Name: Avaliação do estado de fertilização por rastreamento da morfologia nuclear de espermatozóides na adubação dupla de Arabidopsis (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 s
Description: Aprenda a avaliar o estado de fertilização em Arabidopsis por meio do rastreamento da morfologia nuclear de espermatozóides. Este método permite coleta rápida de dados para análise estatística e estudo de fatores desconhecidos.

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Este trabalho foi apoiado pela sociedade japonesa para a promoção da ciência KAKENHI Grant (JP17H05832 to T. I.) e pelo financiamento do programa de promoção estratégica de pesquisa prioritária em fitoquímica Plant Molecular Sciences, Chiba University (Japão).

1. polinização artificial
Nota: Antes de iniciar o processo, é necessário um par de fórceps n º 5.
<ol><li>Cresça a. Arabidopsis thaliana (Col-0) em 22 ° c um ciclo escuro de 16-h Light/8-h em uma câmara de crescimento. Nota: Corte e remova a primeira haste desenvolvida da flor com as tesouras para promover o desenvolvimento de botões axilar. As plantas vigorously crescentes (2-3 semanas após o corte da primeira haste; a altura da planta aproximadamente 25 cm) são apropriadas para a análise.</li>
	<li>Para emascular, remover Sepal (Figura 1b), pétala (Figura 1C), e estame (Figura 1D) de botões florais no estágio 118 (Figura 1a) usando o fórceps no. 5. Bud com pedaços de pétalas visto na parte superior é o melhor. Nota: Use uma linha de marcador fêmea apropriada do gameta. Neste protocolo, utilizou-se um tipo de planta selvagem como o pai do sexo feminino.</li>
	<li>Quinze a dezoito horas após a emasculação, tome o estame de uma flor de DMP9KD/HTR10-MRFP no estágio 138 apertando o filamento com fórceps.</li>
	<li>Para polinizar, gentilmente Pat o estigma de um pistilo emasculado várias vezes com um Anther deiscentes.</li>
</ol>2. preparação de ovule para observação
Nota: Os seguintes itens são necessários: um slide de vidro com fita dupla face anexado, no. 5 fórceps, uma agulha de injeção de 27 G, e um microscópio de dissecação.
<ol><li>7 a 8 h após a polinização (HAP), recolher o pistilo e colocá-lo na fita dupla face, em seguida, pressione suavemente com fórceps para fixar o pistilo na fita (Figura 2a, a '). Nota: A maioria dos óvulos em um pistilo receber pelo menos um tubo de pólen 10 Hap9. Se ambas ou qualquer uma das células espermáticas do primeiro tubo de pólen não fertilizar, um segundo tubo de pólen seria atraído pelo óvulo devido ao sistema de recuperação da fertilização10. Para analisar a morfologia dos núcleos espermáticos do primeiro tubo polínico, recomenda-se concluir a preparação dos óvulo por 10 HAP, o mais tardar.</li>
	<li>Corte as extremidades superior e inferior do ovário usando uma agulha de injeção um microscópio de dissecação (Figura 2b, B ').</li>
	<li>Cortar a parede do ovário ao longo de ambos os lados do replum (Figura 2C, C ') movendo a ponta da agulha de injecção. Nota: Insira a agulha de injeção de forma superficialmente para evitar a separação dos óvulo do septo.</li>
	<li>Evert a parede do ovário usando a agulha da injeção (Figura 2D, D ').</li>
	<li>Aperte a base do septo ao qual os óvulos estão ligados e levante-o cuidadosamente com o fórceps (Figura 2e).</li>
	<li>Transfira os óvulos em uma gota de água em um vidro de corrediça, e cubra delicadamente com um vidro da tampa para a observação um microscópio de fluorescência (Figura 2e, e ').</li>
</ol>3. microscopia
Nota: Neste protocolo, utilizou-se um microscópio de epifluorescência equipado com um cubo de filtro de fluorescência (ver tabela de materiais), uma câmera digital e o software de acompanhamento.
<ol><li>Adquira imagens de óvulos contendo núcleos de espermatozóides rotulados com mRFP usando uma lente objetiva de 20x ou 40x e a câmera digital equipada.</li>
	<li>Confirme o número de núcleos de espermatozóides rotulados por mRFP em um saco embrionário. Nota: Ovules contendo dois núcleos de espermatozóides rotulados por mRFP podem ser incluídos no tamanho da população para análise estatística.</li>
	<li>Confirme a forma e a posição de cada núcleo de esperma rotulado por mRFP em um saco embrionário. Nota: Imediatamente após ser liberado de um tubo do pólen, um par de núcleos condensados mRFP-etiquetados do esperma é localizado entre o ovo e a pilha central. Um núcleo decondensed do esperma de MRFP-etiquetado detectado no lado da extremidade Haustório indica a fertilização central da pilha, por exemplo. Usando uma linha de marcador fêmea apropriada da membrana do gameta, como mostrado na Figura 1 suplementar , se ou não a pilha de esperma está submetendo-se à plasmogamia (após a fusão da membrana mas antes do karyogamy) pode ser monitorado claramente.</li>
</ol>

<ol><li>Mori, T., Kawai-Toyooka, H., Igawa, T., Nozaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamete+dialogs+in+green+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Gamete dialogs in green lineages.</a> Molecular Plant. 8, 1442-1454 (2015).</li>
<li>Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+mechanisms+in+flowering+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Fertilization mechanisms in flowering plants.</a> Current Biology. 26, R125-R139 (2016).</li>
<li>Mori, T., Kuroiwa, H., Higashiyama, T., Kuroiwa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GENERATIVE+CELL+SPECIFIC+1+is+essential+for+angiosperm+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 is essential for angiosperm fertilization.</a> Nature Cell Biology. 1, 64-71 (2006).</li>
<li>von Besser, K., Frank, A. C., Johnson, M. A., Preuss, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+HAP2+%28GCS1%29+is+a+sperm-specific+gene+required+for+pollen+tube+guidance+and+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis HAP2 (GCS1) is a sperm-specific gene required for pollen tube guidance and fertilization.</a> Development. 133, 4761-4769 (2006).</li>
<li>Mori, T., Igawa, T., Tamiya, G., Miyagishima, S. Y., Berger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamete+attachment+requires+GEX2+for+successful+fertilization+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Gamete attachment requires GEX2 for successful fertilization in Arabidopsis.</a> Current Biology. 24, 170-175 (2014).</li>
<li>Takahashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+male+gamete+membrane+protein+DMP9%2FDAU2+is+required+for+double+fertilization+in+flowering+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The male gamete membrane protein DMP9/DAU2 is required for double fertilization in flowering plants.</a> Development. 145, dev170076(2018).</li>
<li>Ingouff, M., Hamamura, Y., Gourgues, M., Higashiyama, T., Berger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+dynamics+of+HISTONE3+variants+between+the+two+fertilization+products+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct dynamics of HISTONE3 variants between the two fertilization products in plants.</a> Current Biology. 17, 1032-1037 (2007).</li>
<li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+flower+development+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Early flower development in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 2, 755-767 (1990).</li>
<li>Kasahara, R. D., Maruyama, D., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+recovery+system+is+dependent+on+the+number+of+pollen+grains+for+efficient+reproduction+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Signaling+%26+Behavior%22%5BJournal%5D)">Fertilization recovery system is dependent on the number of pollen grains for efficient reproduction in plants.</a> Plant Signaling & Behavior. 8, e23690(2013).</li>
<li>Kasahara, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+recovery+after+defective+sperm+cell+release+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Fertilization recovery after defective sperm cell release in Arabidopsis.</a> Current Biology. 22, 1084-1089 (2012).</li>
<li>Hamamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+reveals+the+dynamics+of+two+sperm+cells+during+double+fertilization+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana.</a> Current Biology. 21, 497-502 (2011).</li>
<li>Igawa, T., Yanagawa, Y., Miyagishima, S., Mori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gamete+membrane+dynamics+during+double+fertilization+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Research%22%5BJournal%5D)">Analysis of gamete membrane dynamics during double fertilization of Arabidopsis.</a> Journal of Plant Research. 126, 387-394 (2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

HTR10-mRFP rotula a cromatina paterna (isto é, visualiza núcleos de células espermáticas), e a dinâmica na fertilização dupla foi relatada7. Imediatamente após a liberação de um tubo de pólen, HTR10-mRFP-rotulado núcleos de esperma ainda são condensados. Entretanto, cada um dos núcleos do esperma é desdensed em cima da fusão com um núcleo fêmea fertilizado do gameta em karyogamy três a quatro horas após a fusão7da membrana do gameta. As células de espermatozóides não fertil...

Plantas floridas produzem sementes através de dupla adubação, um processo que é controlado diretamente por interações entre proteínas localizadas na membrana plasmáticadegameta 1,2. Os gametas masculinos da planta de florescência, um par de pilhas de esperma, desenvolvem-se no pólen. Um tubo de pólen que cresce após a polinização entrega um par de células espermáticas para gametas femininas, uma célula de ovo e uma célula central, que se desenvolvem em um saco embrionário. Depois que os gametas masculinos e femininos se encontram, as proteínas na superfície do gameta promovem o reconhecimento, o acessório, e a fusão para terminar a fertilização dobro. Em estudos prévios, as proteínas da membrana do gameta masculino Generative Cell SPECIFIC 1 (GCS1)/hapless2 (HAP2)3,4e gameta expressadas 2 (GEX2)5 foram identificadas como reguladores de fertilização envolvidos na fusão de gametas e acessório, respectivamente. Nós identificamos recentemente uma proteína gameta-específica masculina da membrana, proteína 9 da membrana do domínio DUF679 (DMP9), como um regulador da fertilização envolvido na interação do gameta. Verificou-se que uma diminuição da expressão de DMP9 resulta em inibição significativa da adubação de células de ovo durante a dupla adubação em a. Arabidopsis thaliana6.
Como a fertilização dupla ocorre em um saco embrionário, que é incorporado em um óvulo que é mais envolvido com o tecido do ovário, é difícil observar e analisar os Estados de processos de fertilização dupla. Por esta razão, ainda há muitos pontos obscuros que impedem uma compreensão completa de todo o mecanismo de controle de fertilização dupla. O estabelecimento de técnicas de observação para traçar o comportamento dos gâmetas durante a dupla adubação condições in vivo é indispensável para a análise funcional de potenciais candidatos a reguladores de fertilização. Estudos recentes produziram linhas de marcador onde as estruturas subcelulares do gameta são rotuladas com proteínas fluorescentes. Neste artigo, demonstramos um protocolo simples e rápido para observar a dupla adubação que ocorreu em um saco embrionário derivado de pistilos artificialmente polinados. Usando a linha do marcador do núcleo da célula espermática HTR10-MRFP7, o estado da fertilização de cada gameta fêmea pode ser discriminado com base na morfologia nuclear do sinal do esperma. Nosso protocolo focalizando em tal mudança morfológica dos núcleos do esperma na fertilização pode eficientemente obter uma quantidade suficiente de dados para a prova estatística. Uma linha DMP9-knockdown com fundo HTR10-MRFP (DMP9KD/HTR10-MRFP) foi usada como plantas masculinas para mostrar um único teste padrão da fecundação. O protocolo também é adequado para a análise funcional de outros reguladores de fertilização.

<table><tbody><tr><td>BX51</td> Microscópio de <td>epifluorescência</td><td>Olympus</td><td></td></tr><tr><td>Vidro de cobertura</td><td>Vidro Matsunami</td><td>C018181</td><td></td></tr><tr><td>DMP9KD/HTR10-mRFP</td><td></td><td></td><td>Arabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background Takahashi et al. (2018)6</td></tr><tr><td>Fita</td> <td>dupla faceNichiban</td><td>NW-15S</td><td>15 mm de largura</td></tr><tr><td>DP72</td><td>Olympus</td><td></td><td>Degital câmera</td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>Vigor</td><td></td><td>Qualquer pinça nº 5 está disponível</td></tr><tr><td>Câmara de crescimento</td><td>Nihonika</td><td>LPH-411PFQDT-SP</td><td></td></tr><tr><td>HTR10-mRFP</td><td></td><td></td><td>Arabidopsis thaliana, ecótipo Columbia-0 (Col-0) background Ingouff et al. ( 2007)7</td></tr><tr><td>Agulha de injeção</td><td>Terumo</td><td>NN-2719S</td><td>27 G</td></tr><tr><td>Vidro deslizante</td><td>Vidro Matsunami</td><td>S9443</td><td></td></tr><tr><td>SZX9</td><td>Microscópio de dissecação</td><td>Olympus</td><td></td></tr><tr><td>U-MRFPHQ</td><td>Olympus Cubo</td><td></td> de <td>filtro de fluorescência (Excitação: BP535-555, Emissão: BA570-625, Espelho dicromático: DM565)</td></tr><tr><td>UPlanFL N 40x</td><td>Olympus</td><td></td><td>Lente objetiva (NA 1.3), imersão em óleo</td></tr><tr><td>UPlanSApo 20x</td><td>Lente objetiva Olympus</td><td></td><td>(NA 0.75), seca</td></tr></tbody></table>

avaliação do estado de fertilização por rastreamento da morfologia nuclear de espermatozóides na adubação dupla de arabidopsis

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

As plantas de florescência têm um sistema sexual original da reprodução chamado ' fertilização dobro ', em que cada um das pilhas do sperm funde precisamente com uma pilha de ovo ou uma pilha central. Assim, dois eventos de fertilização independente acontecem quase que simultaneamente. A pilha de ovo fertilizada e a pilha central tornam-se no zigoto e no endosperm, respectivamente. Portanto, o controle preciso da dupla adubação é essencial para o desenvolvimento de sementes que se seguiu. A fertilização dupla ocorre no gametófito fêmea (saco do embrião), que é profundamente escondida e coberta com os tecidos grossos do óvulo e do ovário. Esta construção do tecido do pistilo faz a observação e a análise da fertilização dobro completamente difícil e criou a situação atual em que muitas perguntas a respeito do mecanismo da fertilização dobro permanecem sem resposta. Para a avaliação funcional de um candidato potencial para o regulador da fertilização, a análise fenotípica da fertilização é importante. Para julgar a conclusão da fertilização em Arabidopsis Arabidopsis thaliana, as formas de sinais de fluorescência rotulando núcleos de espermatozóides são usadas como indicadores. Uma célula espermática que não fertilizar é indicada por um sinal de fluorescência condensado fora das gametas femininas, enquanto uma célula espermática que fertiliza com sucesso é indicada por um sinal desnaturado devido à carigamia com o núcleo feminino dos gametas. O método descrito aqui fornece uma ferramenta para determinar a fertilização bem-sucedida ou fracassada em condições in vivo.

Ovules de um pistilo polinizadas com DMP9KD/HTR10-MRFP foram coletados em 7-8 HAP e observados.
A maioria dos óvulos continha dois núcleos de espermatozóides desnaturados com mRFP na célula do ovo (lado micropylar) e as posições do núcleo da célula central (lado final do charazal), respectivamente (Figura 3a), indicando dupla fertilização bem-sucedida. Além disso, foram observad...

Nós demonstramos um método para determinar a fecundação bem sucedida ou falhada com base na morfologia nuclear do esperma na fertilização dobro de Arabidopsis usando um microscópio da epifluorescência.

Avaliação do estado de fertilização por rastreamento da morfologia nuclear de espermatozóides na adubação dupla de Arabidopsis

Flowering plants have a unique sexual reproduction system called &#8216;double fertilization&#39;,&#160;in which each of the sperm cells precisely fuses ...

Este protocolo fornece uma maneira de avaliar o envolvimento de um determinado fator na dupla fertilização da Arabidopsis. O estado de fertilização pode ser julgado pela morfologia dos núcleos espermatozoides rapidamente, de modo que a rápida obtenção dos dados para análise estatística é possível. Este método é específico para avaliação para fenótipo de fertilização em Arabidopsis.Ainda existem reguladores de fertilização desconhecidos, mesmo que em Arabidopsis. Este método seria útil para a análise funcional de futuros fatores de fertilização desconhecidos. Dominar a habilidade de manuseio rápido e intacto dos ovulos é importante para o sucesso desta análise.Para começar, cresça Arabidopsis thaliana a 22 graus Celsius sob uma luz de 16 horas e ciclo escuro de oito horas em uma câmara de crescimento. Corte e remova o primeiro talo de flores desenvolvido com tesoura para promover o desenvolvimento de botões axilares. Duas a três semanas depois de cortar o primeiro talo, meça a altura da planta.Plantas com altura acima de 25 centímetros são consideradas plantas de crescimento vigoroso e são adequadas para análise. Para emascular, procure por botões na fase 11 com pedaços de pétalas vistos no topo. Use um número cinco fórceps para remover sepala, pétala e estase de botões de flores.15 a 18 horas após a emasculação, tome o stamen de uma linha DMP9-knockdown com fundo de flor HTR10-mRFP no estágio 13, beliscando o filamento com fórceps. Para polinizar, gentilmente acariciar o estigma de um pistil emasculado várias vezes com um anther dehiscente. Sete a oito horas após a polinização, pegue o pistil e coloque-o na fita de dois lados.Em seguida, pressione suavemente com fórceps para fixar o pistil na fita. Sob um microscópio dissecando, corte as extremidades superior e inferior do ovário usando uma agulha de injeção. Mova a ponta da agulha de injeção para cortar a parede do ovário ao longo de ambos os lados do replum.Corte cuidadosamente para não separar o funículo e o trato transmissor. Everta a parede do ovário. Aperte a base do septo ao qual os ovulos estão conectados, e levante-o cuidadosamente com fórceps.Transfira os ovulos em uma gota de água em um copo de toboágua, e cubra delicadamente com um copo de cobertura para observação sob um microscópio de fluorescência. Em um microscópio de epifluorescência equipado com um cubo de filtro de fluorescência, ajuste a lente objetiva para 20x ou 40x. Adquira imagens dos ovulos contendo núcleos de esperma rotulados com mRFP.Confirme o número de núcleos de esperma rotulados com mRFP em um saco de embriões. Confirme a forma e a posição de cada núcleo de esperma rotulado por mRFP em um saco de embriões. Neste estudo, os fenótipos de fertilização foram julgados pela morfologia do sinal nuclear do esperma em ovule.A maioria dos ovulos continha dois núcleos de esperma rotulados com mRFP no lado micropirlar da célula óvula e lado final charazal de células centrais. Isso indica fertilização dupla bem sucedida. Além disso, foram observados ovulos contendo um núcleo de esperma rotulado por mRFP no núcleo celular central, além de um núcleo de espermatozoides condensado rotulado por FPM fora da célula ólda, indicando uma única fertilização.No caso da fertilização dupla fracassada, dois núcleos de espermatozoides condensados rotulados por FPM foram observados no limite da célula óvulo e da célula central. Na análise utilizando a linha DMP9-knockdown com fundo de pólen HTR10-mRFP, os ovules contendo um único núcleo condensado de esperma rotulado mRFP ou três ou mais núcleos de esperma rotulados com mRFP raramente foram observados. Combinando com o uso de linhas de marcadores femininas, pode-se analisar um estado de fertilização mais preciso.Por exemplo, o status de fertilização após a fusão do gamete e antes da karyogamia pode ser julgado. Sim, o processo de fertilização é dividido em várias etapas. As perguntas que cada regulador de fertilização envolvido em quais etapas podem ser respondidas com este método aprimorado.Forneceria uma visão mais profunda sobre a reprodução sexual da planta.

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O movimento cromossômico durante a prófase meiótica é um fenômeno pouco compreendido que é fundamental para a formação de esporos. Este protocolo descreve um método para adquirir, analisar e quantificar os movimentos do centrômero durante a prófase meiótica em meiócitos masculinos de Arabidopsis thaliana .

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Aprenda a avaliar o estado de fertilização em Arabidopsis por meio do rastreamento da morfologia nuclear de espermatozóides. Este método permite coleta rápida de dados para análise estatística e estudo de fatores desconhecidos.

Avaliação do estado de fertilização por rastreamento da morfologia nuclear de espermatozóides na adubação dupla de Arabidopsis

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