Name: Uso de ensaios de entrada viral e análise de ancoragem molecular para a identificação de candidatos antivirais contra coxsackievirus a16 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: Aprenda a identificar candidatos antivirais contra coxsackievirus A16 usando ensaios de entrada viral e análise de ancoragem molecular. Este método sistemático auxilia na descoberta de inibidores de entrada viral.

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Os autores são gratos ao Dr. Joshua Beckham na Universidade de Texas em Austin para o apoio técnico com encaixe molecular. Este estudo foi parcialmente apoiado pelo financiamento do Ministério da ciência e tecnologia de Taiwan (MOST107-2320-B-037-002 para C.-JL e L.-T.L.; MOST106-2320-B-038-021 e MOST107-2320-B-038-034-MY3 a L.-T.L.).

Nota: Todas as infecções da cultura e do vírus de pilha devem ser conduzidas em capas certificadas da Biossegurança que são apropriadas para o nível da biossegurança das amostras que estão sendo tratadas. As duas classes de Tanina de pequenas moléculas de Ácido Chebulágico (CHLA) e punicalagina (PUG), que foram observadas para bloquear eficientemente a infecção por CVA169, são usadas como exemplos de agentes inibitórios candidatos. Para princípios básicos em técnicas de virologia, propagação de vírus, determinação de titer de vírus e conceitos de unidades formadoras de placas (PFU) ou multiplicidade de infecção (MOI), o leitor é encaminhado para referência10.
1. cultura da pilha, preparação do vírus, preparação composta, e Cytotoxicity composto
<ol><li>As células de rabdomiossarcoma humano (RD) são células hospedeiras permissivas à infecção por CVA1611. Aumente as células de RD em 10 mL do meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com soro bovino fetal a 10% (FBS), 200 U/mL de penicilina G, 200 μg/mL de estreptomicina e 0,5 μg/mL de anfotericina B em frascos T-75 a 37 ° c em uma incubadora de 5% CO2</li>
	<li>Prepare CVA16 propagando o vírus em pilhas do RD e determine o Titer viral em PFU/mL. Para o protocolo aperfeiçoado, refira por favor a referência11.</li>
	<li>Prepare os compostos e controles de teste usando seus respectivos solventes: por exemplo, dissolver CHLA e PUG em dimetil sulfóxido (DMSO). Para todas as etapas da infecção, o meio basal consistiu em DMEM mais 2% FBS e antibióticos. Nota: A concentração final de DMSO nos tratamentos compostos de teste é igual ou inferior a 0,25% nos experimentos; 0,25% DMSO é incluído como um tratamento de controle negativo nos ensaios para a comparação.</li>
	<li>Realizar ensaio de citotoxicidade dos compostos de teste nas células de RD usando uma viabilidade celular determinando reagente como XTT ((2,3-bis [2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil] -5-phenylamino)-carbonilo]-2H-hidróxido de tetrazólio). Para o protocolo detalhado, refira por favor a referência12. Determine as concentrações de citotoxicidade dos compostos de teste usando um software analítico como o GraphPad Prism de acordo com o protocolo do fabricante. As concentrações de fármacos que não influenciam significativamente a viabilidade celular (≥ 95% de células viáveis) são utilizadas para o restante do estudo.</li>
</ol>2. teste de tempo de adição de drogas
<ol><li>
Avaliar a influência de fármacos nas células hospedeiras antes da infecção viral (pré-tratamento)
	<ol>
<li>Células de RD de semente em placas de 12 poços em uma densidade de semeadura de 2 x 105 células/poço. Incubar durante a noite a 37 ° c em uma incubadora de 5% CO2 para obter uma monocamada.</li>
		<li>Trate as células de RD com compostos de teste em concentrações não citotóxicas (determinadas a partir da etapa 1,4) em 1 mL de volume de mídia basal por 1 h ou 4 h.</li>
		<li>Células de lavagem com 1-2 mL de PBS antes de adicionar 50 PFU/poço de vírus no meio basal (volume final do iníbulo é 300 μL) para 1 h. agitar a placa a cada 15 min.</li>
		<li>Após a infecção, lave as monocamadas novamente usando PBS, em seguida, sobrepor com 1 ml de mídia basal contendo 0,8% metilcelulose para incubação mais a 37 ° c em uma incubadora de co2 de 5%.</li>
		<li>Após 72 h de incubação, retire a mídia de sobreposição e lave os poços usando 2 mL de PBS.</li>
		<li>Fixar os poços usando 0,5 mL de formaldeído 37% por 15 min.</li>
		<li>Retire o sobrenadante e lave novamente usando PBS.</li>
		<li>Manchar os poços usando 0,5 mL de 0,5% de solução de cristal violeta. Em seguida, retire a solução de mancha dentro de 2 min e lave os poços com um fluxo suave de água antes da secagem do ar.</li>
		<li>Conte as chapas virais colocando a placa em uma caixa de luz branca. Calcule o percentual (%) Infecção CVA16 como segue: (média # de placa Virus + droga /média # de placa Virus + DMSO controle) × 100%.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Para avaliar o efeito da adição dos fármacos e do vírus concomitantemente (coadição)
	<ol>
<li>Células de RD de semente em placas de 12 poços em uma densidade de semeadura de 2 x 105 células/poço. Incubar durante a noite a 37 ° c em uma incubadora de 5% CO2 para obter uma monocamada.</li>
		<li>Trate as células de RD com os compostos de teste nas concentrações apropriadas e 50 PFU/poço de CVA16 (volume final do iníbulo é 300 μL) simultaneamente para 1 h. agitar a placa a cada 15 min.</li>
		<li>Lave as células com 1 mL de PBS e, em seguida, sobrepor-se com 1-2 mL de meios basais contendo 0,8% de metilcelulose para posterior incubação a 37 ° c em uma incubadora de 5% CO2 .</li>
		<li>As chapas virais da mancha com violeta de cristal após a infecção do borne de 72 h e determinam a infecção de% CVA16 como descrita acima.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Avaliar o efeito do tratamento medicamentoso após a entrada viral (pós-infecção)
	<ol>
<li>Células de RD de semente em placas de 12 poços em uma densidade de semeadura de 2 x 105 células/poço. Incubar durante a noite a 37 ° c em uma incubadora de 5% CO2 para obter uma monocamada.</li>
		<li>Inocular as células de RD com 50 PFU/poço de CVA16 (volume final do inátodo é 300 μL) para 1 h. agitar a placa a cada 15 min.</li>
		<li>Lave os poços com 1-2 mL de PBS e sobreponha as células com meios basais contendo 0,8% de metilcelulose e as concentrações apropriadas de compostos de teste.</li>
		<li>As chapas virais da mancha com violeta de cristal e contam após a infecção do borne de 72 h e determinam as incubações da infecção de% CVA16 descritas acima. Nota: Realize todas as lavas de PBS suavemente para evitar o levantamento das células.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ensaio de ligação à base de citometria de fluxo
<ol><li>Células de RD de semente em placas de 12 poços em uma densidade de semeadura de 2 x 105 células/poço. Incubar durante a noite em 37 ° c em uma incubadora de 5% CO2 para conseguir um monocamada.</li>
	<li>Pré-Chill a monocamada celular a 4 ° c por 1 h.</li>
	<li>Infectar células RD com CVA16 (MOI = 100) na presença e ausência dos compostos de teste por 3 h a 4 ° c. Nota: Realize a inoculação viral no gelo e a incubação que se seguiu em um refrigerador de 4 ° c para manter a temperatura a 4 ° c, o que permite a ligação viral, mas não a entrada.</li>
	<li>Remova o iníbulo do vírus e lave-o uma vez com 1-2 mL de PBS gelada.</li>
	<li>Levante as células adicionando 1 mL de tampão de dissociação gelo-frio aos poços no gelo por 3 min, antes de coletar as células e ressuscita-los em buffer de citometria de fluxo de gelo-frio (1X PBS mais 2% FBS).</li>
	<li>Lave as células duas vezes usando o tampão de citometria de fluxo gelado e fixe as células com 0,5 mL de paraformaldeído a 4% por 20 min no gelo.</li>
	<li>Lave as células usando PBS para remover quaisquer vírus não acoplados ou fracamente ligados e, em seguida, manchar as células com 1 mL de anticorpo VP1 (1:2000; diluído em PBS contendo 3% de BSA) no gelo por 1 h, seguido de incubação com um secundário Alexa 488-Conjugado IgG anti-mouse (1:250; diluído em PBS contendo 3% de BSA) no gelo durante 1 h. realize lavas de PBS (3 vezes) após cada tratamento de anticorpos.</li>
	<li>Ressuscita as células em 0,5 mL do tampão de citometria de fluxo de gelo-frio e executa a análise de citometria de fluxo em um citometro de fluxo usando procedimentos padrão. Apresente dados em histogramas usando o software associado e quantificar para representação de gráfico de barras.</li>
</ol>4. ensaio de inactivação viral
<ol><li>
Realize o ensaio de inactivação viral como descrito anteriormente12 utilizando as seguintes condições: -Uma concentração inicial de 106 pfu/ml de CVA16. -Monocamadas da pilha do RD em 12 placas do poço de uma densidade de semeadura de 2 x 105 pilhas/poço. -50-dobre a diluição para titulating para fora os compostos da droga tendo por resultado uma concentração final do vírus de 50 PFU/poço. -Lave as etapas usando 1-2 mL de PBS. -Sobreposição de mídia contendo 0,8% metilcelulose.</li>
	<li>Realize o leitura final da infecção viral usando a mancha violeta de cristal do procedimento viral das chapas como detalhado acima.</li>
</ol>5. análise de ancoragem molecular
<ol><li>Baixar moléculas 3D de compostos de teste de PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). Se as moléculas não tiverem uma estrutura 3D carregada, faça o download das estruturas 2D ou use a sequência de cordas SMILES e transforme-as em moléculas 3D através de um programa molecular (por exemplo, CORINA).</li>
	<li>Baixe a unidade de montagem biológica viral do RCSB Protein Data Bank (https://www.rcsb.org/) e prepare o modelo de estrutura viral usando um programa de biocomputação (por exemplo, UCSF Chimera). Por exemplo, no caso da estrutura de cristal de virion CVA16 maduro (PDB: 5C4W)3, exclua os solventes do arquivo PDB, substitua cadeias laterais incompletas usando dados da biblioteca Dunbrach 2010 Rotamer e adicione hidrogênios e encargos à estrutura como relatado anteriormente13. As metas de encaixe podem ser quaisquer proteínas virais relevantes para a análise pretendida com uma informação de montagem biológica (Protein Data Bank).</li>
	<li>
Os compostos de teste de doca para a unidade de vírus preparada usando, por exemplo, UCSF Chimera, e analisar os arquivos de saída com um software de visualização (por exemplo, autodock vina, PyMol):
	<ol>
<li>Carregue o arquivo composto de teste em UCSF Chimera como o ' ligand ' e realize o encaixe cego selecionando toda a proteína viral preparada como o ' receptor '. Use o mouse ou o trackpad do computador para redimensionar o volume de pesquisa para todo o ' receptor '. Em ' Opções avançadas ', permitir que o número de modos de ligação para ser no máximo. Os frames de encaixe serão classificados automaticamente da mais alta à mais baixa energia obrigatória.</li>
		<li>Opcional Além do encaixe cego, confinar o local de encaixe na proteína viral em regiões de interesse derivadas dos resultados de encaixe cego usando o mouse ou o trackpad novamente para reduzir o volume de pesquisa (por exemplo, 100 å x 100 å x 100 å). Esta etapa ajuda a confirmar os resultados de encaixe cego e aumenta a especificidade.</li>
		<li>Use um sistema gráfico molecular (por exemplo, PyMol) para analisar as posições dos modos de vinculação carregando o arquivo de encaixe. Encontre contatos polares do composto à proteína viral selecionando o ' ligand ' e identificando contatos polares com a opção "a todos os átomos"; examinar os resultados.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Legay, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatal+coxsackievirus+A-16+pneumonitis+in+adult%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Fatal coxsackievirus A-16 pneumonitis in adult.</a> Emerging Infectious Diseases. 13, 1084-1086 (2007).</li>
<li>Wang, C. Y., Li Lu,, Wu, F., H, M., Lee, C. Y., Huang, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatal+coxsackievirus+A16+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Infectious+Disease+Journal%22%5BJournal%5D)">Fatal coxsackievirus A16 infection.</a> Pediatric Infectious Disease Journal. 23, 275-276 (2004).</li>
<li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+coxsackievirus+A16+capsids+with+native+antigenicity%3A+implications+for+particle+expansion%2C+receptor+binding%2C+and+immunogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Structures of coxsackievirus A16 capsids with native antigenicity: implications for particle expansion, receptor binding, and immunogenicity.</a> Journal of Virology. 89, 10500-10511 (2015).</li>
<li>Nishimura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+P-selectin+glycoprotein+ligand-1+is+a+functional+receptor+for+enterovirus+71%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human P-selectin glycoprotein ligand-1 is a functional receptor for enterovirus 71.</a> Nature Medicine. 15, 794-797 (2009).</li>
<li>Yamayoshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scavenger+receptor+B2+is+a+cellular+receptor+for+enterovirus+71%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Scavenger receptor B2 is a cellular receptor for enterovirus 71.</a> Nature Medicine. 15, 798-801 (2009).</li>
<li>Yamayoshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+SCARB2-dependent+infection+by+coxsackievirus+A7%2C+A14%2C+and+A16+and+enterovirus+71%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Human SCARB2-dependent infection by coxsackievirus A7, A14, and A16 and enterovirus 71.</a> Journal of Virology. 86, 5686-5696 (2012).</li>
<li>Lin, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrolyzable+tannins+%28chebulagic+acid+and+punicalagin%29+target+viral+glycoprotein-glycosaminoglycan+interactions+to+inhibit+herpes+simplex+virus+1+entry+and+cell-to-cell+spread%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Hydrolyzable tannins (chebulagic acid and punicalagin) target viral glycoprotein-glycosaminoglycan interactions to inhibit herpes simplex virus 1 entry and cell-to-cell spread.</a> Journal of Virology. 85, 4386-4398 (2011).</li>
<li>Lin, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad-spectrum+antiviral+activity+of+chebulagic+acid+and+punicalagin+against+viruses+that+use+glycosaminoglycans+for+entry%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Broad-spectrum antiviral activity of chebulagic acid and punicalagin against viruses that use glycosaminoglycans for entry.</a> BMC Microbiology. 13, 187(2013).</li>
<li>Lin, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecules+targeting+coxsackievirus+A16+capsid+inactivate+viral+particles+and+prevent+viral+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Microbes+%26+Infections%22%5BJournal%5D)">Small molecules targeting coxsackievirus A16 capsid inactivate viral particles and prevent viral binding.</a> Emerging Microbes & Infections. 7, 162(2018).</li>
<li>Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFlint%2C+SJ+%22Principles+of+Virology%22">Principles of Virology</a>. , 3rd edn, ASM Press. (2008).</li>
<li>Velu, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BPR-3P0128+inhibits+RNA-dependent+RNA+polymerase+elongation+and+VPg+uridylylation+activities+of+Enterovirus+71%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">BPR-3P0128 inhibits RNA-dependent RNA polymerase elongation and VPg uridylylation activities of Enterovirus 71.</a> Antiviral Research. 112, 18-25 (2014).</li>
<li>Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+Viral+Entry+Assays+for+the+Identification+and+Evaluation+of+Antiviral+Compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds.</a> Journal of Visualized Experiments. , e53124(2015).</li>
<li>Lang, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DOCK+6%3A+combining+techniques+to+model+RNA-small+molecule+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">DOCK 6: combining techniques to model RNA-small molecule complexes.</a> RNA. 15, 1219-1230 (2009).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coxsackievirus+A16+utilizes+cell+surface+heparan+sulfate+glycosaminoglycans+as+its+attachment+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Microbes+%26+Infections%22%5BJournal%5D)">Coxsackievirus A16 utilizes cell surface heparan sulfate glycosaminoglycans as its attachment receptor.</a> Emerging Microbes & Infections. 6, 65(2017).</li>
<li>Waterhouse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SWISS-MODEL%3A+homology+modelling+of+protein+structures+and+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">SWISS-MODEL: homology modelling of protein structures and complexes.</a> Nucleic Acids Research. 46, W296-W303 (2018).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm conflito de interesses.

Neste relato, foram descritos os protocolos que são úteis para a identificação de candidatos antivirais que visam a entrada viral, em particular contra os não CVA16. Os ensaios são projetados de forma a dissecar os acontecimentos precoces durante a entrada viral, o que é útil para esclarecer o mecanismo (s) de ação e potencial alvo (s) da atividade antiviral dos agentes de teste. O "teste de tempo de adição de drogas" permite determinar amplamente o potencial alvo dos compostos de teste, por exemplo, as células hospedeir...

A doença da mão, do pé, e da boca (hfmd) é uma doença causada o mais geralmente pelo coxsackievirus A16 (CVA16) e pelo enterovírus 71 (EV71) em crianças novas. Recentemente, em toda a região da Ásia-Pacífico, houve um aumento significativo na HFMD induzida por CVA16. Embora os sintomas possam ser leves, podem ocorrer complicações graves que afetam o cérebro e o coração, com potencial fatalidade1,2. Atualmente, não há terapias antivirais licenciadas ou vacinações disponíveis para CVA16, e, portanto, há uma necessidade urgente de desenvolver estratégias antivirais para conter surtos futuros e as complicações associadas.
CVA16 é um vírus não-envelopado que tenha um capsídeo icosahedral montado dos pentâmeros que cada um contem 4 proteínas estruturais a saber VP1, VP2, VP3, e VP4. Circundando cada eixo cinco vezes no pentâmero é uma região ' Canyon ' que mostra como uma depressão e é notável por seu papel na ligação do receptor3. Na parte inferior deste Canyon encontra-se um bolso hidrofóbico na região VP1 que contém um ligante gordo natural chamado esfingosina (SPH). Receptores celulares, como a glicoproteína de P selectina humana ligante 1 (PSGL-1) e o membro da classe B do receptor de scavenger 2 (SCARB2), têm sido sugeridos para desempenhar um papel na ligação viral, deslocando este ligante que resulta em alterações conformacionais para o capsídeo e o subsequente ejeção do genoma viral na célula hospedeira4,5,6. A identificação de possíveis inibidores que bloqueiam os eventos sucessivos no processo de entrada viral pode fornecer estratégias terapêuticas potenciais contra a infecção por CVA16.
As etapas do ciclo de vida do vírus podem ser dissecadas por meio de abordagens experimentais como alvos para ajudar a identificar agentes antivirais específicos do modo. Uma análise da tempo--droga-adição examina o efeito do tratamento da droga em épocas diferentes durante a infecção viral, incluindo o pre-entry (adicionado antes da infecção do vírus), entrada (adicionado simultâneo à infecção do vírus), e borne-entrada (adicionado depois do Infeção pelo vírus)7. O impacto pode ser avaliado usando um ensaio de placa padrão, quantitando o número de chapas virais formadas em cada uma das condições de tratamento. O ensaio de ligação viral à base de citometria de fluxo determina se a droga impede o apego viral às células hospedeiras. Isto é conseguido deslocando a temperatura de 37 ° c, em que a maioria de infecções humanas do vírus ocorre, a 4 ° c, onde os virions podem se ligar à superfície da pilha do anfitrião mas são incapazes de incorporar as pilhas7. As partículas de vírus ligadas à membrana celular são então quantificadas por imunocoloração contra antígenos virais e avaliadas por citometria de fluxo. O ensaio de inativação viral, por outro lado, ajuda a avaliar potenciais interações físicas da droga com partículas de vírus livres, protegendo ou neutralizando os virions, ou causando agregações ou alterações conformacionais que os tornam inativos para interações subsequentes com a superfície celular do hospedeiro durante a infecção8,9. Neste experimento, o inuso viral é permitido incubar primeiro com a droga antes de ser diluído para titular para fora a droga antes de infectar a monocamada da pilha de anfitrião e de executar um ensaio padrão da chapa8. Finalmente, o encaixe molecular é uma ferramenta poderosa para prever locais potenciais da interação da droga na superfície do virion, incluindo as glicoproteínas virais dos vírus Envelopado e das proteínas virais do capsídeo dos vírus não-envelopado, usando o computacional Algoritmos. Isso ajuda a identificar os alvos mecanisticamente do modo de ação da droga e fornecer informações úteis que podem ser mais validadas por ensaios a jusante.
Recentemente, empregou-se os métodos descritos acima para identificar compostos antivirais que bloquearam eficientemente a infecção pelos não-envoltos CVA169. Nisto, os protocolos detalhados que foram usados são descritos e discutidos.

<table><tbody><tr><td>4% Paraformaldeído</td><td>Sigma</td><td>AL-158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488-conjugado anti-camundongo IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Anfotericina B</td><td>GIBCO</td><td>15290-018</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-VP1</td><td>Merck-Millipore</td><td>MAB979</td><td>Anti-Enterovírus 71 Anticorpo, reação cruzada com Coxsackie A16, clone 422-8D-4C-4D</td></tr><tr><td>Beckman Coulter Cytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td>FC500</td><td></td></tr><tr><td>Corina</td><td>Molecular Networks GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cristal violeta</td><td>Sigma</td><td>C3886-100G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>11995-040</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeído</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sal de heparina sódica</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensaio de toxicologia in vitro,</td><td>Sigma</td><td>TOX2</td><td></td>Metilcelulose à base de XTT</tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>M0512-100G</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7,4</td><td>GIBCO</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>GIBCO</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>PyMol</td><td>Schr&ouml; dinger</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UCSF Chimera</td><td>Universidade da Califórnia, São Francisco</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

uso de ensaios de entrada viral e análise de ancoragem molecular para a identificação de candidatos antivirais contra coxsackievirus a16

Use of Viral Entry Assays and Molecular Docking Analysis for the Identification of Antiviral Candidates against Coxsackievirus A16

Ensaios antivirais que examinam mecanisticamente a entrada viral são pertinentes para discernir em que etapa os agentes avaliados são mais efetivos e permitem a identificação de inibidores da entrada viral do candidato. Aqui, apresentamos as abordagens experimentais para a identificação de pequenas moléculas capazes de bloquear a infecção pelo coxsackievirus não envelopado A16 (CVA16) através da segmentação das partículas de vírus ou etapas específicas na entrada viral precoce. Os ensaios incluem a análise do tempo de adição de drogas, o ensaio de ligação viral à base de citometria de fluxo e o ensaio de inativação viral. Nós igualmente apresentamos um protocolo de encaixe molecular que utiliza proteínas do capsídeo do vírus para prever os resíduos potenciais alvejados pelos compostos antivirais. Estes ensaios devem ajudar na identificação de agentes antivirais candidatos que atuam na entrada viral. As direções futuras podem explorar esses possíveis inibidores para o desenvolvimento de drogas.

O teste de adição de tempo de fármaco é indicado na Figura 1 e mostra a influência do tratamento usando as pequenas moléculas CHLA e Pug na infecção CVA16 ou entrada pré-viral (pré-tratamento), durante a entrada viral (coadição), ou entrada pós-viral ( pós-infeção). Ambas as pequenas moléculas produziram apenas impacto marginal contra a infectividade do CVA16, seja no pré-tratamento das células hospedeiras antes da infecção viral (Figura ...

O objetivo do protocolo é ilustrar os diferentes ensaios relativos à entrada viral que podem ser utilizados para identificar os inibidores da entrada viral do candidato.

Uso de ensaios de entrada viral e análise de ancoragem molecular para a identificação de candidatos antivirais contra coxsackievirus a16

Antiviral assays that mechanistically examine viral entry are pertinent to discern at which step the evaluated agents are most effective, and allow for ...

Este protocolo pode ajudar na descoberta de potenciais moléculas antivirais através de uma abordagem orientada por mecanismos. O tempo de adição determina em que etapa da infecção a pequena molécula exibe sua atividade antiviral. Acoplamento molecular prevê a interação entre a pequena molécula e as proteínas virais.Para avaliar a influência de drogas em células hospedeiras antes da infecção viral, as células RD de sementes em placas de 12 poços em duas vezes 10 para as quintas células por densidade de revestimento de poços. Incubar as células a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono de 5% durante a noite. Na manhã seguinte, trate cada poço da monocamada RD com um composto de teste de interesse, em triplicado, em concentrações não tóxicas em um mililitro de meio basal por uma ou quatro horas.Ao final da incubação do tratamento, lave as células com um mililitro de PBS antes de adicionar 50 unidades de formação de placas de vírus em 300 microliters de meio basal por poço por uma hora, com balanço a cada 15 minutos. No final da incubação da infecção, lave as células com PBS e sobreponha as células com um mililitro de meio basal fresco contendo 0,8%de metilcelulose. Após 72 horas na incubadora de cultura celular, lave cada poço com dois mililitros de PBS e fixe as células com 0,5 mililitros de 37% de formaldeído por poço por 15 minutos.Ao final da fixação, lave os poços com PBS e manche as células com 0,5 mililitros de solução violeta cristalina de 0,5% por poço. Depois de dois minutos, lave os poços com um fluxo suave de água e deixe a placa secar. Em seguida, coloque a placa em uma caixa de luz branca para contar e calcule a porcentagem de células infectadas por coxsackievirus de acordo com a fórmula.Para análise de acoplamento molecular, baixe moléculas 3D dos compostos de teste do PubChem. Se uma molécula não tiver uma estrutura 3D carregada, baixe a estrutura 2D ou use a sequência de cordas SMILE para transformar a estrutura em uma molécula 3D através de um programa molecular apropriado. Em seguida, baixe uma unidade de montagem biológica viral do RCSB Protein Data Bank.Usando um programa de biocompputação adequado, exclua os solventes do arquivo Do Banco de Dados de Proteínas, substitua as cadeias laterais incompletas usando dados da biblioteca rotamer Dunbrack 2010 e adicione hidrogênios e cargas à estrutura como relatado anteriormente. Para encaixar os compostos de teste na unidade de vírus preparada, carregue o arquivo composto de teste na Quimera da Universidade da Califórnia em São Francisco como o ligante e selecione toda a proteína viral preparada como receptor para realizar acoplamento cego. Para acoplamento adicional, confine o local de acoplamento à proteína viral a regiões de interesse derivadas dos resultados de acoplamento cego, reduzindo ainda mais o volume de pesquisa.Em seguida, carregue o arquivo de acoplamento em um sistema gráfico molecular apropriado para analisar as posições do modo de ligação. Selecione o ligante para encontrar contatos polares do composto para a proteína viral, identificando os contatos polares com a opção de qualquer átomo. Ambas as pequenas moléculas testadas neste experimento representativo, produziram apenas um impacto marginal contra a infectividade coxsackievirus A16, seja no pré-tratamento das células hospedeiras antes da infecção viral ou no tratamento pós-infecção.Em contraste, as moléculas revogaram eficientemente a infecção em mais de 80% no tratamento de co-adição, sugerindo que os dois compostos são os mais eficazes quando estão simultaneamente presentes com as partículas do vírus na superfície celular hospedeira durante a infecção. A análise de ligação baseada em citometria de fluxo confirma que os dois taninos impediram a entrada de infectividade do coxsackievirus A16, impedindo a ligação de partículas virais às células hospedeiras. O acoplamento molecular dos taninos indica que ambos são previstos para se ligar na região do cânion do pentamer coxsackievirus, logo acima da entrada de bolso que contém o fator bolso e desempenha um papel importante para mediar a ligação de coxsackievirus e a entrada na célula hospedeira.Nestas projeções superficiais, podem ser observados os resíduos únicos previstos a partir dos contatos polares das pequenas moléculas ao redor da entrada do bolso, com asparagine-85, lysina-257 e asparagine-417 em comum entre os dois taninos. Para o acoplamento molecular, a topologia da proteína viral precisa ser levada em conta ao classificar os quadros de ligação. Experimentos adicionais podem incluir testar a atividade antiviral do composto em vírus recombinantes, com mutações nos aminoácidos descobertos para validar sua importância para a eficácia da droga.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra o ensaio de inativação viral, mostrando a avaliação do impacto dos agentes antivirais nas partículas virais.

Avaliando a eficácia de um composto de teste antiviral por meio de um ensaio de inativação viral

Este vídeo demonstra um ensaio de fixação viral para triagem de compostos antivirais. Usando o vírus da hepatite C geneticamente modificado e a luciferase, ele avalia os efeitos inibitórios na fixação viral, conforme indicado pela menor intensidade de luz em poços co-tratados em comparação com poços tratados apenas com o vírus.

Um ensaio de fixação viral para triagem de compostos antivirais

Este vídeo demonstra um ensaio para avaliar agentes antivirais que visam etapas específicas da entrada viral nas células hospedeiras e fusão com o endossomo. As células são incubadas a baixa temperatura e depois infectadas com HCV. A baixa temperatura permite a ligação viral às células hospedeiras, mas inibe a internalização via endocitose. O composto antiviral de teste é adicionado e as células são incubadas à temperatura fisiológica. Essa mudança para uma temperatura mais alta facilita a...

Um ensaio para avaliar o efeito dos compostos de teste na entrada e fusão viral em células hospedeiras

Três ensaios, incluindo o efeito citopático (CPE) baseado em ensaio, o ensaio de dose-resposta e (TOA) ensaio de Tempo-de-adição ter sido desenvolvido, optimizado e validado e utilizado para identificar novos medicamentos antivirais contra o vírus da febre catarral (VFC), bem como para determinar o possível mecanismo de ação-de-(MOA) para antivirais recentemente identificados.

Ensaios para a identificação de novos antivirais contra a febre catarral ovina vírus

Os ensaios in vitro para medir a replicação do vírus tem sido melhorada pelo desenvolvimento de vírus de RNA recombinantes que expressam luciferase ou outras enzimas capazes de bioluminescência. Aqui detalhamos uma triagem gasoduto de alto rendimento, que combina essas linhagens recombinantes de sarampo e vírus chikungunya para isolar os antivirais de amplo espectro de bibliotecas químicas.

Triagem de alta capacidade para amplo espectro químico Inibidores de Vírus RNA

Aqui, apresentamos um protocolo que examina etapas específicas da entrada viral para identificar e avaliar novos agentes antivirais.

No início virais Ensaios de entrada para a identificação e avaliação de compostos antivirais

O primeiro passo no ciclo de vida do arenavírus é a ligação de partículas virais às células hospedeiras. Relatamos um ensaio quantitativo baseado em (q)RT-PCR para detecção ultrassensível e quantificação de eventos de ligação ao arenavírus.

Ensaio altamente sensível para a medição do Anexo de células Arenavirus

Aqui, apresentamos os protocolos para identificar imunomoduladores 1) vírus-codificado que promovem a replicação de arbovírus e fatores do hospedeiro 2) eucariota que restringem a replicação de arbovírus. Esses métodos baseados em fluorescência e luminescência permitem aos investigadores para rapidamente obter leituras quantitativas de replicação de arbovírus em simplistas ensaios com baixa relação sinal-ruído.

Arbovírus infecções como ferramentas de triagem para a identificação de fatores Antiviral Viral de imunomoduladores e Host

Apresentamos um protocolo geral para identificar trechos curtos de sequências de proteínas homologous hospedeiras-patógenos (SSHHPS) incorporadas na poliproteína viral. SSHHPS são reconhecidos por proteases virais e direcionam a destruição direcionada de proteínas hospedeiras específicas por vários vírus do Grupo IV.

Análise do Grupo IV Viral SSHHPS usando métodos in vitro e em silico

O presente protocolo descreve novas ferramentas para ensaios de ligação ao SPR para examinar a ligação de CV-N ao AH, glicoproteína S, glicanos do tipo híbrido relacionados e oligossacarídeos com alto teor de manose. O SPR é usado para determinar o KD para ligar o CV-N dimérico ou monomérico a esses glicanos.

Engenharia de Agentes Antivirais via Ressonância de Plasmon de Superfície

Este artigo descreve a metodologia para gerar partículas pseudotipadas de SARS-CoV-2 usando um sistema repórter de luciferase e seu uso para identificar inibidores de entrada. Esses protocolos são demonstrados usando dois diferentes inibidores de entrada, uma proteína de fusão humana recombinante ACE2-Fc e o composto de pequenas moléculas arbidol.

Procedimentos para a Identificação de Inibidores de Entrada do SARS-CoV-2 como Potenciais Antivirais Utilizando Pseudovírus Baseados em MLV

Aprenda a identificar candidatos antivirais contra coxsackievirus A16 usando ensaios de entrada viral e análise de ancoragem molecular. Este método sistemático auxilia na descoberta de inibidores de entrada viral.

Uso de ensaios de entrada viral e análise de ancoragem molecular para a identificação de candidatos antivirais contra coxsackievirus a16 (Vídeo) | JoVE Journal

Uso de ensaios de entrada viral e análise de ancoragem molecular para a identificação de candidatos antivirais contra coxsackievirus a16

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