Avaliação do estado de fertilização por rastreamento da morfologia nuclear de espermatozóides na adubação dupla de Arabidopsis
29 de agosto de 2019
Nós demonstramos um método para determinar a fecundação bem sucedida ou falhada com base na morfologia nuclear do esperma na fertilização dobro de Arabidopsis usando um microscópio da epifluorescência.
Este protocolo fornece uma maneira de avaliar o envolvimento de um determinado fator na dupla fertilização da Arabidopsis. O estado de fertilização pode ser julgado pela morfologia dos núcleos espermatozoides rapidamente, de modo que a rápida obtenção dos dados para análise estatística é possível. Este método é específico para avaliação para fenótipo de fertilização em Arabidopsis.
Ainda existem reguladores de fertilização desconhecidos, mesmo que em Arabidopsis. Este método seria útil para a análise funcional de futuros fatores de fertilização desconhecidos. Dominar a habilidade de manuseio rápido e intacto dos ovulos é importante para o sucesso desta análise.
Para começar, cresça Arabidopsis thaliana a 22 graus Celsius sob uma luz de 16 horas e ciclo escuro de oito horas em uma câmara de crescimento. Corte e remova o primeiro talo de flores desenvolvido com tesoura para promover o desenvolvimento de botões axilares. Duas a três semanas depois de cortar o primeiro talo, meça a altura da planta.
Plantas com altura acima de 25 centímetros são consideradas plantas de crescimento vigoroso e são adequadas para análise. Para emascular, procure por botões na fase 11 com pedaços de pétalas vistos no topo. Use um número cinco fórceps para remover sepala, pétala e estase de botões de flores.
15 a 18 horas após a emasculação, tome o stamen de uma linha DMP9-knockdown com fundo de flor HTR10-mRFP no estágio 13, beliscando o filamento com fórceps. Para polinizar, gentilmente acariciar o estigma de um pistil emasculado várias vezes com um anther dehiscente. Sete a oito horas após a polinização, pegue o pistil e coloque-o na fita de dois lados.
Em seguida, pressione suavemente com fórceps para fixar o pistil na fita. Sob um microscópio dissecando, corte as extremidades superior e inferior do ovário usando uma agulha de injeção. Mova a ponta da agulha de injeção para cortar a parede do ovário ao longo de ambos os lados do replum.
Corte cuidadosamente para não separar o funículo e o trato transmissor. Everta a parede do ovário. Aperte a base do septo ao qual os ovulos estão conectados, e levante-o cuidadosamente com fórceps.
Transfira os ovulos em uma gota de água em um copo de toboágua, e cubra delicadamente com um copo de cobertura para observação sob um microscópio de fluorescência. Em um microscópio de epifluorescência equipado com um cubo de filtro de fluorescência, ajuste a lente objetiva para 20x ou 40x. Adquira imagens dos ovulos contendo núcleos de esperma rotulados com mRFP.
Confirme o número de núcleos de esperma rotulados com mRFP em um saco de embriões. Confirme a forma e a posição de cada núcleo de esperma rotulado por mRFP em um saco de embriões. Neste estudo, os fenótipos de fertilização foram julgados pela morfologia do sinal nuclear do esperma em ovule.
A maioria dos ovulos continha dois núcleos de esperma rotulados com mRFP no lado micropirlar da célula óvula e lado final charazal de células centrais. Isso indica fertilização dupla bem sucedida. Além disso, foram observados ovulos contendo um núcleo de esperma rotulado por mRFP no núcleo celular central, além de um núcleo de espermatozoides condensado rotulado por FPM fora da célula ólda, indicando uma única fertilização.
No caso da fertilização dupla fracassada, dois núcleos de espermatozoides condensados rotulados por FPM foram observados no limite da célula óvulo e da célula central. Na análise utilizando a linha DMP9-knockdown com fundo de pólen HTR10-mRFP, os ovules contendo um único núcleo condensado de esperma rotulado mRFP ou três ou mais núcleos de esperma rotulados com mRFP raramente foram observados. Combinando com o uso de linhas de marcadores femininas, pode-se analisar um estado de fertilização mais preciso.
Por exemplo, o status de fertilização após a fusão do gamete e antes da karyogamia pode ser julgado. Sim, o processo de fertilização é dividido em várias etapas. As perguntas que cada regulador de fertilização envolvido em quais etapas podem ser respondidas com este método aprimorado.
Forneceria uma visão mais profunda sobre a reprodução sexual da planta.
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Visão Geral
Este protocolo fornece um método para avaliar o estado de fertilização em Arabidopsis por meio da análise da morfologia nuclear dos espermatozoides. Permite a coleta rápida de dados para análise estatística, auxiliando na análise funcional de fatores de fertilização desconhecidos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia Vegetal
- Biologia Reprodutiva
- Biologia Celular
Antecedentes
- A dupla fecundação é um processo essencial em plantas com flores.
- O entendimento dos mecanismos de fecundação pode revelar reguladores desconhecidos.
- Arabidopsis atua como organismo modelo para o estudo da reprodução vegetal.
- A avaliação da morfologia dos núcleos espermáticos pode indicar o sucesso da fecundação.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para determinar o sucesso da fertilização em Arabidopsis.
- Facilitar a identificação de reguladores desconhecidos da fertilização.
- Permitir a coleta rápida de dados para análises posteriores.
Métodos Utilizados
- Microscopia de epifluorescência para visualizar núcleos de espermatozoides.
- Avaliação da morfologia nuclear para determinar o estado de fertilização.
- Análise estatística dos dados coletados.
- Treinamento em técnicas de manipulação de óvulos para obter resultados precisos.
Resultados Principais
- Identificação bem-sucedida do estado de fertilização com base na morfologia dos espermatozoides.
- Comprovada eficiência na coleta de dados para análise.
- Fornecido um arcabouço para o estudo de fatores de fertilização desconhecidos.
- Destacada a importância do manuseio do óvulo na metodologia.
Conclusões
- Este método é eficaz para avaliar a fertilização em Arabidopsis.
- Ele abre caminhos para explorar reguladores desconhecidos da fertilização.
- Estudos futuros podem se basear neste protocolo para análises funcionais.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A avaliação precisa do estado de fertilização em Arabidopsis por meio da morfologia nuclear dos espermatozoides fornece uma leitura rápida e quantitativa para a análise funcional de reguladores da fertilização. Esta abordagem permite triagem fenotípica em alto rendimento e avaliação estatística de genes ou fatores candidatos implicados na fertilização dupla. O método apóia a descoberta precoce e a redução de riscos mecanicistas na interseção da biologia reprodutiva vegetal e dos processos de engenharia de características.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a interrogatória fenotípica direta de reguladores candidatos da fertilização in vivo.
- Apóia a desmistificação mecanicista ao distinguir eventos de fertilização bem-sucedidos, parciais e fracassados.
- Facilita o triagem rápido de perturbações genéticas ou químicas que afetam a dupla fertilização.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece um ensaio padronizado, baseado em fluorescência, para quantificar os resultados da fertilização.
- Oferece pontos finais reprodutíveis, baseados em imagens, adequados para análise estatística e comparação entre estudos.
- Permite a triagem em larga escala de linhagens mutantes ou transgênicas para fenótipos de fertilização.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se com os objetivos translacionais ao vincular intervenções moleculares a resultados reprodutivos em um sistema modelo.
- Apoia a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica de alvos relacionados à fertilização.
- Oferece valor preditivo para estratégias de melhoria de características em biotecnologia agrícola quando adaptado adequadamente.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método se integra ao continuum de descoberta a validação para engenharia de características reprodutivas de plantas e genômica funcional.
- Biologia do Descobrimento: Permite testar hipóteses sobre reguladores da fertilização e componentes de vias.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas e reprodutíveis para o desenvolvimento de ensaios e triagem de mutantes.
- Análises: Permite comparação estatística de fenótipos de fertilização entre diferentes condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas mecanicistas à validação pré-clínica de características em sistemas modelo.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para análise funcional contínua de novos fatores de fertilização.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos e reduz a ambiguidade nos mecanismos de fertilização.
- Valor Operacional: Padroniza a avaliação fenotípica e permite a coleta rápida e escalável de dados.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou não prosseguir com reguladores candidatos e aprimora a alocação de recursos.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de intervenções genéticas ou químicas em fluxos de trabalho de biologia reprodutiva.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência no manuseio de Arabidopsis e microscopia de fluorescência.
- Requer acesso à infraestrutura de imagem por epifluorescência e análise de imagens.
- Necessita de protocolos padronizados para dissecação de óvulos e preparação de amostras.
- Pode exigir adaptação para uso em outras espécies vegetais ou sistemas modelo.
- Depende da disponibilidade de linhagens marcadoras fluorescentes para marcação dos núcleos espermáticos.
