Name: Divulgando a coleta de Hemolinfas e a inoculação de blastósporos de Metarhizium em carrapatos de Rhipicephalus MICROPLUS para estudos de patologia de invertebrados (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Aprenda a coletar hemolinfa e inocular blastósporos de Metarhizium em carrapatos Rhipicephalus microplus. Este método permite estudar respostas imunes e desenvolver estratégias alternativas de controle biológico.

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Este estudo foi financiado em parte pela coordenacão de aperfeiçoamento de pessoal de nível superior (CAPES) do Brasil, código financeiro 001. CAPES forneceu bolsa de doutorado para AF marciano. Agradecemos ao Conselho Nacional de desenvolvimento científico e tecnológico (CNPq) do Brasil pela prestação de bolsa de doutorado para J. Fiorotti. Esta pesquisa também foi apoiada por subsídios da Fundação Carlos Chagas filho para a pesquisa do estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) e do CNPq. V.R.E.P. Bittencourt é pesquisador do CNPq.

Os carrapatos utilizados no presente estudo foram obtidos de uma colônia artificial, mantido na Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, que métodos foram aprovados pela Comissão de ética para o uso de animais vertebrados (ceua-IV/UFRRJ #037/2014).
1. carrapato fêmeas ingurgadas
<ol><li>Após a coleta de carrapatos, lave as fêmeas ingurgitadas usando água da torneira e mergulhe-as em 0,5% (v/v) solução de hipoclorito de sódio por 3 min em um recipiente de vidro de 500 mL, para higiene da cutícula (Figura 1), depois seque todas as fêmeas usando toalhas de papel estéreis (Figura 2).</li>
	<li>Dividir fêmeas em grupos ponderados homogêneos (com 20 fêmeas cada): um grupo sem qualquer tratamento, um grupo controle inoculado com 5 μL de solução aquosa de polioxietileno sorbitano de 0,1% (v/v) e um grupo infectado inoculado com 5 μL em 1,0 x 10 7 blastosporos ml-1. Nota: apenas carrapatos não tratados foram utilizados para concentração de volume e hemócitos. Foram realizadas três repetições de cada grupo.</li>
</ol>2. inoculação de patógenos entre o Scutum e o capitulo
Nota: no presente estudo, foram utilizadas suspensões fúngicas entomopatogênicas como exemplo.
<ol><li>Suspender blastosporos fúngicos em 1 mL de 0,1% de solução aquosa de monooleato de polioxietileno sorbitano (v/v) e ajustar a uma concentração final de 1,0 x 107 Blastosporos ml-1. Adicionar uma alíquota de 5 μL de blastósporos Metarhizium (Figura 3) suspensão à superfície de uma película de parafina plástica. Nota: a suspensão de blastósporos de Metarhizium foi ajustada com uma câmara de Neubauer. Para acelerar o processo de inoculação, múltiplas bolhas podem ser adicionadas à superfície do filme de parafina plástica, cada bolha correspondendo a 5 μL.</li>
	<li>Use uma seringa de insulina de 1 mL ultrafina e uma agulha de 0,3 mm para puxar a suspensão e inocular-la no carrapato. Lembre-se de tirar todo o ar da seringa antes de usá-lo.</li>
	<li>Inocular 5 μL de suspensão fúngica no carrapato feminino entre o Scutum e o capitulo. Inocular fêmeas do grupo controle com 5 μL de 0,1% de solução aquosa de monooleato de polioxietileno sorbitano (v/v) sem fungo. Nota: um pequeno volume de hemolinfa pode estar presente no forame após a inserção da agulha. Tenha cuidado para não inocular o ar.</li>
</ol>3. inoculação de fungos entomopatogênicos entre a coxa da perna e o corpo da fêmea do carrapato
<ol><li>Inocular fêmeas com suspensão fúngica (5 μL em 1,0 x 107 blastosporos ml-1) entre o Tigh da perna e o corpo da fêmea, utilizando uma seringa de insulina de 1 ml ultrafina acoplada a uma agulha de 0,3 mm. Inocular fêmeas do grupo controle com 5 μL de solução aquosa de monooleato de polioxietileno sorbitano de 0,1% (v/v). Nota: quando a inoculação de blastósporos de Metarhizium é realizada entre o Tigh da perna e o corpo da fêmea do carrapato, um pequeno volume de hemolinfa pode estar presente no Tigh após a inserção da agulha. Tenha cuidado para não inocular o ar.</li>
</ol>4. hemolinfa dorsal coleção
<ol><li>Use a parte de borracha de um conjunto de infusão alada, um tubo capilar de 0,3 mm e uma ponta filtrada para realizar a coleta de hemolinfa.</li>
	<li>Interrompa a cutícula dorsal fêmea usando uma agulha de 0,3 mm.</li>
	<li>Após a interrupção, aplique uma pressão suave na parte anterior do corpo do carrapato. Observe um líquido quase transparente puxando para fora do local da perturbação. Colete a hemolinfa sugando o líquido através da ponta do filtro acoplada à parte de borracha de um conjunto de infusão alado, e um tubo capilar de 0,3 mm. Nota: não pressione o corpo do carrapato dificilmente durante a sua imobilização, pois isso pode perturbar o intestino médio e contaminar a hemolinfa. Aguarde até que a pressão suave possa expelir o fluido sem contaminação.</li>
</ol>5. coleção do hemolymph do pé do tiquetaque
<ol><li>Imobilizar o carrapato, cortar um pedaço de uma perna dianteira com um par de tesouras. Nota: uma ou mais pernas podem ser cortadas, bem como, a mesma perna pode ser cortada mais de uma vez.</li>
	<li>Aplique uma pressão suave na parte posterior do corpo do carrapato. Observar uma bolha líquida transparente que aparece no local de corte e coletá-la com o tubo capilar, conforme descrito na etapa 4,3. Nota: não pressione o corpo do carrapato dificilmente durante a sua imobilização, pois isso pode perturbar o intestino médio e contaminar a hemolinfa. Aguarde até que a pressão suave possa expelir o fluido sem contaminação.</li>
</ol>6. hemolinfa de processamento
<ol><li>Após a coleta da hemolinfa, deposite-o em 1,5 mL de microtubos previamente preenchidos com 30 μL de coquetel de protease e 82 μL de tampão fisiológico. Mantenha os microtubos no gelo em toda a coleção da hemolinfa.</li>
	<li>Amostras de centrifugação (500 x g durante 3 min a 4 ° c). Uma pelota macia dos hemócitos será dada forma após A centrifugação do hemolinfa. Nota: para a quantificação da hemolinfa, quantificar o volume de hemolinfa obtido contando o volume total dentro do microtubo e descontando o volume de coquetel de protease e tampão salino.</li>
	<li>Retire cuidadosamente o sobrenadante (hemolinfa sem células). Ressuspender suavemente as células, por exemplo, a cultura L-15 de Leibovitz ajustada para pH 7,0-7,2. Quantifique os hemócitos colocando 10 μL de hemócitos ressuscitos em uma câmara de Neubauer.</li>
</ol>7. preparação da corrediça da amostragem do hemocyte
<ol><li>Corte a perna dianteira do carrapato com um par de tesouras.</li>
	<li>Aplique uma pressão suave na parte posterior do corpo do carrapato. Observe uma bolha líquida transparente que aparece no local de corte.</li>
	<li>Aplique as gotas do hemolinfa diretamente em corrediças limpas do microscópio, depois disso, use métodos apropriados para manchar as pilhas.<ol>
<li>Para manchar hemócitos usando Giemsa, secar a hemolinfa na lâmina por 30 min, corrigi-lo em temperatura ambiente com metanol por 3 min, e mancha na solução de Giemsa (1:9 proporção de solução tampão de Sorensen, pH 7,2) por 30 min à temperatura ambiente. Lave as lâminas com água corrente para remover o excesso de corante, seque o slide e avalie as células em 400x em um microscópio óptico.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Grisi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reassessment+of+the+potencial+economic+impact+of+cattle+parasites+in+Brazil%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+Brasileira+de+Parasitologia+Veterin%C3%A1ria%22%5BJournal%5D)">Reassessment of the potencial economic impact of cattle parasites in Brazil.</a> Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária. 23 (2), 150-156 (2014).</li>
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<li>Sonenshine, D. E., Hynes, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+and+related+aspects+of+the+innate+immune+response+in+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization and related aspects of the innate immune response in ticks.</a> Frontiers in Bioscience. 13, 7046-7063 (2008).</li>
<li>Tsakas, S., Marmaras, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+immunity+and+its+signaling%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Invertebrate+Survival+Journal%22%5BJournal%5D)">Insect immunity and its signaling: an overview.</a> Invertebrate Survival Journal. 7, 228-238 (2010).</li>
<li>Burgdorfer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemolymph+Test.+A+technique+for+detection+of+Rickettsiae+in+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Hemolymph Test. A technique for detection of Rickettsiae in ticks.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 19, 1010-1014 (1970).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A inoculação de patógenos é útil quando o estudo objetiva investigar a ação in vivo de microrganismos em modelos experimentais de artrópodes, pois assegura que o patógeno está dentro do hospedeiro. A técnica também pode ser aplicada para inocular moléculas como a interferência do RNA (RNAi). A inoculação entre o Scutum e o capitulo é considerada mais fácil de realizar, mas freqüentemente danifica o órgão de Gené, prejudicando a viabilidade dos ovos12,13. O órgão ...

O carrapato de bovinos, Rhipicephalus MICROPLUS, é um ectoparasita hematófago com um enorme impacto negativo sobre o gado em áreas tropicais. Este carrapato é o vetor de agentes patogénicos, como Babesia bovis, Babesia bigemina, e Anaplasma marginale que, combinada com o dano de hemofeeding direto, pode reduzir a produção de leite e carne, causar anemia e, finalmente, a morte. As perdas causadas por este ectoparasita foram estimadas em 3.240.000.000 dólares anuais no Brasil1. São exigidos métodos sustentáveis e a utilização de agentes entomopatogênicos é considerada uma alternativa promissora para reduzir o uso de acaricidas químicas2,3,4.
Fungos entomopatogênicos, como Metarhizium spp., são inimigos naturais de artrópodes, incluindo carrapatos, e alguns isolados podem ser usados como biocontroladores. Esses patógenos infectam ativamente o hospedeiro através da cutícula e colonizam ocorpo2,5,6. À medida que a infecção se desenvolve, as respostas celulares e humorais são mediadas pelo sistema imunológico do carrapato. A análise da hemolinfa do carrapato é relatada como uma ferramenta útil para avaliar as respostas imunes após o desafio com os patógenos7,8.
A resposta imune dos artrópodes é dividida em respostas humorais e celulares. A resposta humoral envolve processos de hemaglutinação e produção de proteínas/peptídeos antimicrobianos, enquanto a resposta imune celular é realizada através dos hemócitos. Estas células estão presentes na hemolinfa de todos os artrópodes e são relatadas para desenvolver um papel expressivo em estudos envolvendo a resposta imune inata9, pois está diretamente relacionado com os processos de fagocitose e encapsulação. Assim, estudos sobre hemócitos podem ajudar a investigar a via de morte e compreender processos como autofagia, apoptose e necrose. Em alguns invertebrados como bivalves, a coleção de hemócitos enfrenta limitações como ruptura celular, baixo volume de hemolinfa obtido e baixa concentração de células recuperadas10. Muito freqüentemente, dependendo da metodologia aplicada, a concentração reduzida de células é obtida, impactando diretamente na quantificação e análise das células.
O número de hemócitos circulantes na hemolinfa é variável entre os diferentes artrópodes e pode mudar na mesma espécie devido a diferentes estágios fisiológicos, como sexo, idade e estágio de desenvolvimento do artrópode11. Hemócitos também podem ser encontrados aderiram a alguns órgãos e ser liberado em circulação logo após o processo de infecção11. No entanto, a maioria dos estudos relatou uso de insetos, enquanto os carrapatos permanecem menos explorados quanto à sua fisiologia e patologia. Apesar da inoculação do patógeno e da coleta de hemolinfas em carrapatos são técnicas menos utilizadas, o estabelecimento de métodos padrão auxilia no desenvolvimento de estudos mais precisos.
O objetivo do presente estudo foi comparar os métodos mais utilizados para coleta de hemolinfas e inoculação de patógenos em carrapatos de R. MICROPLUS , avaliando a eficácia na concentração de hemolinfas e hemócitos.

<table><tbody><tr><td>Solução alcalina de hipoclorito</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1727</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Synth</td><td>2706</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Gibco</td><td>16000036</td><td></td></tr><tr><td>Borracha flexível</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Giemsa mancha</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>48900-500ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Capilar de vidro</td><td>CTechGlass</td><td>CT95-02</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de insulina (agulha)</td><td>BD</td><td>SKU:&nbsp; 324910</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Vetec</td><td>60REAVET014512</td><td></td></tr><tr><td>Meio de cultura L-15 da Leibovitz&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11415-064</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>Microtubos Lâminas de Microscópio</td><td>Kasvi</td><td>K5-7105</td><td></td></tr><tr><td>MARCA</td><td></td><td>Z336769-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Vetec</td><td>60REAVET014593</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de Neubauer&nbsp;</td><td>Kasvi</td><td>K5-0111</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina</td><td>Gibco</td><td>15140163</td><td></td></tr><tr><td>Coquetel de inibidores de protease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2714</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Vetec</td><td>60REAVET003662</td><td></td></tr></tbody></table>

divulgando a coleta de hemolinfas e a inoculação de blastósporos de metarhizium em carrapatos de rhipicephalus microplus para estudos de patologia de invertebrados

Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

Carrapatos são obrigatórios ectoparasitas hematófagos e Rhipicephalus MICROPLUS tem grande importância na medicina veterinária porque causa anemia, perda de peso, depreciação do couro dos animais e também pode atuar como um vetor de vários patógenos. Devido aos custos exorbitantes para controlar esses parasitas, danos ao meio ambiente causados pelo uso inadequado de acaricidas químicos, e o aumento da resistência contra parasiticidas tradicionais, controle alternativo de carrapatos, pelo uso de os fungos entomopatogénicos, por exemplo, foram considerados uma aproximação interessante. No entanto, poucos estudos demonstraram como o sistema imunológico do carrapato atua para combater esses entomopatógenos. Portanto, este protocolo demonstra dois métodos utilizados para a inoculação de entomopatógenos em fêmeas ingurgedadas e duas técnicas utilizadas para coleta de hemolinfas e hemócitos. A inoculação de patógenos na inserção da perna no corpo da fêmea do carrapato permite a avaliação de parâmetros biológicos femininos diferentemente da inoculação entre o Scutum e o capitulo, que freqüentemente danifica o órgão de Gené. A coleção dorsal do hemolinfa rendeu uma recuperação mais elevada do volume do que a coleção através das pernas. Algumas limitações da coleta e processamento de hemolinfas de carrapato incluem i) altas taxas de ruptura de hemócitos, II) contaminação da hemolinfa com intestino médio interrompido e III) baixa recuperação do volume da hemolinfa. Quando a hemolinfa é coletada através do corte da perna, a hemolinfa leva tempo para se acumular na abertura da perna, favorecendo o processo de coagulação. Além disso, menos hemócitos são obtidos na coleta através da perna em comparação com a coleta dorsal, embora o primeiro método seja considerado mais fácil de ser realizado. Compreender a resposta imune em carrapatos mediados por agentes entomopatogênicos ajuda a revelar sua patogênese e desenvolver novos alvos para o controle do carrapato. Os processos de inoculação aqui descritos requerem recursos tecnológicos muito baixos e podem ser utilizados não apenas para expor carrapatos a microrganismos patogênicos. Da mesma forma, a coleta de hemolinfa de carrapato pode representar o primeiro passo para muitos estudos fisiológicos.

Este artigo aborda métodos de coleta de inoculação e hemolinfa aplicados a carrapatos. Após a inoculação entre a coxa da perna e o corpo da fêmea do carrapato, algum fluido (hemolinfa) pode ser secretado durante o processo; no entanto, é importante notar que, quando a inoculação é terminada, nenhum líquido ou tecido estiveram presentes na ponta da agulha ou no local de inoculação, assegurando que a suspensão fúngica foi completamente inoculada. Quando o processo de inoculação foi realizad...

A análise da hemolinfa de carrapato representa uma importante fonte de informações sobre como alguns patógenos causam doenças e como os carrapatos respondem imunologicamente a essa infecção. O presente estudo demonstra como inocular propágulos fúngicos e coletar hemolinfas de fêmeas de Rhipicephalus MICROPLUS ingurgizadas.

Divulgando a coleta de Hemolinfas e a inoculação de blastósporos de Metarhizium em carrapatos de Rhipicephalus MICROPLUS para estudos de patologia de invertebrados

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites and Rhipicephalus microplus has great importance in veterinary medicine because it causes anemia, weight ...

Carrapatos são ectoparasitas hematófagos, Rhipicephalus microplus, popularmente conhecido como carrapato bovino tem enorme impacto econômico negativo sobre a pecuária em áreas tropicais. Além disso, preocupações crescentes com as condições ambientais degradadas e preocupações com a saúde pública causadas pelo uso inadequado de acaricídios químicos e pelo aumento da resistência das populações de carrapatos aos parasitas tradicionais, estão estimulando pesquisas sobre métodos alternativos de controle, como o uso de fungos entomopatômicos. Esses entomopatógenos infectam ativamente os hospedeiros artrópodes, através de sua cutícula e colonizam seu corpo.O artrópode pode ter respostas diferentes para a infecção fúngica. O sistema imunológico artrópode é dividido em respostas humorais e celulares. A resposta humorística envolve processo de hemagglutinação e produção de moléculas antimicrobianas, enquanto os hemócitos mediam a resposta imune celular.A maioria dos estudos sobre resposta imune ao artrópode são relatados usando insetos, enquanto as respostas ao carrapato permanecem menos exploradas. Além disso, a inoculação de patógenos e a coleta de hemoglifos de carrapato são técnicas pouco difundidas necessárias para entender melhor a resposta imune do artrópode. Assim, este vídeo aborda técnicas\usadas para filmar a inoculação, coleta hemolífi e processamento.Uma vez que os hemócitos do carrapato que a colheita enfrenta algumas limitações, como interrupção de células, baixo valor hemóclático e baixa concentração de células recuperadas. Infectando diretamente na configuração e análise das células. Depois da coleta de carrapatos, lave fêmeas engorgadas.Use água da torneira e mergulhe-as em solução de hipoclorito de sódio de 0,5% por três minutos em um recipiente de copo de vidro de 500 mililitros. Para a higiene da cutícula, divida as fêmeas em grupos homogêneos com 20 fêmeas cada. Foram realizadas três réplicas de cada grupo.Metarhizium robertsii blastospores foram usados no processo de inoculação. Adicione um líquido de cinco microliters metarhizium blastospores suspensão à superfície de um filme de parafina de plástico. Para acelerar o processo de inoculação, várias bolhas podem ser adicionadas à superfície do filme de parafina de plástico, cada bolha correspondente a cinco microlitadores.Use uma seringa de insulina ultrafina de um milímetro e uma agulha de 0,3 milímetros para colocar uma suspensão e inocula-la no carrapato. Lembre-se de tirar todo o ar da seringa antes de usá-la. Inocular 5 microlitres de suspensão de fungos no carrapato feminino entre o scutum e o capitúlo.Um pequeno volume de hemolífio pode estar presente no enquadramento após a incisão da agulha. Tenha cuidado para não inocular ar. Inocula as fêmeas com suspensão de fungos entre a coxa da perna e o corpo da fêmea usando uma seringa de insulina ultrafina de um mililitro acoplada a uma agulha de 0,3 milímetros.Quando a inoculação de blastospores de metarhizium é realizada entre a coxa da perna e o corpo da fêmea do carrapato, um pequeno volume de hemoglifo pode estar presente na coxa após a inserção da agulha. Tenha cuidado para não inocular ar. Use a parte de borracha de uma infusão alada um tubo capilar de 0,3 milímetros e uma ponta de filtro para realizar a coleção hemoglifo.Interrompa a cutícula dorsal feminina usando uma agulha de 0,3 milímetros. Após a interrupção aplicar pressão suave na parte anterial do corpo do carrapato. Observe uma poça líquida quase transparente fora do local de interrupção.Colete o hemofímetro sugando o líquido através da ponta do filtro acoplada a uma parte de borracha de um conjunto de infusão alado e um tubo capilar de 0,3 milímetros. Não pressione o corpo do carrapato quase durante sua imobilização porque isso pode perturbar o midgut e contaminar o hemisão. Espere até que a pressão suave possa expulsar o fluido sem contaminação.Imobilize o carrapato. Corte um pedaço de uma perna dianteira. Uma ou mais pernas podem ser cortadas, bem como a mesma perna pode ser cortada mais de uma vez.Aplique pressão suave na parte posterior do corpo do carrapato. Observe uma bolha líquida transparente aparecer no lado do corte e colecioná-la com o tubo capilar. Não pressione o corpo do carrapato mal, durante sua mobilização, porque isso pode perturbar o midgut e contaminar o hemóglifo.Espere até que a pressão suave possa expulsar o fluido sem contaminação. Após a coleta hemolímph, deposite-o em 1,5 mililitros microtubos previamente preenchidos com 30 coquetéis protease de microlitres e 82 tampão salino de microlitres. Mantenha os microtubos no gelo durante toda a coleção de hemoglifos.Amostras de centrífugas e a pelota macia de hemócitos serão formadas após a centrifugação hemoclfíquica. Para quantificação hemolímph, quantifique o volume hemofífono obtido contando o volume total dentro do microtubo e descontando o volume de coquetel de protease e tampão salino. Remova cuidadosamente o hemoglifo livre de células sobrenanasces e suspenda suavemente as células.Quantifique os hemócitos colocando 10 microlitres de hemócitos re-suspensos na câmara de Neubauer. Para células, foi usada uma mídia cultural. Corte a perna dianteira do carrapato, aplique pressão suave na parte posterior do corpo do carrapato, observe uma bolha líquida transparente aparecer no local do corte.Aplique as gotas hemolímph diretamente em lâminas de microscópio limpos. Depois disso, use métodos apropriados para manchar as células. A inoculação entre a coxa da perna e o carrapato do corpo feminino também pode danificar órgãos internos do carrapato, como o midgut e os túbulos malpighianos.Quando o carrapato é interrompido pela agulha na coleta hemolímph dorsal, o fluido obtido é vermelho, não transparente. Isso indica uma coleta hemofífona incorreta. Neste caso, a hemofífita deve ser descartada por estar contaminada.A contaminação hemolímph também pode ser observada quando o carrapato é naturalmente infectado com altas cargas de patógenos, ou nas etapas finais após o processo de morte causado por patógenos inoculados. O volume hemolífio obtido após a coleta dorsal é maior do que o volume obtido na coleta através da perna. Apesar da facilidade de contaminação ser maior no primeiro método de coleta.A concentração de hemócitos também foi significativamente maior na coleta dorsal. Quando a coleta correta de hemócitos é realizada uma boa mancha pode ser obtida e é possível distinguir diferentes hemócitos após a coloração. Este vídeo forneceu informações sobre métodos para realizar a inoculação de patógenos, especificamente fungos entomopatômicos, em carrapatos e coletar seu hemisão.As técnicas aqui apresentadas requerem recursos tecnológicos muito baixos em nossos passos clássicos para estudos sobre fisiologia do carrapato, patologia do carrapato e resposta imune do carrapato. A colheita correta das células artrópodes e o hemolífio livre de células é crucial para pagar informações confiáveis para estudos subsequentes. Por isso, também é importante estar atento aos erros mais comuns observados na execução dessas técnicas.Além disso, as propostas deste estudo determinarão o local mais adequado para a coleta de hemoglifos através da deformação ou corte das pernas, considerando a diferença no volume obtido e a probabilidade de contaminação.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

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