Detecção de fusão gênica oncogênica usando a reação em cadeia de polimerase multiplex ancorada seguida por sequenciamento da próxima geração

Este protocolo é usado para a detecção de fusões genéticas criticamente informativas para amostras de tumores de pacientes. O estado de fusão de dezenas de genes é avaliado simultaneamente em um único ensaio. A vantagem desta técnica é que eu posso identificar fusões genéticas independentemente da identidade do parceiro de fusão a partir de amostras de tumores que foram processadas por fixação formulativa.

A detecção de certa fusão genética na amostra de tumores clínicos informa diretamente o diagnóstico, prognóstico e seleção de tratamento em muitos tipos de câncer. É fundamental entender que muitas fusões chamadas pelo algoritmo de análise são artefatos. A tarefa mais difícil ao analisar dados é distinguir entre artefato e chamadas de fusão reais.

Comece diluindo o ácido nucleico total para alcançar a concentração desejada do RNA. Para cada amostra, transfira 20 microlitadores da diluição para os tubos de tira de reagente de escoramento aleatório em um bloco de alumínio pré-refrigerado e misture por tubulação para cima e para baixo seis a oito vezes. Gire brevemente as amostras, transfira todo o volume para uma placa PCR de 96 poços e selado com filme de selador de placa.

Insira a placa em um termociclador, cubra com a almofada de compressão e feche a tampa. Incubar a 65 graus Celsius por cinco minutos. Após a incubação, transfira todo o volume do produto de escoramento aleatório nos primeiros tubos de tira de reagente de fios.

Misture por pipetting para cima e para baixo e gire brevemente para baixo. Transfira todo o volume para uma placa PCR de 96 poços e selo com filme RT. Insira a placa no termociclador e execute a reação de acordo com as instruções do manuscrito.

Realize a síntese de cDNA de segunda cadeia, e repare, e passo de ligadura, de acordo com as instruções do manuscrito e prossiga para a segunda etapa de ligadura. Para numerar o código de barras molecular ou tubos de tira adaptador MBC, posicione os tubos horizontalmente com dobradiças na parte de trás e use um marcador permanente. Pegue a placa de purificação de contas desde a primeira etapa de ligadura e transfira 40 microliters de cada amostra para os tubos de tira adaptador MBC, tomando cuidado para não perturbar a pelota de contas.

Misture os reagentes por pipetação, gire os tubos e transfira todo o volume para a etapa de ligadura dois tubos de tira de reagente. Misture as amostras, gire-as para baixo e coloque em um bloco termociclador. Deixe a tampa aquecida fora e execute o termociclador a 22 graus Celsius por cinco minutos, seguido por 4 graus Celsius.

Em seguida, prepare as contas de limpeza de ligaduras vórtices e adicionando 50 microliters a um novo conjunto de tubos de tira PCR. Incubar no ímã por um minuto e descartar o supernasce. Remova os tubos de tira do ímã e resuspenque as contas em 50 microliters de tampão de limpeza de ligaduras, pipetando para cima e para baixo.

Transfira todo o volume amostral da segunda etapa de ligadura para a tira de conta de limpeza de ligaduras. Vórtice as amostras para misturar e deixá-las em temperatura ambiente por 10 minutos. Vórtice a amostra uma vez no meio da incubação.

Depois, o vórtice das amostras, gire-as para baixo, e incubar no ímã por um minuto. Descarte o supernatante e adicione 200 microliters de tampão de limpeza de ligadura fresca. Vórtice para resuspend, girar para baixo, e colocar no ímã por um minuto.

Após as duas lavagens, realize uma terceira lavagem usando água ultrapurada em vez de tampão. Resuspenque as contas em 20 microlitres de hidróxido de sódio de 5 milímetros e transfira as amostras para uma placa PCR de 96 poços. Coloque a placa em um termociclador com uma almofada de compressão e execute-a a 75 graus Celsius por 10 minutos, seguida por um porão de 4 graus Celsius.

Uma vez que as amostras tenham esfriado a 4 graus Celsius, coloque a placa em um ímã por pelo menos três minutos e prossiga com o primeiro PCR. Prepare as reações do PCR adicionando dois microlitros de primers GSP1 a cada poço da primeira tira de reagente PCR. Transfira 18 microliters do segundo produto de limpeza de ligaduras para os primeiros tubos de tira de reagente PCR e misture por tubulação para cima e para baixo.

Gire as amostras e transfira-as para uma placa PCR de 96 poços. Coloque-os no termociclador e execute PCR de acordo com as instruções do manuscrito. Proceda com a purificação de contas adicionando 20 microliters do produto PCR a uma placa de fundo U preenchida com 24 microliters de contas de purificação por poço.

Pipeta para cima e para baixo para misturar e deixar a placa em temperatura ambiente por cinco minutos, em seguida, incubar a placa no ímã por dois minutos. Descarte o supernante das contas e lave-os duas vezes com 200 microliters de 70% de etanol. Após a lavagem final, retire todo o etanol e deixe a amostra secar por dois minutos.

Remova a placa do ímã e resuspenja as contas em 24 microliters de Tris-HCl de 10 milímetros e pH 8.0. Incubar o ímã por três minutos e, em seguida, colocar a placa de volta no ímã por dois minutos. Inicie a quantitação da biblioteca preparando de uma a cinco diluições do segundo produto PCR em Tris-HCl de 10 milímetros.

Siga isso por uma diluição serial de 1:199, 1:199 e 20:80 em Tris-HCl de 10 milímetros com polisorbato de 05%. Configure a chave PCR adicionando seis microliters de mix mestre a cada poço de uma placa óptica de 96 poços, seguido por quatro microliters da diluição ou padrão apropriado. Gire a placa e coloque-a no instrumento qPCR.

Realizar qPCR de acordo com as instruções do manuscrito. Após a quantificação da biblioteca ser concluída, dilua todas as bibliotecas para dois nanomolares com Tris-HCl de 10 milímetros. Faça uma piscina de biblioteca combinando 10 microliters de cada biblioteca normalizada em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.

Em seguida, prepare a biblioteca desnaturada amplicon, ou piscina DAL, combinando 10 microliters da piscina da biblioteca com 10 microliters de 0,2 hidróxido de sódio normal e incubando a mistura por cinco minutos à temperatura ambiente. Após a incubação, adicione 10 microlitadores de Tris-HCl de 200 milímetros no pH 7.0, seguido por 970 microliters de HT1 Hybridization Buffer. Faça o tubo de carga final combinando 300 microliters de HT1, 25 microliters de 20 picomolar PhiX e 675 microliters da piscina DAL.

Adicione todo o volume do tubo de carga ao poço de amostra do cartucho do reagente do sequenciador e carregue o cartucho no sequenciador. Comece selecionando a amostra de controle positiva e garantindo que todas as fusões esperadas e isoforms oncogênicos tenham sido detectados e estejam listados na forte guia de evidências. Para cada amostra, inspecione os sites de início únicos médios por valor de controle GSP2 e visualize as leituras de suporte para cada fusão potencial clicando no link Visualize que leva o usuário a uma exibição JBrowse baseada na Web de acúmulos de leituras de suporte de fusão individual.

Confirme que as leituras são em sua maioria livres de incompatibilidade, mas mais de 30 bases das leituras estão alinhadas com o parceiro de fusão, e que sequências adjacentes ao ponto de interrupção entre os genes e os sites de ligação do primer estão livres de inserções ou exclusões. É fundamental garantir que toda fusão de chamadas esteja geralmente livre de desalinhamento e que uma parte significativa das leituras esteja alinhada com o parceiro de fusão. Este protocolo tem sido usado para investigar o status de fusão genética em uma amostra de adenocarcinoma pulmonar.

O resumo mostra fortes fusões de evidências e a página Leitura estatística mostra métricas da amostra. Esta amostra apresenta boa qualidade de RNA, de modo que os resultados negativos seriam relatados se não fossem encontradas fusões. Uma chamada de fusão legítima tem um alto número de leituras de suporte, uma alta porcentagem de leituras da cartilha que suporta a fusão e um alto número de sites in início.

A visualização das leituras demonstra bom alinhamento às grandes regiões do parceiro de fusão. Por outro lado, uma chamada de fusão artefatoual tem métricas de suporte mais baixas e uma alta taxa de erro ao mapear para o parceiro. Chamadas de fusão artefatosas feitas pelo algoritmo de análise são comuns.

É fundamental inspecionar manualmente cada chamada para garantir que ela represente uma fusão genética real na amostra do paciente.