Réguas duplas do ADN para estudar o mecanismo da translocação ribosome com a definição do único-nucleotide

O ensaio da régua de DNA duplo pode fornecer insights mecanicistas para translocação ribossosome e sondar outros deslocamentos de ácido nucleico. Nosso ensaio de régua de DNA duplo é atualmente o único método que pode sondar objetivamente os lados de entrada e saída do mRNA nos complexos ribossomos com resolução de nucleotídeos únicos. Métodos semelhantes também são aplicados para medir a força de ligação de DNA e a seletividade de drogas quimioterápicas.

A demonstração visual do método é uma boa chance para mostrarmos intuitivamente as vantagens de nossa técnica e ajudarmos outros pesquisadores a desenvolvê-lo ainda mais em mais aplicações. Para começar, faça uma amostra de plástico bem com uma tira de estireno perfurando um cubo no centro com dimensões de quatro milímetros por três milímetros por dois milímetros. Em seguida, usando epóxi, cole um pedaço de vidro revestido de biotina, de aproximadamente cinco milímetros de comprimento, para a superfície inferior.

Adicione 20 microlitadores de 0,25 miligramas por mililitro streptavidin solução aquosa na amostra bem, e incubar em temperatura ambiente por 40 minutos. Em seguida, enxágue bem a amostra duas vezes com tampão TAM10. Para imobilizar os complexos ribossomos sem antibióticos, primeiro remova o tampão da amostra bem, e adicione 20 microliters de 0,1 micromolar MF-Pre ou MF-Post ribossome complexo na amostra bem.

Incubar a 37 graus Celsius por uma hora e enxaguar uma vez com tampão TAM10. O complexo ribossomo agora se liga com o streptavidin na superfície através da biotina final de cinco primes no mRNA. Para o experimento usando antibióticos, incubar nove microlitrais do complexo MF-Pre com um microliter de quatro milimolar neomicina, 37 graus Celsius por 10 minutos.

Em seguida, misture em um tubo 0,6 microliters de 60 micromolar EFG, 0,8 microlitres de 100 micromolar GTP, 0,8 microliters de 100 milimilhas PEP, 0,3 microliters de 1,3 miligramas por piruida quinase, 6,43 microliters TAM10 tampão, e um microlitr de cinco mililam de ácido fusídico. Incubar a 37 graus Celsius por 20 minutos. Em seguida, misture as duas misturas e incubar a 37 graus Celsius por mais cinco minutos.

Realizar os outros experimentos com antibióticos da mesma forma, com concentrações de 0,2 milimônios de viomicina, 0,4 milimolar de higromicina B e 0,25 milimiliar de ácido fusídico. Para estudo de mudança de quadro, repita a incubação para os complexos MFNF-Pre envolvendo o motivo escorregadio, U6A. Inclua antibióticos de ácido fusídico mais neomicina.

Tempo suficiente é necessário para garantir a conclusão do processo de hibridização. Também é aconselhável usar o tampão TAM10 com cloreto de sódio de uma toupeira real para manter um sistema homosteady. Após a incubação, remova bem o tampão da amostra.

Adicione 20 microliters de um micromolar biotiniling sondando o fio de DNA, e incubar à temperatura ambiente durante a noite. Pela manhã, enxágue o dna/mRNA duplex formado uma vez com tampão TAM10. Remova bem o tampão da amostra.

Em seguida, adicione 20 microlitadores de 0,5 miligramas por mililitro streptavidin-coated contas magnéticas na amostra bem, e incubar à temperatura ambiente por duas horas. Depois disso, insira cuidadosamente a amostra bem em um suporte, e coloque-a em uma centrífuga para remover as partículas magnéticas livres da superfície a 84 vezes g durante cinco minutos. Ligue o laser.

Em seguida, pressione o botão de alimentação. Ajuste a sensibilidade para 500 milvolts, e espere cerca de duas horas para aquecer e estabilizar o magnetômetro atômico. Para configurar o magnetômetro atômico, execute o software de controle de instrumentos e configure o modo de movimento do motor para ruído e posição padrão a zero.

Pressione lock no painel frontal. Ajuste a sensibilidade para 200 milvolts. Ajuste a corrente e a tensão do laser e encontre o pico de ressonância adequado e o nível de ruído de sinal para a melhor resolução do sinal.

Pressione varrer no painel frontal. Certifique-se de que a relação amplitude-largura está acima de 0,5 e o valor de fase é menor que cinco graus com largura inferior a 170 hertz. Conecte a saída de outro amplificador de travamento SR530 ao feedback do laser para travar sua frequência.

Ligue o gerador de função ATF20B para inserir uma onda quadrada de 500 milivolts de pico ao pico, 100 milihertz como sinal de referência para converter corrente em sinal magnético. Em seguida, desligue o gerador de função. Configure o modo de movimento motor para posição de duas vias e padrão para 260 milímetros.

Verifique o estado do controlador de temperatura, para garantir que a temperatura esteja em aproximadamente 37 graus Celsius, do sensor atômico. Verifique a estabilidade de todo o sistema duas vezes executando diretamente o programa sem carregar amostras para medir os sinais do suporte de amostra vazio. Para magnetizar as amostras, use delicadamente pinças para retirar a amostra do suporte e coloque no estágio de magnetização por dois minutos.

Em seguida, coloque a amostra de volta no suporte da amostra e centrífuga a 335,4 vezes g por 20 minutos. Remova as partículas magnéticas não especificamente ligadas. Em seguida, carregue a amostra no motor com pinças.

Clique em Bloquear no painel frontal para executar o programa. Enquanto isso, use pinças para carregar outra amostra no suporte e colocá-la na centrífuga. Faça o lado de vidro revestido de frente para o centro da centrífuga, e inicie a centrifugação a 335,4 vezes g por quatro minutos.

Quando o motor voltar a zero, depois de aproximadamente cinco minutos, clique em Salvar no painel frontal. Use cuidadosamente pinças para transferir uma amostra do motor para o suporte da centrífuga. Aplique uma força mais forte aumentando a velocidade centrífuga em 100 rpm ou um tamanho de passo semelhante.

Troque a amostra pela centrífuga. Processe alternadamente para aumentar gradualmente a força a cada vez. Um espectro de força completo é obtido após 10 a 12 pontos de dados.

Quando todos os experimentos planejados estiverem concluídos, desligue o equipamento, procedendo na ordem oposta à medida que estava ligado. Remova as amostras do suporte e mergulhe-as no etanol para limpeza e uso futuro. Limpe o suporte da amostra com acetona em caso de contaminação magnética das contas.

Neste protocolo, o complexo ribossomo foi imobilizado na superfície, através da extremidade cinco-prime do mRNA, e tornou o lado cinco-prime e três-prime facilmente acessível para os governantes de DNA sondagem. Quando o linker para o lado cinco-prime tinha mais de 50 timina, um forte sinal magnético foi detectado, indicando formação bem sucedida de duplexes de DNA/mRNA. Variando o número de nucleotídeos no DNA, a correlação da força de dissociação ao comprimento duplex foi alcançada para os lados de três prime e cinco primos, respectivamente.

Os resultados da translocação normal de MF-Pre para MF-Post, na ausência de antibióticos, mostram que o ribossomo se moveu por três nucleotídeos em direção à extremidade três-prime em ambos os lados. MF-Pre carregava um fMet-tRNA e fenilalanine-tRNA nos locais P e A, respectivamente, enquanto MF-Post carregava fMet-tRNA e fenillanine-tRNA nos locais E e P, respectivamente, com um local A vago. No entanto, quando tanto o ácido fusídico quanto os antibióticos de adiomicina estavam presentes, o ribossomo se movia por apenas um nucleotídeo no lado cinco-prime, mas dois nucleotídeos no lado três-prime.

Após a lavagem dos antibióticos, a translocação normal ocorreu, como evidenciado por três movimentos nucleotídeos dos lados cinco-prime e três-prime. Ao magnetizar a amostra, a superfície revestida deve se aproximar e deixar o ímã verticalmente. E remover as partículas magnéticas não especificamente ligadas é muito importante para a precisão e qualidade dos dados.

Nossa técnica fornece uma alta resolução e uma maneira geralmente aplicável de investigar o deslocamento molecular do ácido nucleico que é amplamente encontrado na biologia molecular.