Name: Medindo a secreção relativa de insulina usando um substituto de luciferase co-secretado (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Aprenda a medir a secreção de insulina usando luciferase Gaussia em linhagens de células beta MIN6. Este ensaio rápido e de baixo custo acelera a descoberta de medicamentos para diabetes.

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Os autores agradecem a todos os membros atuais e antigos do laboratório de Cobb por trabalho valioso e discussões, e Dionne Ware para assistência administrativa. Michael Kalwat é apoiado por um juvenil diabetes Research Foundation SRA-2019-702-Q-R. Este trabalho foi possibilitido através da NIH R37 DK34128 e da Welch Foundation Grant I1243 para Melanie Cobb. As partes adiantadas deste trabalho foram apoiadas igualmente por um NIH F32 DK100113 a Michael Kalwat.

1. preparação de reagentes, suportes e amortecedores (tabela 1)
<ol><li>Prepare MIN6 mídia completa em 500 mL de alta glicose (4,5 g/L) o meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) com os seguintes aditivos: 15% soro fetal bovino (FBS), 100 unidades/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 292 μg/mL L-glutamina e 50 μM β-Mercaptoetanol. Nota: a linha celular estável neste caso é mantida em 250 μg/mL de antibiótico G418.</li>
	<li>Prepare o tampão de bicarbonato de Krebs-Ringer (KRBH) fazendo uma solução contendo 5 mM KCl, 120 mM NaCl, 15 mM HEPES (pH 7,4), 24 mM NaHCO3, 1 mm MgCl2, 2 mm CAcl2e 1 mg/ml radioimunoensaio-grau de albumina sérica bovina (BSA). A glicose deve ser adicionada quando especificado a partir de um estoque de 2 M. Nota: KRBH é utilizado para incubar as células com e sem estimulação, a fim de avaliar a insulina e/ou Gaussia luciferase secreção.</li>
	<li>Prepare a solução de estoque de Coelenterazina (CTZ) da seguinte maneira. Prepare o metanol acidificado adicionando 106 μL de HCl concentrado a 10 mL de metanol. Em seguida, dissolva a CTZ liofilizada em metanol acidificado a 1 mg/mL e armazene a-80 ° c em tubos com tampa de rosca. Nota: Estes estoques mantêm a atividade suficiente em ensaios rotineiros da luciferase, mesmo depois de 1 ano do armazenamento apropriado.</li>
	<li>Prepare o tampão do ensaio da luciferase de Gaussia (GLuc) baseado na literatura9 as well as a informação10 da patente para ajudar na meia-vida do ensaio da luciferase de Gaussia no formato da placa do poço 96. Use a fórmula: 25 mM TRIS pH 8, 1 mM EDTA, 5% glicerol, 1 mg/mL nd2po4, 300 mm ascorbato de sódio, 200 mm na2so3 em água. Congelar estoques em-20 ° c. Depois de descongelar, guarde o tampão a 4 ° c.</li>
	<li>Para preparar a solução de trabalho da Gaussia luciferase, adicione 4,2 μL/mL da solução em estoque de 1 mg/mL (2,36 mM) CTZ ao tampão do ensaio GLuc. Isso resulta em uma solução de trabalho 2x de 10 μM de CTZ que terá uma concentração final de 5 μM no ensaio.</li>
</ol>2. cultura de InsGLuc MIN6 células e semeadura para ensaios de secreção
<ol><li>Para cultura MIN6 células, Trypsinize e semente as células uma vez por semana usando técnicas de cultura de células padrão. Mude a mídia nas células a cada dois a três dias. Inclua o antibiótico de seleção apropriado, como 250 μg/mL de G418 na mídia.<ol>
<li>Para fornecer um número suficiente de células semanalmente para experimentos, mantenha as células em T75 frascos. Semeando 6 x 106 células por T75 em 10 ml de mídia normalmente produzirá 30 x 106 para 40 x 106 células total por T75 após 7 dias de cultura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para preparar as células para o revestimento em placas 96-well, lave um T75 confluente de células MIN6 InsGLuc duas vezes com PBS e adicione 2 mL de tripsina. Incubar a 37 ° c durante ~ 5 min ou até que as células se dissociem do balão. Determine a concentração de células por mililitro.<ol>
<li>Diluir as células na mídia completa para 1 x 106 células/ml para resultar em 1 x 105 células em 100 μl por poço em uma placa 96-bem. As células devem ser suficientemente confluentes para o ensaio após 3 – 4 dias. Nota: para estender o período da cultura, a metade da concentração da pilha pode ser chapeada. As alterações na mídia não são necessárias antes do dia do ensaio, a menos que as células devam ser submetidas a tratamentos experimentais.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. glicose-estimulado Gaussia luciferase ensaio de secreção
<ol><li>No dia do ensaio Prepare KRBH suficiente para o experimento (etapa 1,2). Um mínimo de 50 mL de KRBH por placa de 96 poços é necessário, portanto, prepare pelo menos 75 mL para garantir uma reserva suficiente para o experimento. Prepare o amortecedor extra se as combinações diferentes de condições do tratamento da droga exigirem KRBH para a diluição.</li>
	<li>Prepare um reservatório com KRBH sem glicose. Decantar o meio de 96-bem placa (s), invertendo rapidamente a placa sobre um dissipador de laboratório e, em seguida, blot firmemente em uma pilha de toalhas de papel para remover o excesso de meio.</li>
	<li>Usando uma pipeta eletrônica ou manual de 8 canais, Pipete 100 μL/poço KRBH do reservatório em toda a placa (s) de 96 poços. Repita para um total de duas lavas.</li>
	<li>(Etapa opcional de tratamentos compostos agudos) Se não estiver realizando tratamentos medicamentoso, prossiga com as etapas 3,5 e 3,6 sem modificação. Para testar os efeitos de pequenas moléculas na secreção de insulina, os compostos podem ser adicionados às células durante o período de pré-incubação, período de estimulação, ou ambos.<ol>
<li>Uma técnica é adicionar compostos em lote ao KRBH em tubos de 1,5 mL e usar uma pipeta digital ajustável de 8 canais para transferir a droga-KRBH dos tubos para as células em placas 96-well. Nota: se uma pipeta ajustável não está disponível, uma placa 96-well da réplica da medicina-KRBH pode ser feita e uma pipeta padrão de 8 canais pode ser usada para transferir o amortecedor. Outras modificações no paradigma do tratamento podem ser feitas para tratar as células por 24 h nos meios de comunicação prévio ao ensaio, conforme descrito anteriormente1,8.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicione 100 μL de KRBH contendo a concentração desejada de glicose ou compostos e coloque o prato na incubadora de 37 ° c por 1 h. Nota: dependendo do layout experimental, é extremamente útil ter uma pipeta multicanal eletrônica que permite a transição das distâncias do canal de uma coluna de oito tubos de 1,5 mL para as 8 fileiras de uma placa de 96 poços.</li>
	<li>Após o 1 h de pré-incubação, decantar o tampão no dissipador e borrar firmemente na toalha de papel. Adicionar 100 μL de KRBH sem glucose por poço para lavar o fundo acumulado da Gaussia luciferase. Decantar a placa novamente e adicionar condições de controle e estimulantes à placa em 100 μL por poço. Coloque o prato na incubadora de 37 ° c por 1 h.</li>
	<li>Colete cuidadosamente 50 μL de sobrenadante usando uma pipeta multicanal, alterando as pontas entre as condições de tratamento conforme necessário, e transfira o sobrenadante para uma placa de ensaio branco opaco limpa 96-bem. Nota: placas de fundo claro com paredes brancas podem ser usadas se necessário, embora uma quantidade significativa de sinal de luciferase seja perdida.</li>
	<li>Após a coleta de 50 μL de sobrenadante KRBH, a amostra pode ser ensaiada imediatamente. Se necessário, sele e armazene amostras em 4 ° c por alguns dias (meia-vida da atividade do gluc ~ 6 dias) ou-20 ° c por até um mês11,12.</li>
</ol>4. ensaio secretado da luciferase da Gaussia
<ol><li>Para preparar a solução de trabalho do ensaio GLuc, pipete a quantidade necessária de solução de estoque de CTZ (4,2 μL/mL) no tampão de ensaio GLuc. Para evitar aquecer o CTZ, pipete o CTZ rapidamente no congelador-80 ° c ou mantenha o tubo em gelo seco.</li>
	<li>Utilizando uma pipeta multicanal electrónica, adicione rapidamente 50 μL da solução de trabalho de ensaio GLuc por poço em todo o prato de 96 poços contendo os sobrenadantes KRBH recolhidos. Se houver qualquer gota nas laterais de qualquer poços, gire brevemente a placa em uma mesa-Top centrífuga swing-balde.</li>
	<li>Leia a luminescência em um leitor de placa adequado dentro de alguns minutos e ler cada poço com um tempo de integração de 0,1 s.</li>
</ol>

<ol><li>Kalwat, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+promoter-driven+Gaussia+luciferase-based+insulin+secretion+biosensor+assay+for+discovery+of+beta-cell+glucose-sensing+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Sensors%22%5BJournal%5D)">Insulin promoter-driven Gaussia luciferase-based insulin secretion biosensor assay for discovery of beta-cell glucose-sensing pathways.</a> ACS Sensors. 1 (10), 1208-1212 (2016).</li>
<li>Burns, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+luminescent+reporter+of+insulin+secretion+for+discovering+regulators+of+pancreatic+Beta-cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">High-throughput luminescent reporter of insulin secretion for discovering regulators of pancreatic Beta-cell function.</a> Cell Metabolism. 21 (1), 126-137 (2015).</li>
<li>Rajan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+processing+and+secretion+of+mutant+insulin+proteins+that+cause+permanent+neonatal+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">In vitro processing and secretion of mutant insulin proteins that cause permanent neonatal diabetes.</a> American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 298 (3), E403-E410 (2010).</li>
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<li>Welsh, J. P., Patel, K. G., Manthiram, K., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiply+mutated+Gaussia+luciferases+provide+prolonged+and+intense+bioluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Multiply mutated Gaussia luciferases provide prolonged and intense bioluminescence.</a> Biochemical Biophysical Research Communications. 389 (4), 563-568 (2009).</li>
<li>Tannous, B. A., Kim, D. E., Fernandez, J. L., Weissleder, R., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Codon-optimized+Gaussia+luciferase+cDNA+for+mammalian+gene+expression+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therarpy%22%5BJournal%5D)">Codon-optimized Gaussia luciferase cDNA for mammalian gene expression in culture and in vivo.</a> Molecular Therarpy. 11 (3), 435-443 (2005).</li>
<li>Compounds and methods for regulating insulin secretion. World patent. , WO2018175324A1 (2018).</li>
<li>Kalwat, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromomycin+A2+potently+inhibits+glucose-stimulated+insulin+secretion+from+pancreatic+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Chromomycin A2 potently inhibits glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta cells.</a> Journal of General Physiology. , (2018).</li>
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<li>Henquin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggering+and+amplifying+pathways+of+regulation+of+insulin+secretion+by+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Triggering and amplifying pathways of regulation of insulin secretion by glucose.</a> Diabetes. 49 (11), 1751-1760 (2000).</li>
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<li>Benninger, R. K. P., Head, W. S., Zhang, M., Satin, L. S., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions+and+other+mechanisms+of+cell-cell+communication+regulate+basal+insulin+secretion+in+the+pancreatic+islet%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Gap junctions and other mechanisms of cell-cell communication regulate basal insulin secretion in the pancreatic islet.</a> The Journal of Physiology. 589 (22), 5453-5466 (2011).</li>
<li>Konstantinova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EphA-Ephrin-A-mediated+beta+cell+communication+regulates+insulin+secretion+from+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets.</a> Cell. 129 (2), 359-370 (2007).</li>
<li>Jaques, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+effect+of+cell-cell+contact+disruption+on+cytosolic+calcium+and+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Dual effect of cell-cell contact disruption on cytosolic calcium and insulin secretion.</a> Endocrinology. 149 (5), 2494-2505 (2008).</li>
<li>Calabrese, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+36+Controls+Synchronization+of+Ca2%2B+Oscillations+and+Insulin+Secretion+in+MIN6+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Connexin 36 Controls Synchronization of Ca2+ Oscillations and Insulin Secretion in MIN6 Cells.</a> Diabetes. 52 (2), 417-424 (2003).</li>
<li>Bielefeld-Sevigny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AlphaLISA+immunoassay+platform-+the+%26%2334%3Bno-wash%26%2334%3B+high-throughput+alternative+to+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">AlphaLISA immunoassay platform- the &#34;no-wash&#34; high-throughput alternative to ELISA.</a> Assay and Drug Development Technologies. 7 (1), 90-92 (2009).</li>
<li>Aslanoglou, D., George, E. W., Freyberg, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogeneous+Time-resolved+Forster+Resonance+Energy+Transfer-based+Assay+for+Detection+of+Insulin+Secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Homogeneous Time-resolved Forster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).</li>
<li>Rafati, A., Zarrabi, A., Abediankenari, S., Aarabi, M., Gill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+colorimetric+assay+using+insulin+G-quadruplex+aptamer+arrays+on+DNA+nanotubes+coupled+with+magnetic+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Royal+Sociecy+Open+Science%22%5BJournal%5D)">Sensitive colorimetric assay using insulin G-quadruplex aptamer arrays on DNA nanotubes coupled with magnetic nanoparticles.</a> Royal Sociecy Open Science. 5 (3), 171835(2018).</li>
<li>Hulleman, J. D., Brown, S. J., Rosen, H., Kelly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+cell-based+Gaussia+luciferase+reporter+assay+for+identifying+modulators+of+fibulin-3+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A high-throughput cell-based Gaussia luciferase reporter assay for identifying modulators of fibulin-3 secretion.</a> Journal of Biomolecular Screening. 18 (6), 647-658 (2013).</li>
<li>Frank, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+tools+for+understanding+the+complexity+of+beta-cell+signalling+and+insulin+release%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Optical tools for understanding the complexity of beta-cell signalling and insulin release.</a> Nature Reviews Endocrinology. 14 (12), 721-737 (2018).</li>
<li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+C-Peptide+Storage+and+Secretion+in+Islet+beta-Cells+In+Vitro+and+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Monitoring C-Peptide Storage and Secretion in Islet beta-Cells In Vitro and In Vivo.</a> Diabetes. 65 (3), 699-709 (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Nisto nós apresentamos um método para avaliar ràpida as respostas glicose-estimuladas da secreção do insulin das pilhas de MIN6 β. Para as melhores respostas no ensaio é importante para sementes as células MIN6 na densidade adequada e permitir-lhes tornar-se 85-95% confluente. Isto melhora respostas da pilha β à glicose por causa dos contatos e da sincronização melhorados da pilha-pilha, que ocorre ambos nas ilhotas preliminares17,18,...

O método apresentado aqui permite que a secreção de insulina de uma linha de célula beta geneticamente modificada seja ensaiada rapidamente e de forma acessível no formato 96-well-Plate. A chave a este protocolo é uma versão modificada do insulin com o luciferase naturalmente-secreted da Gaussia (gluc, ~ 18 KDa) introduzido ( Veja Figura 1) no C-peptide para gerar o insulin-Gaussia (insgluc)1,2. Outras proteínas maiores, como a GFP (~ 25 kDa), foram inseridas com sucesso no peptídeo C de insulina e exibiram o processamento pós-translacional esperado de proinsulina-GFP para insulina e GFP-C-peptídeo3,4. Para o ensaio neste protocolo, o gluc foi aperfeiçoado Codon para a expressão dos mamíferos e duas mutações foram introduzidas para realçar a cinética Glow-like5,6. Múltiplas combinações e repetições de condições de tratamento podem ser facilmente testadas em formato 96-bem-Plate e os resultados da secreção podem ser obtidos imediatamente após o experimento.
Uma vantagem principal, como observado previamente2, é o baixo custo desta medida da secreção luciferase-baseada (< $0.01/well) que o diferencia dos custos e dos aspectos técnicos relativamente mais elevados de ensaios enzima-lig da imunoabsorção (ELISAs) ( > $2/bem) e a fluorescência tempo-resolvida homogénea (HTRF) ou a outra transferência da energia da ressonância de Förster (FRET)-baseou o anticorpo (> $1/well) ensaios. Em comparação com estes ensaios baseados em anticorpos, que medem a concentração de insulina referenciando uma curva padrão, o ensaio InsGLuc mede a atividade secretora como uma comparação relativa aos poços de controle na placa. Por esse motivo, cada experimento requer a inclusão de controles adequados. Esta distinção é um trade-off para permitir medições rápidas e baratas. No entanto, a secreção de insgluc demonstrou ser altamente correlacionada com a secreção de insulina,medida por Elisa1,2. Esta tecnologia foi dimensionada para a triagem de alta taxa de transferência1,2,7 e levou à identificação de novos moduladores de secreção de insulina, incluindo um inibidor de canal de potássio voltagem-gated7 bem como um inibidor de produto natural da função de célula β, a cromomicina a28. O uso de InsGLuc é mais adequado para pesquisadores que planejam continuamente testar muitas condições de tratamento diferentes para o seu impacto na secreção de insulina. Em experimentos de acompanhamento é necessário repetir os principais achados em uma linha celular β parental, e otimamente em ilhotas murinas ou humanas, e medir a secreção de insulina usando um ensaio baseado em anticorpos.

<table><tbody><tr><td>Materiais de cultura de células</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>rIns-GLuc células</td><td></td><td></td> MIN6 estáveis <td>Linha celular parental MIN6 expressando de forma estável pcDNA3.1+rInsp-Ins-eGLuc e mantida em 250 ug/ml G418</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td>4,5 g/L de meio de glicose</td></tr><tr><td>soro bovino fetal, inativado</td><td>por calor Sigma</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/ Estreptomicina</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>beta-mercaptoetanol</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>BP 176-100</td><td></td></tr><tr><td></td><td>glutamina Thermo-Fisher Scientific</td><td>BP379-100</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T3924-500</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Gold Biotechnology</td><td>G418-10</td><td>Solução estoque 250 mg/mL em água. Congelar alíquotas a -20C.</td></tr><tr><td>Frascos de cultura de tecidos T75</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-202-000</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de tecidos de 96 poços</td><td>Celltreat</td><td>229196</td><td></td></tr><tr><td>Reservatórios de reagentes (50 mL)</td><td>Corning</td><td>4870</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa<</td><td>strong>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td><forte>Reagentes de ensaio de secreção</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA (grau RIA)</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>50-146-952</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glicose</td><td>Sigma</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Hepes, pH 7,4</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>50-213-365</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>15568414</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>M9272-500G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C-7902</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Medicamentos opcionais para experimentos de estimulação</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diazoxide</td><td>Sigma</td><td>D9035</td><td>Solução de estoque: 50 mM em NaOH 0,1N. Adicione uma quantidade igual de HCl 0,1N a qualquer tampão onde o diazóxido seja adicionado.</td></tr><tr><td>epinefrina (sal de bitartarato)</td><td>Sigma</td><td>E4375</td><td>Solução de estoque: 5 mM em água</td></tr><tr><td>PMA (forbol 12-miristato)</td><td>Sigma</td><td>P1585</td><td>Solução de estoque: 100 &micro; M em DMSO</td></tr><<tr><td>strong>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Materiais de ensaio Guassia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfato dissódico (Na2HPO4)</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>G334</td><td></td></tr><tr><td>Brometo de Sódio</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>AC44680-1000</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>AC44608-5000</td><td>Solução de estoque: 0,5 M pH 8</td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>RPI</td><td>T60040-1000.0</td><td>Solução de estoque: 1 M pH 8</td></tr><tr><td>Ácido Ascórbico</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA1775922</td><td>A patente dos EUA US7718389 sugeriu que o ascorbato pode aumentar a estabilidade da celenterazina.</td></tr><tr><td>Na2SO3</td><td>Sigma</td><td>S0505-250G</td><td>Patente dos EUA US8367357 sugerido que o sulfito pode diminuir o fundo devido à BSA</td></tr><tr><td>Coelenterazina (nativa)</td><td>Nanolight / Prolume</td><td>3035MG</td><td>Solução estoque: 1 mg/ml em MeOH acidificado (2,36 mM)</td></tr><tr><td>OptiPlate-96, Microplaca Opaca Branca de 96 poços</td><td>Perkin Elmer</td><td>6005290</td><td>Qualquer placa branca opaca de 96 poços deve ser suficiente. Placas inferiores transparentes também funcionarão, no entanto, algum sinal será perdido.</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1 Leitor de placas híbrido ou equivalente</td><td>BioTek</td><td>8041000</td><td>É necessário um leitor de placas com detecção de luminescência e capacidade de placas de 96 poços.</td></tr><tr><td>Pipeta VOYAGER de 8 canais (50-1250 &micro; L)</td> <td>Integra</td><td>4724</td><td>Uma pipeta multicanal automatizada é extremamente útil para a adição rápida de reagentes de luciferase e células de plaqueamento em formato de 96 poços</td></tr> 8 <tr><td>canais 200 &micro; Pipeta L</td><td>Transferpette S 20-200 &micro; L</td><td>2703710</td><td></td></tr></tbody></table>

medindo a secreção relativa de insulina usando um substituto de luciferase co-secretado

Measuring Relative Insulin Secretion using a Co-Secreted Luciferase Surrogate

Executar ensaios baseados em anticorpos para a coleta de insulina secretada pós-amostra geralmente requer algumas horas para um dia de tempo de ensaio e pode ser caro, dependendo do ensaio específico. Os ensaios de luciferase secretados aceleram os resultados e reduzem substancialmente o custo do ensaio por amostra. Aqui nós apresentamos uma aproximação relativamente subutilizado para avaliar a atividade secretora do insulin das pilhas do β pancreatic usando o luciferase do Gaussia introduzido genetically dentro do C-peptide. Durante o processamento proteolítico do proinsulin, o C-peptide é extirpado liberando o luciferase dentro do vesícula secretora do insulin onde é cosecretado com insulin. Os resultados podem ser obtidos em poucos minutos após a coleta da amostra por causa da velocidade dos ensaios de luciferase. Uma limitação do ensaio é que é uma medida relativa da secreção de insulina e não uma quantitação absoluta. Entretanto, este protocolo é econômico, evolutivo, e pode ser executado usando a maioria de leitores padrão da placa da luminescência. As pipetas multicanais analógicas e digitais facilitam várias etapas do ensaio. Muitas variações experimentais diferentes podem ser testadas simultaneamente. Uma vez que um conjunto focado de condições são decididas, as concentrações de insulina devem ser medidas diretamente usando ensaios baseados em anticorpos com curvas padrão para confirmar os resultados do ensaio luciferase.

Para avaliar o desempenho do ensaio condições de controle, uma curva de dose-resposta de glicose simples ou uma estimulação usando o paradigma de diazóxido podem ser concluídas. No caso do primeiro, a pré-incubação das células para 1 h em condições livres de glicose seguidas pelo tratamento de 1 h com concentrações crescentes de glicose deve resultar em pouca atividade secretora e abaixo de 5 mM, enquanto o aumento da secreção é observado acima de 8 mM de glicose (Fig...

Este protocolo descreve como executar rápidos ensaios de luciferase de baixo custo em média taxa de transferência usando uma luciferase de Gaussia ligada à insulina como um proxy para a secreção de insulina de células beta. O ensaio pode ser realizado com a maioria dos leitores de placas de luminescência e pipetas multicanal.

Medindo a secreção relativa de insulina usando um substituto de luciferase co-secretado

Performing antibody-based assays for secreted insulin post-sample collection usually requires a few hours to a day of assay time and can be expensive, ...

Este protocolo descreve uma abordagem rápida alternativa para avaliar a secreção de insulina a partir de linhas celulares beta para acelerar a descoberta e caracterização de drogas. Essa abordagem é útil porque vários tratamentos podem ser testados simultaneamente, os resultados estão disponíveis imediatamente após o experimento, e este ensaio é mais acessível do que outros. A aplicação deste método para triagem de novos moduladores de moléculas pequenas da secreção de insulina pode identificar compostos de chumbo para futuras terapias de diabetes.O aumento do conhecimento da função celular beta pode contribuir para uma maior compreensão da secreção de proteínas ou neurotransmissores em geral. Este repórter de secreção de insulina foi estabelecido para trabalhar em um sistema lentiviral em outras linhas de células beta e em ilhotas humanas. Este ensaio deve ser muito simples para indivíduos familiarizados com a cultura celular e operando pipetas multicanais.Antes de planejar qualquer experimento, verifique se suas linhas celulares beta parentais ou estáveis estão respondendo adequadamente à glicose usando uma insulina ELISA. Comece preparando Krebs-Ringer Bicarbonate Buffer ou KRBH e gaussia luciferase solução de trabalho de acordo com as instruções do manuscrito. Cultivar células MIN6 em frascos T75 usando técnicas padrão de cultura celular.Prepare as células INSGLuc MIN6 para chapeamento lavando um frasco confluente de células duas vezes com PBS e adicionando dois mililitros de trippsina. Incubar as células a 37 graus celsius por cerca de cinco minutos, ou até que as células se dissociem do frasco. Determine a concentração celular e dilua as células em mídia completa para um milhão de células por mililitro, o que equivale a 100.000 células por 100 microliters em cada poço de uma placa de 96 poços.As células devem ser suficientemente confluentes para o ensaio após três a quatro dias. No dia do ensaio, prepare krbh livre de glicose suficiente para o experimento e configure um reservatório. Decante o meio da placa do poço 96 invertendo-o rapidamente sobre uma pia de laboratório e, em seguida, manchando firmemente sobre uma pilha de toalhas de papel para remover o excesso médio.Lave a placa duas vezes com 100 microliters de KRBH livre de glicose por poço, e se realizar tratamentos medicamentosos, adicione drogas ao KRBH de acordo com as instruções do manuscrito. Em seguida, adicione 100 microliters de KRBH livre de glicose a cada poço e incubar a 37 graus celsius por uma hora. Após a incubação, decante o tampão e borre a placa em uma toalha de papel.Adicione 100 microliters de KRBH livre de glicose por poço para lavar qualquer fundo acumulado e, em seguida, decantar a placa. Adicione o controle e as condições estimuladoras com ou sem tratamentos medicamentosos a 100 microliters por poço e incubar a placa a 37 graus celsius por uma hora. É importante incluir controles basais e estimulados em cada placa, a fim de determinar a capacidade de resposta das células em um determinado experimento.Se as células perderam sua resposta ao longo do tempo, recultura-las a partir de um estoque de nitrogênio líquido fresco. Colete cuidadosamente 50 microlitadores de supernacidos usando uma pipeta multicanal, transfira-a para uma placa de ensaio branca opaca 96 e mantenha a amostra em temperatura ambiente no banco até estar pronta para o ensaio da luciferase. Prepare a solução de trabalho de ensaio gaussia luciferase, canalizando a quantidade necessária de solução CTZ no tampão de ensaio GLuc, tomando cuidado para evitar que o CTZ aqueça.Use uma pipeta multicanal para adicionar rapidamente a solução de trabalho de ensaio GLuc à placa com os supernantes KRBH. Se houver alguma gotícula nas laterais dos poços, gire brevemente a placa em uma mesa, balance a centrífuga do balde. Em seguida, coloque a placa no leitor de placas e leia a luminescência com um tempo de integração de 0,1 segundo.Este ensaio foi testado sob condições de controle medindo a secreção de insulina como resposta ao aumento das concentrações de glicose. Muito pouca atividade secreta é observada abaixo de cinco milimólares de glicose, e o aumento da secreção é observado acima de oito milimallares. As células exibem a resposta secreta esperada quando desafiadas com o paradigma diazoxide.O tratamento com diazoxida bloqueia a secreção de insulina se não houver cloreto de potássio extracelular. Quando o cloreto de potássio estiver presente, a secreção pode ser amplificada com mais adição de glicose. Também foi demonstrado que as células InsGLuc MIN6 respondem como esperado para a secreção de compostos moduladores como cloreto de potássio, diazóxido, PMA e epinefrino.Após este procedimento, os resultados críticos devem ser confirmados analisando os supernaentes KRBH em ensaios ELISA ou HTRF baseados em anticorpos que permitem a determinação das concentrações de insulina. Muito trabalho pioneiro tem sido feito por um grupo do Broad Institute, que abriu o caminho para que eu usasse cada vez mais este ensaio na minha pesquisa. Vários grupos de pesquisa, incluindo nós e o grupo no Broad, estão usando essa abordagem em esforços de descoberta de drogas no campo da diabetes.

measuring-relative-insulin-secretion-using-co-secreted-luciferase

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