Name: Réguas duplas do ADN para estudar o mecanismo da translocação ribosome com a definição do único-nucleotide (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Aprenda o ensaio de réguas duplas de ADN para estudar a translocação do ribossoma com resolução de nucleótido único. Este método avançado permite sondar ambos os lados do mRNA em complexos ribossómicos.

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Este trabalho é apoiado pelos institutos nacionais de saúde dos EUA (R01GM111452, Y.W., S.X.). Y. W. reconhece o apoio da Fundação Welch (E-1721).

1. preparação dos complexos ribosalguns
<ol><li>Fazer 1.000 mL de tampão TAM10, que consiste de 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM mg (OAc)2, 30 mm NH4CL, 70 mm KCl, 5 mM EDTA, 7 mm Bme (2-Mercaptoetanol), e 0, 5% Tween20.</li>
	<li>Prepare as cinco misturas indicadas na tabela 1. Nota: o Ribossome foi da cepa MRE60011. EF-tu: fator de alongamento termo instável. EF-TS: fator de alongamento Thermo estável. GTP: trifosfato de guanosina. PEP: fosho (enol) piruvato.</li>
	<li>Incubar as cinco misturas separadamente a 37 ° c por 25 min antes de fazer os complexos ribosalguns. Prepare os cinco complexos ribosalguns de acordo com a tabela 2. Nota: Post: post-translocation; Pré: pré-translocação.</li>
	<li>Adicione cada um dos cinco complexos ribosalguns em um coxim da sacarose de 1,1 M separada, com relação de volume 1:1. Purify cada um com 450.000 × g para 2 h em um ultra-centrifugador. Use um Pipet para remover o sobrenadante e restaure os complexos Ribossoma em-80 ° c após o ressuspensão da pelota com amortecedor TAM10.</li>
</ol>2. preparação de lâminas de vidro revestidas com biotina
<ol><li>Limpeza preliminar das lâminas de vidro<ol>
<li>Coloc 12 corrediças de vidro com dimensões de 60,0 × 4,0 × 0,3 milímetro3 (L × W × T) em um prato de vidro curto e largo.</li>
		<li>Encha o prato de vidro com acetona e proceda por 5 min. Em seguida, lave as lâminas com água ultrapura 5 vezes e encha 3/4 do prato com água.</li>
		<li>Adicionar 10 M Koh para encher o prato e proceda as lâminas de vidro para 20 min. Lave as lâminas com água 5 vezes.</li>
		<li>Adicione etanol e proceda por 5 min, despeje o etanol e, em seguida, seque-os separadamente a 300 ° c por 3 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Revestimento de aminosilane<ol>
<li>Coloque os 12 slides limpos de volta no prato de vidro contendo metanol. Limpe um balão de PEGylation com metanol por sonicating por 5 min, em seguida, preenchê-lo com 25 mL de metanol, 1,25 mL de água, 0,125 mL HAc, 0,25 mL 3-aminopropiltrietoxisilane (AMEO).</li>
		<li>Substitua imediatamente o metanol no prato de vidro com a solução AMEO preparada. Incubar à temperatura ambiente durante 30 min.</li>
		<li>Enxague as lâminas com água várias vezes e seque-as pela purga de nitrogênio. Coloque as lâminas secas em pratos de vidro limpos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>O PEGlation<ol>
<li>Prepare a solução NaHCO3 (8,4 mg/ml) e o tampão PEGylation (37,5 mg Peg, 6 mg de Peg biotinilado, 150 μL de solução NaHCO3 ). Misture bem girando a 6.000 rpm por 1 min.</li>
		<li>Coloque 25 μL de solução de PEG em cada slide. Cubra-o com o outro slide no topo. Certifique-se de que não há bolhas entre os dois slides.  Coloque os slides em uma caixa de dica de Pipet vazia. Certifique-se de que a caixa é nivelada e colocá-lo em uma gaveta escura por cerca de 3 h.</li>
		<li>Enxágüe as lâminas com água e seque novamente. Armazene as lâminas secas à temperatura ambiente vácuo por até 2 semanas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. preparação da amostra antes das medições magnéticas e de força
<ol><li>Máquina de uma amostra de plástico bem com dimensões 4 × 3 × 2 mm3 (L × W × D). Cole um pedaço de vidro revestido com biotina (aproximadamente 5 mm de comprimento, cortado dos slides de 60 mm de comprimento preparados na seção 2) na superfície inferior usando epóxi.</li>
	<li>Adicionar 20 μL de 0,25 mg/mL de solução aquosa de estreptavidina no poço da amostra e incubar à temperatura ambiente durante 40 min. Em seguida, enxague a amostra bem duas vezes com TAM10 buffer.</li>
	<li>Imobilize os complexos ribosalguns.<ol>
<li>Sem antibióticos: Use uma pipeta para remover o tampão da amostra bem, a seguir adicione 20 μl do complexo Ribossoma do μm 0,1 (MF-pre ou MF-borne) no poço da amostra. O complexo Ribossome vai ligar com o estreptavidina na superfície através da biotina 5 '-End no mRNA. Incubar a 37 ° c durante 1 h e enxaguar uma vez com o tampão TAM10 .</li>
		<li>Para o experimento utilizando neomicina e ácido fusídico: Incubar o complexo MF-pré com neomicina a 37 ° c por 10 min; Incubar EF-G com ácido fusídico a 37 ° c durante 20 min. As concentrações são as seguintes: 0,1 μm complexo Ribossome, 2 μm EF-G, 4 mm GTP, 4 mm Pep, 0, 2 mg/ml piruvato quinase, 0,2 mm neomicina, e 0,25 mm de ácido fusídico.</li>
		<li>Realize as outras experiências dos antibióticos similarmente. As concentrações são as seguintes: 0,2 mM viomicina, 0,4 mM higromicina B e 0,25 mM de ácido fusídico.</li>
		<li>Para estudo de ribossômica, repita os passos acima para os complexos mfnf-pre e mfnf-post envolvendo o motivo escorregadio U6A. Use antibióticos ácido fusídico mais neomicina, e ácido fusídico sozinho, respectivamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retire o tampão da amostra bem, em seguida, adicione 20 μL de 1 μm biotinylated sondagem DNA vertente e incubar à temperatura ambiente durante a noite. Enxague o duplex DNA-mRNA formado uma vez com o tampão TAM10 .</li>
	<li>Remova o buffer do poço de amostra. Em seguida, adicione 20 μL de 0,5 mg/mL de grânulos magnéticos revestidos com streptavidina no poço da amostra e incubar à temperatura ambiente durante 2 h.</li>
	<li>Insira cuidadosamente a amostra bem em um suporte e coloque-o em uma centrífuga. Retire as partículas magnéticas livres da superfície por centrifugação a 84 x g durante 5 min.</li>
</ol>4. medições magnéticas e de força
<ol><li>Ligar o laser<ol>
<li>Ligue o laser usando a chave. Em seguida, pressione o botão de energia.</li>
		<li>Ajuste a sensibilidade do amplificador de bloqueio 1 (LIA1) para 500 mV e aguarde cerca de 2 h para aquecer e estabilizar o magnetometro atômico.</li>
	</ol></li>
	<li>Configurando o magnetómetro atômico<ol>
<li>Execute o software de controle de instrumento e configure os parâmetros de medição. Alguns parâmetros podem variar ligeiramente em cada medição. Nota: o magnetometro atômico compreende um laser (descrito acima), um amplificador SR830 lock-in (referido como LIA1), um amplificador de bloqueio SR530 (referido como LIA2), DS345 (referido como FG1) e ATF20B (referidos como FG2) geradores de função, uma alta resolução motor e um computador. Todos estes devem ser ativados nesta etapa do protocolo.</li>
		<li>Configurar o modo de movimento do motor para ruído e posição predefinida para 0. Pressione o fechamento no painel dianteiro, ajusta a sensibilidade de LIA1 de volta a 200 mV.</li>
		<li>Ajuste a corrente e a tensão do laser e encontre o pico apropriado da ressonância e o nível do sinal-à-ruído. Pressione Sweep no painel frontal. Note que a relação amplitude/largura deve estar acima de 0,5 e o valor da fase deve ser inferior a 5 graus. Se não, refaça a etapa de varredura.</li>
		<li>Encaixe a saída de LIA2 ao gabarito do laser para travar sua freqüência. Este amplificador mede a rotação óptica de uma célula de césio auxiliar para manter a freqüência do laser na ressonância12. O estado permanece até o final da medição.</li>
		<li>Gerador de função plug-in FG2 para introduzir uma onda quadrada (500 mVpp, 100 mHz) como sinal de referência. A onda quadrada corresponde a 100 pinta e é usada para converter a saída atual do amplificador ao sinal magnético. Desligue o gerador de funções.</li>
		<li>Configurar o modo de movimento do motor para a posição de dois sentidos e padrão para 260 mm. Verifique o estado do controlador de temperatura para garantir a temperatura adequada (~ 37 ° c) do sensor atômico.</li>
		<li>Verifique a estabilidade de todo o sistema medindo os sinais do suporte de amostra vazio duas vezes. Avalie a estabilidade e o nível de ruído depois de subtrair os dois traços. O nível de ruído e a flutuação típicos devem ser ± 2 pT no tempo de integração de 30 ms.</li>
	</ol></li>
	<li>Magnetização da amostra<ol>
<li>Coloc delicadamente a amostra na estação da magnetização e deixe-a permanecer por 2 minutos. Nota: a estação de magnetização é constituída por um íman permanente (~ 0,5 T) e um espaçador de plástico.</li>
		<li>Coloque a amostra de volta no suporte da amostra. Use 335,4 × g força centrífuga para remover as partículas magnéticas não especificamente ligadas.</li>
	</ol></li>
	<li>Medições magnéticas após a aplicação de forças<ol>
<li>Use pinças para carregar a amostra no motor. Clique em Bloquear no painel frontal para executar o programa. Enquanto isso, use pinças para carregar a outra amostra no suporte e colocá-lo na centrífuga. Note que o lado de vidro revestido deve enfrentar o centro da centrífuga. Nota: a técnica de espectroscopia de magnetização remanescente induzida pela força (FIRMAS) é utilizada, que utiliza um magnetómetro atômico para medir o sinal magnético da amostra após a aplicação da força mecânica sobre as interações moleculares na amostra. Aqui, as interações moleculares estão entre as moléculas da régua do ADN e o mRNA no complexo ribossoma. A força é aumentada Stepwise aumentando a velocidade centrífuga. Depois de aplicar cada força, o motor traduz a amostra para o sensor atômico e, em seguida, move para trás. Daqui, dois perfis de campo magnético são obtidos, um durante a varredura para diante e o outro durante a varredura atrasada13. Nós usamos somente o último para extrair a altura máxima devido a sua melhor relação do sinal-à-ruído. A altura máxima na corrente (nA) é convertida à amplitude do sinal magnético (pinta) baseada na onda quadrada da calibração.</li>
		<li>Cada medição dura aproximadamente 5 min. Quando o motor voltar a 0, clique em salvar no painel frontal. Use cuidadosamente pinças para tirar amostras do motor e centrífuga. Use a velocidade inicial correspondente a 335,4 × g (2000 RPM, revolução por minuto para a centrífuga listada na tabela de materiais).</li>
		<li>Troque as duas amostras e aplique uma força mais forte aumentando a velocidade centrífuga em 100 rpm ou tamanho de etapa similar. Processe alternadamente para aumentar gradualmente a força; um espectro de força completo é obtido após 10-12 pontos de dados.</li>
	</ol></li>
	<li>Terminando o experimento<ol>
<li>Quando todas as experiências planejadas estiverem concluídas, desligue o equipamento, procedendo na ordem oposta à medida que ela foi ativada.</li>
		<li>Retire as amostras do suporte e mergulhe-as em etanol para limpeza e uso futuro. Limpe o suporte da amostra com acetona em caso de contaminação de grânulos magnéticos.</li>
	</ol></li>
	<li>Análise de dados<ol>
<li>Abra o script de análise do Python e insira todos os dados experimentais. Clique em carregar quadrado para inserir a onda quadrada como referência. Em seguida, clique em carregar linha de base para entrada sinal magnético residual como fundo.</li>
		<li>Defina a diminuição do sinal magnético geral como B0. Normalizar cada sinal magnético diminuir b para b0 e expressá-lo como uma porcentagem. Plotar a percentagem (B/B0) versus força centrífuga para obter o espectro de empresas. Nota: a força centrífuga F é calculada a partir da massa flutuante dos grânulos magnéticos m (4,6 × 10− 15 kg), velocidade centrífuga w e raio da centrífuga r (7,5 cm aqui) através da equação F = mw 2. º r. a resolução de força típica é 2-4 PN e faixa de força é 15-95 PN neste trabalho.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Noller, H. F., Lancaster, L., Mohan, S., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+structural+dynamics+in+translocation%3A+yet+another+functional+role+for+ribosomal+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Ribosome structural dynamics in translocation: yet another functional role for ribosomal RNA.</a> Quarterly Review of Biophysics. 50, 12(2017).</li>
<li>Zhou, J., Lancaster, L., Donohue, J. P., Noller, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+the+ribosome+hands+the+A-site+tRNA+to+the+P+site+during+EF-G-catalyzed+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">How the ribosome hands the A-site tRNA to the P site during EF-G-catalyzed translocation.</a> Science. 345, 1188-1191 (2014).</li>
<li>Grentzmann, G., Ingram, J. A., Kelly, P. J., Gesteland, R. F., Atkins, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual-luciferase+reporter+system+for+studying+recoding+signals%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A dual-luciferase reporter system for studying recoding signals.</a> RNA. 4, 479-486 (1998).</li>
<li>Fang, Y., Treffers, E. E., Li, Y., Tas, A., Sun, Z., van der Meer, Y., de Ru, A. H., van Veelen, P. A., Atkins, J. F., Snijder, E. J., Firth, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+-2+frameshifting+by+mammalian+ribosomes+to+synthesize+an+additional+arterivirus+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient -2 frameshifting by mammalian ribosomes to synthesize an additional arterivirus protein.</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 2920-2928 (2012).</li>
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<li>De Silva, L., Yao, L., Wang, Y., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Well-defined+and+sequence-specific+noncovalent+binding+forces+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Well-defined and sequence-specific noncovalent binding forces of DNA.</a> Journal of Physical Chemistry B. 117, 7554-7558 (2013).</li>
<li>Yin, H., Xu, S., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+DNA+rulers+reveal+an+%22mRNA+looping%22+intermediate+state+during+ribosome+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Dual DNA rulers reveal an "mRNA looping" intermediate state during ribosome translocation.</a> RNA Biology. 15, 1392-1398 (2018).</li>
<li>Tsai, T. W., Yang, H., Yin, H., Xu, S., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+%22-1%22+and+%22-2%22+ribosomal+frameshiftings+revealed+by+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">High-efficiency "-1" and "-2" ribosomal frameshiftings revealed by force spectroscopy.</a> ACS Chemical Biology. 12, 1629-1635 (2017).</li>
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<li>Kurkcuoglu, O., Doruker, P., Sen, T. Z., Kloczkowski, A., Jernigan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+structure+controls+and+directs+mRNA+entry%2C+translocation+and+exit+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">The ribosome structure controls and directs mRNA entry, translocation and exit dynamics.</a> Physical Biology. 5, 046005(2008).</li>
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<li>Jacks, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+ribosomal+frameshifting+in+HIV-1+gag-pol+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Characterization of ribosomal frameshifting in HIV-1 gag-pol expression.</a> Nature. 331, 280-283 (1988).</li>
<li>Schuwirth, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+the+bacterial+ribosome+at+3.5+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structures of the bacterial ribosome at 3.5 Å resolution.</a> Science. 310, 827-834 (2005).</li>
<li>Jia, H., Wang, Y., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+force+spectroscopy+reveals+ribosomal+motion+at+sub-nucleotide+steps%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Super-resolution force spectroscopy reveals ribosomal motion at sub-nucleotide steps.</a> Chemical Communications. 54, 5883-5886 (2018).</li>
</ol>

Nenhum conflito de interesse potencial foi relatado por autores.

Em nosso ensaio duplo da régua, os grânulos magnéticos jogam dois papéis essenciais. Primeiro, eles servem como os transdutores de força porque a força centrífuga é proporcional à sua massa flutuante. Em segundo lugar, os grânulos são portadores do sinal detectados por um magnetometer atômico, que seja atualmente o sensor magnético o mais exato. Combinando manipulação mecânica e detecção magnética, a técnica de empresas é capaz de resolver um grande número de interações moleculares com base em suas forças de dissociação ...

O deslocamento Biomolecular é um parâmetro fundamental no estudo do mecanismo das funções biológicas relacionadas. Um exemplo particular é o translocação Ribossome1,2, durante que o ribossoma se move por exatamente três nucleotídeos (NT) no RNA do mensageiro (mRNA) normalmente, e por um, dois, ou outros números de NT exceto três no caso de ribossômica. Conseqüentemente, uma definição do único-NT do sistema da régua molecular é exigida para distinguir os tamanhos diferentes da etapa. Um desafio maior é sondar o movimento Ribossome nos lados da entrada e da saída. Em outras palavras, somente com um sistema de régua dupla seremos capazes de revelar se o mRNA é suavemente rosqueado através do Ribossome, ou há etapas intermediárias em que os dois lados têm tamanhos de etapa diferentes levando a uma conformação de mRNA tornada ou em loop dentro do Ribossoma.
Vários métodos foram desenvolvidos para abordar o primeiro desafio de resolver diferentes passos no lado de saída do Ribossome (o 3 ' fim do mRNA). O ensaio de luciferase dupla resolve os diferentes quadros de leitura medindo as proporções das diferentes proteínas resultantes3,4. Só é aplicável para o 3 ' fim do mRNA e, portanto, insuficiente para fornecer um quadro completo de translocação. A espectrometria de massas pode analisar os diferentes fragmentos de peptídeos como consequência dos rearranjos de código correspondentes5. Mas não pode apontar a quantos NT o ribossoma movimentos no mRNA. O teste Toe-Printing é outro método comum que usa uma transcriptase reversa preparada na extremidade 3 '-distal para transacir o mRNA em direção ao Ribossome6. No entanto, não é aplicável para o 5 ' fim do mRNA que está entrando no Ribossome. Outras técnicas, incluindo abordagens de molécula única e métodos de fluorescência7, são difíceis de alcançar a resolução de NT único.
Nós desenvolvemos o ensaio duplo da régua do ADN que pode excepcionalmente determinar as posições da entrada e da saída do mRNA descoberto em complexos de ribosome-mRNA.  Os DNAs da régua são oligômeros do ADN que formam duplex de determinados números dos emparelhadas (BP) com o mRNA descoberto pelo ribosome, não obstante que extremidade do mRNA. Os números BP então revelam precisamente a posição Ribossome no mRNA durante a translocação. Os números de BP dos duplex são determinados por suas forças críticas da dissociação obtidas da espectroscopia de magnetização remanescente induzida pela força (firmas)8. Com a incerteza da força de 2-3 pN, as forças críticas são suficientes para oferecer a definição do único-NT. Implementando uma molécula do linker nas réguas do ADN, o lado aberta impedido do mRNA pelo Ribossoma pode ser sonhado. Os deslocamentos ribosomal diferentes podem assim ser resolvidos exatamente. Nós revelamos com sucesso um conformação em loop original do mRNA prendido por antibióticos durante o translocação9, e os frames de leitura diferentes resolvidos que coexistiram em uma seqüência escorregadia do mRNA10. Este artigo descreve os detalhes do ensaio duplo da régua, que incluem a preparação dos complexos Ribossoma, a funcionalização de superfície das corrediças de vidro, a imobilização dos complexos Ribossoma e sua hibridação com a régua magneticamente etiquetada do ADN moléculas, detecção magnética e análise do espectro de força por empresas.

<table><tbody><tr><td>Tira de estireno</td><td>Cidade da Indústria</td><td>MS-861</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de vidro Revestimentos</td><td>evaporados</td><td></td><td>60,0 &vezes; 4,0 &vezes; 0,3 mm3</td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Millipore Sigma</td><td>A6283-500ML</td><td></td></tr><tr><td>3-Aminopropiltrietoxissilano</td><td>UCT especialidades</td><td>21400088</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-SVA</td><td>Laysan Bio</td><td>154-82</td><td></td></tr><tr><td>Biotina-PEG-SVA</td><td>Laysan Bio</td><td>152-84</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Millipore Sigma</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Cola epóxi</td><td>Devcon</td><td>31345</td><td></td></tr><tr><td>Estreptavidina</td><td>ThermoFisher</td><td>434301</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fusídico</td><td>Millipore Sigma</td><td>F0756-1G</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de neomicina</td><td>Millipore Sigma</td><td></td><td></td>1458009</tr><tr><td>Sulfato de Viomicina</td><td>Millipore Sigma</td><td>1715000</td><td></td></tr><tr><td>Higromicina</td><td>invitrogen</td><td>10687-010</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>T5941-100G</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de magnésio</td><td>Millipore Sigma</td><td>M5661-50G</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de amônio</td><td>Millipore Sigma</td><td>A9434-500G</td><td></td></tr><tr><td>Potássio cloreto</td><td>Millipore Sigma</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>GIBCO</td><td>774750</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Millipore Sigma</td><td>M6250-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Millipore Sigma</td><td>P1379-250ML</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Millipore Sigma</td><td>G8877-100MG</td><td></td></tr><tr><td>PEP</td><td>Millipore Sigma</td><td>P7127-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato Quinase</td><td>Millipore Sigma</td><td>P1506-5KU</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose&nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>S7903-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 Streptavidin</td><td>ThermoFisher</td><td>11205D</td><td></td></tr><tr><td>mRNA Oligo</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>133899727</td><td>5&prime;-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UUA AAU UAA UAA AAA GGA AAU AAAA AUG UUU AAU UUU UUA GGG CGC AAU CUA CUG CUG AAC UC-3&prime; &nbsp;</td></tr><tr><td>DNA Oligo Integrated</td><td>DNA Technologies</td><td>157468630</td><td>3?- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5?&nbsp;</td></tr><tr><td>Tecnologias integradas oligo</td><td>do ADN</td><td>164845370</td><td>3?-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5' &nbsp;</td></tr><tr><td>Tecnologias</td><td>de DNA Oligo Integradas</td><td>DNA 157468628</td><td>3?-AAA ATC CCG CGT TAG AAC UGG GG/TEGBio/-5' &nbsp;</td></tr><tr><td>Tecnologias integradas</td> <td>oligo do ADN</td><td>163472705</td><td>3?-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5' &nbsp;</td></tr><tr><td>Tecnologias</td><td>de DNA Oligo Integradas</td><td>DNA 138678130</td><td>3?-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5'</td></tr><tr><td>Tecnologias integradas</td> <td>de DNA oligo</td><td>DNA 138678131</td><td>3?-T AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5' &nbsp;</td></tr><tr><td>DNA Oligo Integrated</td><td>DNA Technologies</td><td>138678132</td><td>3?-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5?&nbsp;</td></tr><tr><td>Tecnologias</td><td>de DNA Oligo Integradas</td><td>DNA 138678133</td><td>3?-GTT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5' &nbsp;</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5427R</td><td></td></tr><tr><td>Micro Ultracentrífuga</td><td>Hitachi</td><td>CS150FNX</td><td></td></tr><tr><td>Misturador de vórtice</td><td>VWR</td><td>VM-3000</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador de bloqueio</td><td>Stanford Research Systems</td><td>SR530</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador de bloqueio</td><td>Stanford Research Systems</td><td>SR830</td><td></td></tr><tr><td>Laser</td><td>Newport</td><td>TLB-6918-D</td><td></td></tr><tr><td>Gerador de função</td><td>Stanford Research Systems</td><td>DS345</td><td></td></tr><tr><td>Detectores fotográficos</td><td>Thorlabs</td><td>DET36A</td><td></td></tr></tbody></table>

réguas duplas do adn para estudar o mecanismo da translocação ribosome com a definição do único-nucleotide

Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution

A translocação Ribossome refere-se ao movimento ribossômico no mRNA por exatamente três nucleotídeos (NT), que é o passo central na síntese proteica. Para investigar o seu mecanismo, existem dois requisitos técnicos essenciais. Primeiro é a resolução de NT único que pode resolver translocação normal de frameshifting, durante o qual o Ribossome move por outros de 3 NT. A segunda é a capacidade de sonda tanto os lados de entrada e saída do mRNA, a fim de elucidar todo o quadro de translocação. Nós relatamos o ensaio duplo da régua do ADN que é baseado nas forças críticas da dissociação de duplexes do ADN-mRNA, obtidos pela espectroscopia de magnetização remanescente força-induzida (FIRMAS).  Com resolução de força de 2-4 pN, o ensaio de régua dupla é suficiente para distinguir diferentes etapas de translocação. Implementando um linker longo nos DNAs de sondagem, podem alcangar o mRNA no lado oposto do ribosome, de modo que a posição do mRNA possa ser determinada para ambos os lados. Conseqüentemente, o ensaio duplo da régua é serido excepcionalmente para investigar a translocação Ribossoma, e o movimento ácido nucleico geralmente. Nós mostramos resultados representativos que indicaram um conformação em loop do mRNA e resolveram o translocação normal do frameshifting.

A Figura 1 mostra o esquema de detecção e as fotografias dos componentes principais. A detecção magnética é alcançada por um magnetómetro atômico utilizando o esquema de digitalização (Figura 1a)13. A amostra é colocada sobre uma haste montada em um motor linear. O motor transporta a amostra ao sensor atômico dentro de um escudo magnético, a seguir de volta ao local original para descarregar. O magnetometro atômico detect...

O ensaio duplo da régua do ADN é desenvolvido para determinar a posição do mRNA durante a translocação Ribossoma, que confia nas forças da dissociação dos duplexes dados forma do ADN-mRNA. Com a definição e a capacidade single-nucleotide de alcangar ambas as extremidades do mRNA, pode fornecer introspecções mecanicista para o translocação e a sonda Ribossoma outros deslocamentos do ácido nucleico.

Réguas duplas do ADN para estudar o mecanismo da translocação ribosome com a definição do único-nucleotide

The ribosome translocation refers to the ribosomal movement on the mRNA by exactly three nucleotides (nt), which is the central step in protein synthesis. ...

O ensaio da régua de DNA duplo pode fornecer insights mecanicistas para translocação ribossosome e sondar outros deslocamentos de ácido nucleico. Nosso ensaio de régua de DNA duplo é atualmente o único método que pode sondar objetivamente os lados de entrada e saída do mRNA nos complexos ribossomos com resolução de nucleotídeos únicos. Métodos semelhantes também são aplicados para medir a força de ligação de DNA e a seletividade de drogas quimioterápicas.A demonstração visual do método é uma boa chance para mostrarmos intuitivamente as vantagens de nossa técnica e ajudarmos outros pesquisadores a desenvolvê-lo ainda mais em mais aplicações. Para começar, faça uma amostra de plástico bem com uma tira de estireno perfurando um cubo no centro com dimensões de quatro milímetros por três milímetros por dois milímetros. Em seguida, usando epóxi, cole um pedaço de vidro revestido de biotina, de aproximadamente cinco milímetros de comprimento, para a superfície inferior.Adicione 20 microlitadores de 0,25 miligramas por mililitro streptavidin solução aquosa na amostra bem, e incubar em temperatura ambiente por 40 minutos. Em seguida, enxágue bem a amostra duas vezes com tampão TAM10. Para i

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Aqui nós descrevemos os instrumentos e métodos para a detecção de moléculas de proteína única fluorescently rotulados interagindo com uma única molécula de DNA suspenso entre duas microesferas opticamente presos.

Combinando uma única molécula de Manipulação e imagem para o estudo das interações proteína-DNA

Pinças ópticas têm sido usadas para estudar o dobramento de RNA esticando moléculas individuais de suas extremidades 5 'e 3'. Aqui são descritos procedimentos comuns para sintetizar moléculas de RNA para pinça, calibração do instrumento e métodos para manipular moléculas individuais.

NANOmanipulação de Solteiro RNA Moléculas por pinça óptica

Ribonucleotídeos estão entre os mais abundantes nucleotídeos não-canônicos incorporados do genoma durante a replicação do DNA nuclear eucariótica. Se não forem devidamente removidos, ribonucleotídeos podem causar mutagênese e dano do ADN. Aqui, apresentamos duas abordagens experimentais que são usadas para avaliar a abundância de incorporação de ribonucleotídeo DNA e seus efeitos mutagénicos.

Estudando ribonucleótido incorporação: Deteção de vertente específica de ribonucleotídeos no genoma da levedura e mutagênese induzida pela ribonucleotídeo de medição

a microscopia da localização da único-molécula 3D é utilizada para sondar as posições espaciais e as trajetórias do movimento de proteínas cDNAs etiquetadas em pilhas bacterianas vivas. O protocolo de análise experimental e de dados descrito neste documento determina os comportamentos diffusivos prevalentes de proteínas citosómicas baseadas em trajetórias unimoléculas agrupadas.

Microscopia de seguimento da único-molécula-uma ferramenta para determinar os Estados diffusive de moléculas cytosolic

Descrito aqui é um método de litografia de nanosfera para fabricação paralela de guias de onda de modo zero, que são matrizes de nanoaperaturas em uma microscopia de vidro revestida de metal para imagens de moléculas únicas em concentrações de nano-a-micromolar de fluoroforos. O método aproveita a automontagem de cristal coloidal para criar um modelo de guia de onda.

Fabricação de guias de ondas de modo zero para microscopia de molécula única de alta concentração

Aqui descrevemos os estágios de coleta e preparação da amostra para RIBO-seq em bactérias. O sequenciamento das bibliotecas preparadas de acordo com essas diretrizes resulta em dados suficientes para análise bioinformática abrangente. O protocolo que apresentamos é simples, utiliza equipamentos de laboratório padrão e leva sete dias desde a lise até a obtenção de bibliotecas.

RIBO-seq em Bactérias: um Protocolo de Coleta de Amostras e Preparação de Bibliotecas para Sequenciamento NGS

Este protocolo apresenta um fluxo de trabalho experimental completo para estudar interações RNA-proteína usando pinças ópticas. Várias possíveis configurações experimentais são delineadas, incluindo a combinação de pinças ópticas com microscopia confocal.

Pinças ópticas para estudar interações RNA-proteína no regulamento de tradução

Transferência de energia de fluorescência de molécula única é um método que rastreia a dinâmica do tRNA durante a síntese de proteína ribossômica. Ao rastrear ribossomos individuais, são identificadas populações inhomogêneas, que lançam luz sobre mecanismos. Este método pode ser usado para rastrear mudanças conformacionais biológicas em geral para revelar relações de função dinâmica em muitos outros biossistemas complexos. Métodos de molécula única podem observar etapas limitantes sem taxa e...

Estudo de transferência de energia de fluorescência única da síntese de proteína ribossa

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Traduzindo ribossomos decodificam três nucleotídeos por codon em peptídeos. Seu movimento ao longo do mRNA, capturado pelo perfil ribossomo, produz as pegadas exibindo periodicidade trigêmea característica. Este protocolo descreve como usar o RiboCode para decifrar esse recurso proeminente de dados de criação de perfil ribossomos para identificar quadros de leitura abertos traduzidos ativamente no nível de transcriptome inteiro.

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O protocolo descreve o método de hibridização in situ de fluorescência sensível a polimorfismos de nucleotídeo único (SNP-FISH) para distinguir transcritos de RNA ribossômico derivados do locus de DNA ribossômico do cromossomo X ou Y em Drosophila melanogaster.

Detecção de FISH sensível ao polimorfismo de nucleotídeo único da transcrição de RNA ribossômico específico do locus em Drosophila melanogaster

Aprenda o ensaio de réguas duplas de ADN para estudar a translocação do ribossoma com resolução de nucleótido único. Este método avançado permite sondar ambos os lados do mRNA em complexos ribossómicos.

Réguas duplas do ADN para estudar o mecanismo da translocação ribosome com a definição do único-nucleotide

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