ml de Triton X-100 e 595 mL de 1X PBS</td>
			<td>Temperatura ambiente</td>
			<td>Correção e permeabilização de células MDCK.</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Solução de bloqueio: 2,5% albumina sérica bovina (BSA) em 1X PBS.</td>
			<td>2,5 g de BSA em 97,5 mL de 1X PBS</td>
			<td>4 ° c</td>
			<td>Solução de bloqueio para ensaios de imunofluorescência e placa.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Solução de diluição de anticorpos (1% BSA em 1X PBS)</td>
			<td>1 g de BSA em 99 mL de 1X PBS</td>
			<td>4 ° c</td>
			<td>Diluição de anticorpos primários e secundários.</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,1% cristal violeta solução</td>
			<td>1 g de violeta de cristal em 400 mL de metanol. Adicionar 600 ml de ddH2O</td>
			<td>Temperatura ambiente</td>
			<td>Coloração de células MDCK em ensaios de placas.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tosylsulfonyl fenilalanil clorometil cetone (TPCK)-tripsina Tratado</td>
			<td>Prepare uma solução de 1, 000x stock em 1 mg/mL em ddH2O</td>
			<td>-20 ° c</td>
			<td>Para infecções virais.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: meios e soluções de cultura de tecidos.

Os vírus da influenza A (IAVs) são patógenos respiratórios contagiosos que causam epidemias anuais e pandemias ocasionais. Aqui, nós descrevemos um protocolo para rastrear infecções virais in vivo usando uma novela recombinante luciferase e fluorescência-expressando o bi-repórter IAV (BIRFLU). Esta abordagem fornece aos pesquisadores uma excelente ferramenta para estudar IAV in vivo.

Um luciferase-vírus da gripe do repórter fluorescente para A imagem latente viva e a quantificação da infecção viral

Influenza A viruses (IAVs) cause human respiratory disease that is associated with significant health and economic consequences. As with other viruses, ...

Pesquisadores já geraram vírus recombinantes de influenza que expressam repórteres de proteína fluorescente ou bioluminescente. Parte de nossa única expressão de genes repórteres no vírus da gripe limita severamente seu uso em experimentos. Nosso protocolo descreve o uso do vírus da gripe bireporter que expressa genes de repórteres fluoresentes e bioluminescentes, e, portanto, supera sua limitação.A principal vantagem dessa técnica é o uso de um único vírus recombinante da gripe para estudos in vitro e in vivo. Ao realizar essa técnica, a injeção rápida de substrato de luciferase e o planejamento adequado do manuseio de camundongos é importante, pois o substrato é rapidamente metabolizado. Além disso, a barba de camundongos é recomendada para melhorar a detecção de sinal bioluminescente.Para infectar os ratos, comece preparando o BIRFLU em 1X PBS. Mantenha o vírus no gelo até a inoculação. Verifique se há ausência do reflexo do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo para ter certeza de que o mouse está anestesiado, e inocula-o intranasalmente com a diluição BIRFLU preparada.Certifique-se de que todos os ratos estão respirando corretamente antes de devolvê-los para suas gaiolas. Abra o software de imagem e pressione Initialize e, em seguida, defina os parâmetros que serão usados para a imagem. Para monitorar os camundongos infectados com BIRFLU, raspe o peito para melhorar a detecção do sinal bioluminescente.Uma vez que os camundongos são anestesiados, use uma agulha de calibre 22 para administrar retro-orbitalmente 100 microliters de niuc luciferase substrato, diluído de um a 10 em PBS. Imediatamente após a injeção, coloque os animais na câmara de isolamento com o peito virado para cima. Em seguida, coloque a câmara de isolamento no instrumento de imagem, feche a porta e adquira imagens.Após a imagem, devolva os ratos para suas gaiolas e monitore-os até que eles se recuperem completamente. Use a ferramenta ROI de software de imagem para analisar os dados de bioluminescência adquiridos, designando uma região de interesse e clicando na medida. Para realizar imagens ex vivo de pulmões de camundongos, colete os pulmões de acordo com as instruções do manuscrito, inicie o software de aquisição de imagens e defina os parâmetros para a imagem.Uma vez que a máquina é inicializada, coloque os pulmões em uma bandeja de fundo preto, e certifique-se de que os tecidos estão separados um do outro. Introduza a bandeja no imager, feche a porta e adquira imagens. Após a imagem, remova os tecidos imediatamente e armazene-os no gelo a quatro graus Celsius se as amostras forem processadas no mesmo dia.Se eles serão processados mais tarde, congele-os rapidamente em um tubo em gelo seco, e armazene-os a 80 graus Celsius. Para processar as imagens, selecione a ferramenta ROI, desenhe regiões de interesse em torno de cada um dos pulmões individuais e clique em medida. Birflu tem sido caracterizado in vitro pela determinação dos níveis de expressão de Vênus, Nluc e NP em células infectadas.A expressão de Vênus e Niuc só é detectada em células infectadas pelo BIRFLU, enquanto o NP é expresso em células infectadas por PR8 e BIRFLU. Nenhuma expressão é observada em células infectadas por simulação. Além disso, a atividade de Niuc foi medida em supernantes da cultura tecidual aos 24, 48, 72 e 96 horas pós-infecção.É detectado já em 24 horas após a infecção, e os níveis de expressão aumentam em 96 horas. Também pode ser demonstrado que a cinética de replicação do BIRFLU é comparável ao vírus PR8 do tipo selvagem. Birflu tem a capacidade de expressar genes de repórteres fluorescentes e bioluminescentes, e a correlação entre os dois pode ser avaliada usando imagens in vivo e ex vivo de um pulmão de camundongo.Os pulmões de camundongos infectados com BIRFLU apresentaram alta bioluminescência in vivo e fluorescência ex vivo. Também foram determinadas virais e estabilidade genética do BIRFLU in vivo. Ensaios de placa sobre os vírus de pulmões de camundongos mostraram que o vírus pode formar placas e expressar ambos os genes dos repórteres.O BIRFLU também poderia ser usado para avaliar a eficácia dos anticorpos antivirais e neutralizantes contra a gripe. A saída desses ensaios estava correlacionada entre si e são rápidas e fáceis de fazer.

a-luciferase-fluorescent-reporter-influenza-virus-for-live-imaging

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Métodos de imagem de bioluminescência de infecções bacterianas em animais vivos são descritos. Patógenos são modificados para expressar luciferase permitindo que imagens de corpo inteiro óptico de infecções em animais vivos. Modelos animais podem ser infectados com patógenos luciferase expressar eo curso resultante de doença visualizadas em tempo real pela imagem de bioluminescência.

Usando a luciferase Infecções bacterianas Imagem em camundongos

Este método descreve o uso de sistema de imagem de Infravermelhos corante baseada em para a detecção de A H1N1 no bronchioalveolar o lavado de fluido (BAL) de camundongos infectados em uma alta sensibilidade. Esta metodologia pode ser realizado em um 96 - ou 384-bem prato, requer &lt;volume de 10 uL de material de teste e tem o potencial para a triagem concomitante de agentes patogénicos múltiplos.

Alta capacidade método de detecção de vírus Influenza

Utilizando luciferase e sistemas de imagem in vivo (IVIS) como um novo meio de identificar objectivos de doença antes de desenvolvimentos clínicos ocorrer. IVIS nos permitiu visualizar em tempo real a invasão de vírus encefalíticas durante vários dias, fornecendo um modelo de doença mais precisa para o estudo futuro. Também permitiu-nos identificar as características potenciais de proteção de antivirais e de vacinas mais rápido do que os modelos animais atualmente utilizados. A capacidade de...

In Vivo Imaging Systems Detecção (IVIS) de um vírus de Neuro-invasiva encefalítico

Source: Chang, X., et al. Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates a luciferase-based assay to quantify pseudovirus infection in epithelial cells. The pseudovirus encodes the luciferase gene, which is expressed in infected cells. After washing, and cells are incubated with lysis buffer at an ultra-low temperature, and then thawed to induce lysis.

Assessing Pseudovirus Infection Using Luciferase Reporter Assay

O vídeo demonstra o ensaio de luciferase usado para quantificar proteínas marcadas com luciferase. O ensaio usa uma enzima luciferase projetada composta por um grande fragmento que se liga ao pequeno fragmento, que é conjugado com uma proteína de interesse. As subunidades ligadas formam uma enzima ativa que, na presença do substrato, libera um sinal luminescente. Este sinal é então quantificado usando um luminômetro.

O ensaio de luciferase: um ensaio de alto rendimento para medir sinais luminescentes usando biorepórteres baseados em sistema de nanoluciferase projetados

Este vídeo demonstra um método para rastrear infecções virais em modelos de camundongos usando um vírus Influenza A bi-repórter recombinante com luciferase e proteína de fluorescência. Este método permite estudos in vivo e ex vivo, permitindo que os pesquisadores obtenham insights sobre a dinâmica viral e os efeitos das intervenções.

Um vírus da gripe repórter fluorescente luciferase para rastrear infecções virais

Este vídeo demonstra um ensaio para estudar a regulação da tradução em células infectadas por poxvírus. Células não infectadas e infectadas por vírus foram co-transfectadas com mRNAs que codificam para luciferase de vaga-lume (Fluc) e luciferase de Renilla (Rluc), com o mRNA de Fluc contendo uma sequência líder de 5 'Poly (A). Ao adicionar substratos bioluminescentes em células lisadas, medir o sinal de ambas as luciferases para identificar a vantagem translacional do mRNA Fluc em células...

Um ensaio repórter de luciferase para estudar a regulação da tradução em células infectadas por poxvírus

Descreve-se a utilização de um vírus vaccinia repórter fluorescente que permite a medição em tempo real da infectividade viral e a expressão do gene através da expressão específica da fase de fluoróforos espectralmente distintos repórter. Detalhamos um método baseado em placa para identificar com precisão a fase em que a replicação do vírus é afetada em resposta a pequena inibição molécula.

Repórter Vaccinia vírus para quantificar Função Viral em todas as fases da Expressão Gênica

Este artigo apresenta um método baseado na expressão de luciferase de alto rendimento para titular vários vírus de RNA e DNA usando manipuladores de líquidos automatizados e manuais.

De alta capacidade de Titulação de luciferase expressando recombinantes Vírus

Apresenta-se aqui um protocolo para uma abordagem de imagem de fluorescência, multiplex immunofluorescente cell-based detection of DNA, RNA and protein (MICDDRP), um método capaz de visualização simultânea de fluorescência unicelular de proteínas virais e ácidos nucleicos de diferentes tipos e filamentos. Essa abordagem pode ser aplicada a uma gama diversificada de sistemas.

Imagem de fluorescência multiplexada de célula única para visualizar ácidos nucleicos virais e proteínas e monitorar HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virus e Influenza Infection

Este protocolo descreve a dinâmica das infecções virais usando recombinação expressante (r)SARS-CoV-2 e um sistema de imagem in vivo (IVIS) em camundongos transgênicos K18 hACE2 para superar a necessidade de abordagens secundárias necessárias para estudar infecções sars-cov-2 in vivo.

Imagem ao vivo e quantificação da infecção viral em K18 hACE2 Camundongos transgênicos usando o recombinante SARS-CoV-2

Aprenda a usar o sistema BIRFLU de duplo repórter para rastrear infecções pelo vírus influenza A em camundongos. Este método permite análises simultâneas in vitro e in vivo com luciferase e fluorescência.

Um luciferase-vírus da gripe do repórter fluorescente para A imagem latente viva e a quantificação da infecção viral

Explorar mais vídeos