Name: Derivação e tratamento de tumorsphere de células tumorais primárias isoladas de rabdomiossarcoma de camundongo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Aprenda a derivar e tratar tumorsferas de células primárias de rabdomiossarcoma de camundongo. Este método reprodutível permite screening de fármacos e estudos de biologia tumoral in vivo.

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Este trabalho foi apoiado pela concessão AG-NS-0843-11 da Fundação médica de Ellison, e pelo Grant piloto de NIH dentro da concessão do apoio do centro do cancer de NCI P30CA030199 a A.S.

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Os autores não têm nada a revelar.

Os métodos múltiplos foram empregados para a isolação e a caracterização dos TPCs das populações heterogêneas da pilha do tumor: ensaios ensaios do tumor, isolação de FACS, e ensaio da formação do tumorsphere. O ensaio clonogénico do tumor foi descrito primeiramente em 1971, usado para estudos da pilha de haste, e aplicado somente subseqüentemente à biologia do cancer29,30. Este método é baseado na propriedade intrínseca das pilhas de haste do cancro a expandir s...

O câncer é uma doença heterogênea; Além disso, o mesmo tipo de tumor pode apresentar mutações genéticas diferentes em pacientes diferentes, e dentro de um paciente um tumor é compor por populações múltiplas das pilhas1. A heterogeneidade apresenta um desafio na identificação de células responsáveis pelo início e propagação do câncer, mas sua caracterização é essencial para o desenvolvimento de tratamentos eficientes. A noção de pilhas de propagação do tumor (TPC), uma população rara das pilhas que contribuem ao desenvolvimento do tumor, foi revista previamente extensivamente2. Apesar do fato de que os TPCs têm sido caracterizados em múltiplos tipos de câncer, a identificação de marcadores para seu isolamento confiável continua sendo um desafio para vários tipos de tumores3,4,5,6 , 7 anos de , 8 . º , 9. assim, um método que não dependa de marcadores moleculares, mas em propriedades funcionais de TPC (alta autorenovação e a capacidade de crescer em condições de baixa fixação), conhecido como o ensaio de formação de tumorfera, pode ser amplamente aplicado para o identificação de TPCs da maioria dos tumores. Importante, este ensaio também pode ser empregado para a expansão de TPCs e, portanto, aplicado diretamente à triagem de drogas de câncer e estudos sobre a resistência ao câncer1,10.
O rabdomiossarcoma (RMS) é uma forma rara de sarcoma de tecido mole mais comum em crianças jovens11. Althoug RMS pode ser identificado histologicamente através da avaliação da expressão de marcadores miogênicos, a célula RMS de origem não foi caracterizada univocalmente devido aos subtipos de tumores múltiplos e alta heterogeneidade dos estímulos de desenvolvimento tumoral. De fato, estudos recentes têm gerado uma discussão científica significativa sobre se o RMS é de origem miogênica ou não-miogênica, sugerindo que o RMS pode derivar de diferentestipos decélulas, dependendodo contexto12,13, 14 anos de , 15 anos de , 16 anos de , 17. numerosos estudos sobre as linhagens de células RMS foram realizados empregando o ensaio de formação de tumorfera para a identificação de vias envolvidas no desenvolvimento tumoral e caracterização de marcadores associados a populações de alta autorenovação 18 anos de , 19 anos de , 20 anos de , a 21.
Entretanto, apesar do potencial do ensaio de formação da tumorfera para identificar as células de origem do RMS, um método confiável que pode ser empregado em células RMS primárias ainda não foi descrito. Neste contexto, um estudo recente de nosso grupo empregou um ensaio otimizado de formação de tumorfera para a identificação das células de origem do RMS em um modelo de rato de distrofia muscular de Duchenne (DMD)22. Vários tipos de células pré-tumorigênicas, isolados de tecidos musculares, são testados por sua capacidade de crescer em condições de baixo apego, permitindo a identificação de células-tronco musculares como células de origem para RMS em contextos distróficos. Descrito aqui é um protocolo reprodutível e confiável para o ensaio de formação de tumorfera (Figura 1), que tem sido empregado com sucesso para a identificação de populações de células extremamente raras que são responsáveis pelo desenvolvimento do mouse RMS.

<table><tbody><tr><td>Reagente de dissociação celular Accutase</td><td>Gibco</td><td>A1110501</td><td>Separar células aderentes e dissociar tumoresferas Celigo</td></tr><tr><td></td><td>Nexcelom</td><td>Citômetro</td> de <td>imagem baseado em placa Celigo Microwell para células aderentes e em suspensão</td></tr><tr><td>Colagenose, Tipo II</td><td>Life Technologies</td><td>17101015</td><td>Enzima de digestão de tecidos</td></tr><tr><td>Dispase II, protease</td><td>Life Technologies</td><td>17105041</td><td>Enzima de digestão tecidual</td></tr><tr><td>DMEM meio de alta glicose</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td>Componente do meio de células tumorais</td></tr><tr><td>Meio DMEM / F12 Gibco</td><td></td><td>11320033</td><td>Componente do meio da tumosfera</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>S312500</td><td>Componente do tampão FACS</td></tr><tr><td>EGF proteína de camundongo recombinante</td><td>Gibco</td><td>PMG8041</td><td>Componente do meio</td></tr> <tr><td>da tumosferaFACSAria II Citometria de Fluxo</td><td>BD Biosciences</td><td>650033</td><td>Classificador de células ativadas fluorescentes Soro</td></tr><tr><td>Fetal Bovino</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-11</td><td>Componente do meio de células tumorais</td></tr><tr><td>Agente anestésico Fluriso (Isofluornae)</td><td>MWI Vet Supply</td><td>502017</td><td>Reagente anestésico para animais</td></tr><tr><td>FxCycle Violet Stain</td><td>Life Technologies</td><td>F10347</td><td>Discriminar células vivas e mortas</td></tr><tr><td>Goat Serum</td><td>Life Technologies</td><td>16210072</td><td>Componente do tampão FACS</td></tr><tr><td>F10 Media</td><td>Life Technologies</td><td>da</td> Ham's <td>11550043 Componente do tampão FACS</td></tr><tr><td>Horse Serum</td><td>Life Technologies</td><td>16050114</td><td>Componente do meio de isolamento celular</td></tr><tr><td>Reagente de transfecção Lipofectamine 3000 Reagente</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>de transfecção ThermoFisher L3000015Matriz de membrana Matrigel</td><td>Corning</td><td>CB40234</td><td>Fornece suporte para células transplantadas</td></tr><tr><td>N-2 Supplemtns (100X)</td> <td>Gibco</td><td>17502048</td><td>Componente do meio da tumosfera</td></tr><tr><td>Neomicina-Polimixina B Sulfatos-Bacitracina Zinco Pomada Oftálmica</td><td>MWI Vet Supply</td><td>701008</td><td>Pomada para os olhos</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>Componente do tampão FACS e usado para lavar células</td></tr><tr><td>pEGFP-C1</td><td>Addgene</td><td>6084-1</td><td>GFP plasmídeo</td></tr><tr><td>Penicilina - Estreptomiocina</td><td>Life Technologies</td><td>15140163</td><td>Componente da tumosfera e células tumorais mídia</td></tr><tr><td>Recombinante Humana &beta; FGF-basic</td><td>Peprotech</td><td>10018B</td><td>Componente da mídia da tumosfera</td></tr><tr><td>Camundongo recombinante Flt-3 Ligante Proteína</td><td>R & D Systems</td><td>427-FL-005</td><td>Proteína recombinante</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>ThermoFisher</td><td>15250061</td><td>Discriminar células vivas e mortas</td></tr></tbody></table>

derivação e tratamento de tumorsphere de células tumorais primárias isoladas de rabdomiossarcoma de camundongo

Tumorsphere Derivation and Treatment from Primary Tumor Cells Isolated from Mouse Rhabdomyosarcomas

O rhabdomyosarcoma (RMS) é o sarcoma macio o mais comum do tecido nas crianças. Embora esforços significativos permitiram a identificação de mutações comuns associadas ao RMS e permitiram a discriminação de diferentes subtipos de RMS, ainda existem grandes desafios para o desenvolvimento de novos tratamentos para melhorar ainda mais o prognóstico. Embora identificada pela expressão de marcadores miogênicos, ainda há controvérsia significativa sobre se o RMS tem origens miogênicas ou não miogênicas, já que a célula de origem ainda é pouco compreendida. No presente estudo, um método confiável é fornecido para o ensaio de tumorfera para o mouse RMS. O ensaio é baseado em propriedades funcionais de pilhas do tumor e permite a identificação de populações raras no tumor com funções tumorigênico. Também são descritos procedimentos para testar proteínas recombinantes, integrando protocolos de transfecção com o ensaio de tumorfera e avaliando genes candidatos envolvidos no desenvolvimento e crescimento tumoral. Descrito mais é um procedimento para a transplantação do aloenxerto de tumorspheres em ratos destinatários para validar a função tumorigênico in vivo. Globalmente, o método descrito permite a identificação e o teste confiáveis de populações tumorigênicas de RMS raras que podem ser aplicadas a RMS que surgem em diferentes contextos. Finalmente, o protocolo pode ser utilizado como plataforma para triagem de fármacos e desenvolvimento futuro da terapêutica.

Detecção de tumorspheres O isolamento celular foi otimizado para obter a máxima heterogeneidade das populações celulares presentes no tecido tumoral. Em primeiro lugar, uma vez que os tecidos isolados apresentavam áreas morfologicamente dissimilares, para aumentar as chances de isolar populações de células raras uniformes, a amostragem foi realizada a partir de múltiplas áreas do tumor (Figura 1a, primeiro painel à esquerda). Segundo, a di...

Este protocolo descreve um método reprodutível para a isolação de pilhas preliminares do rabdomiossarcoma do rato, da formação e do tratamento do tumorsphere, e da transplantação do aloenxerto que partem das culturas dos tumorspheres.

Derivação e tratamento de tumorsphere de células tumorais primárias isoladas de rabdomiossarcoma de camundongo

Rhabdomyosarcoma (RMS) is the most common soft tissue sarcoma in children. Although significant efforts have enabled the identification of common ...

Rabdomiossarcoma é uma forma rara de sarcomas de tecido mole caracterizada histologicamente pela morfologia tecidual e pela expressão de marcadores miogênicos. No entanto, dada a existência de diferentes subtipos desses tumores e a heterogeneidade dos estímulos que contribuem para sua formação, a identificação da célula de origem tem sido muito desafiadora. Aqui descrevemos métodos reprodutíveis e confiáveis para a identificação da célula de origem dos rabdomiossarcomas a partir da colheita recente de tecidos tumorais de camundongos e este ensaio é o ensaio de formação tumorais.As principais vantagens do ensaio de formação tumorais é que ele se baseia em propriedades celulares que são conhecidas por estarem presentes em células originárias de tumores e também pode ser usada para expansão e enriquecimento da população celular específica. Além disso, sua estrutura esferoide imita o ambiente tumoral, podendo ser usados como estudos de rastreamento de drogas. Este método tem o potencial de ser aplicado a outros tipos de tumores porque não requer conhecimento prévio de marcadores moleculares, mas pode exigir otimização das condições culturais.Tumores podem levar algum tempo para se form

tumorsphere-derivation-treatment-from-primary-tumor-cells-isolated

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Este protocolo descreve o isolamento, enriquecimento e manutenção das células do tumor meduloblastoma-tronco derivadas de camundongos mutantes com ectópica atividade da via sonic hedgehog.

Enriquecimento de isolamento, e Manutenção de Células-Tronco Meduloblastoma

Um método é descrito para propagar tumores retinoblastoma humano em camundongos. Células tumorais são diretamente injetadas nos olhos de ratos imune deficiente. Tumores secundários foram estabelecidas com sucesso usando as duas células diretamente colhidas a partir de tumores humanos e tumorspheres cultivadas.

Estabelecimento e propagação de Tumores Humanos em Retinoblastoma Imune camundongos deficientes

Este protocolo vídeo demonstra o isolamento e expansão de células-tronco como de mutliforme glioblastoma humano ressecado cirurgicamente (GBM) tecido tumoral utilizando o método de cultura neurosphere ensaio.

Isolamento e Expansão da Human Glioblastoma Multiforme Células Tumorais Utilizando o Ensaio Neurosphere

A presença de células-tronco cancerosas (CSCs) em sarcomas ósseos foi recentemente ligada à sua patogênese. Neste artigo, apresentamos o isolamento de CSCs de culturas de células primárias obtidas a partir de biópsias humanas de osteossarcoma convencional (OS) que utilizam a capacidade dos CSCs a crescer sob condições não aderentes.

Establishment of Cancer Stem Cell Cultures de Human osteossarcoma convencional

O seguinte protocolo incide sobre o estabelecimento de uma cultura primária de sarcoma de tecidos moles paciente-derivado (STS). Este modelo pode nos ajudar a compreender melhor o fundo molecular e perfil farmacológico destas malignidades raras e poderia representar um ponto de partida para novas pesquisas que visam melhorar a gestão do STS.

Estabelecimento de uma cultura primária de Sarcoma macio do tecido derivado de paciente

Nós descrevemos um protocolo detalhado para a isolação de pilhas tumor-iniciando dos xenoenxertos paciente-derivados do sarcoma humano pela seleção fluorescência-ativada da pilha, usando o antígeno-1 humano da leucócito (HLA-1) como um marcador negativo, e para a validação mais adicional e caracterização destas pilhas tumor-iniciando HLA-1-Negative.

Isolamento e caracterização de células iniciantes tumorais de sarcoma de xenoenxertos derivados do paciente

O objetivo dessa metodologia é identificar células-tronco cancerígenas (CSC) em linhas de células cancerosas e amostras primárias de tumor humano com o protocolo de formação da esfera, de forma robusta, utilizando ensaios funcionais e caracterização phenotípica com citometria de fluxo e ocidental Borrão.

Obtenção de esferas de células-tronco cancerígenas de tumores ginecológicos e de câncer de mama

Neste protocolo, descrevemos um modelo de camundongo de ressecção cirúrgica incompleta de sarcoma de tecido mole para testar (neo)terapias adjuvantes.

Um modelo de mouse de sarcoma de tecido mole incompletamente ressectado para testar (Neo)terapias adjuvantes

Os modelos de metástases ósseas não desenvolvem metástases uniformemente ou com 100% de incidência. A injeção direta intraóssea de células tumorais pode resultar em embolização do pulmão. Apresentamos nossa técnica de modelagem de tumores ósseos primários e metástases ósseas usando o implante de enxerto de tumor sólido no osso, levando a enxertia e crescimento reprodutíveis.

Modelagem de Tumores Ósseos Primários e Metástases Ósseas com Implante de Enxerto Sólido de Tumor em Osso

Apresentamos aqui um protocolo para usar hipertermia controlada, gerada por ultrassom focalizado de alta intensidade guiado por ressonância magnética, para desencadear a liberação de drogas de lipossomas sensíveis à temperatura em um modelo de rabdomiossarcoma em camundongos.

Hipertermia gerada por ultrassom focalizado de alta intensidade guiado por ressonância magnética: um método de tratamento viável em um modelo de rabdomiossarcoma murino

O presente protocolo descreve a geração de modelos de cultura tumoral 3D a partir de células cancerosas primárias e a avaliação de sua sensibilidade a drogas por meio de ensaios de viabilidade celular e exames microscópicos.

Estabelecendo esferoides tridimensionais de amostras tumorais derivadas de pacientes e avaliando sua sensibilidade a drogas

Aprenda a derivar e tratar tumorsferas de células primárias de rabdomiossarcoma de camundongo. Este método reprodutível permite screening de fármacos e estudos de biologia tumoral in vivo.

Derivação e tratamento de tumorsphere de células tumorais primárias isoladas de rabdomiossarcoma de camundongo

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