Name: Enriquecimento e detecção de toxinotipos de Clostridium perfringens em amostras de alimentos para varejo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Aprenda um método simplificado para detectar toxinotipos B e D de Clostridium perfringens em amostras de alimentos, eliminando a necessidade de câmaras anaeróbias. Esta técnica de enriquecimento e PCR facilita a vigilância microbiológica.

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Esta pesquisa não recebeu nenhum financiamento específico dos setores público, comercial, ou não-para fins lucrativos.

Nota: C. perfringens é considerado um organismo de nível de risco de biossegurança 2 (BSL2). Apesar de nem todas as amostras de alimentos conterá C. perfringens, todas as amostras cultivadas devem ser tratadas como tal. Todas as precauções apropriadas e equipamentos de proteção de pessoal (EPI) devem ser usados em todos os momentos. Descontaminam todo o material antes da eliminação.
1. Prepare rpm modificado4,15
<ol><li>Combine 30 g/L fluido tioglicolato médio, 60 g/L gelatina, 5 g/L peptona, 5 g/L de glicose, 5 g/L fosfato de potássio dibásico, 3 g/L extrato de levedura, 1,5 g/L cloreto de sódio, 0,5 g/L de sulfato ferroso em água deionizada até dispersar uniformemente. Normalmente, fazemos lotes de 1 L.</li>
	<li>Autoclave a 121 ° c por 15 min.</li>
	<li>Deixe esfriar a aproximadamente 40 ° c.</li>
	<li>Uma vez que o RPM é fresco, adicione D-Cycloserine a uma concentração final de 440 mg/L. Nota: as concentrações de D-cicloserina dissolvidas em água estéril a 50 mg/mL podem ser armazenadas a-20 ° c para utilização futura.</li>
	<li>Transfira assepticamente 10 mL de RPM para tubos cônicos de 15 mL. A RPM pode ser preparada em lotes e armazenada a 4 ° c por até um mês.</li>
	<li>Aqueça o RPM ao ° c 37 antes do uso.</li>
</ol>2. coleção da amostra e incubação do RPM
<ol><li>Transporte de alimentos para o laboratório temperaturas ambiente dentro de 1 h. os alimentos podem ser transportados em embalagens originais ou recipientes estéreis. Se não estiver testando imediatamente, os alimentos podem ser armazenados a-20 ° c até o uso. Anote o tipo de alimento e o país de origem de acordo com o rótulo da embalagem, se disponível, bem como qualquer outra informação relevante.</li>
	<li>Remova aproximadamente 1,0 – 2,0 g de alimento e transfira para a placa de Petri estéril ou equivalente. Finamente mince com uma lâmina de barbear estéril ou bisturi.</li>
	<li>Inocular em 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) em um tubo cônico de 15 mL. Misture bem.<ol>
<li>Para selecionar para células vegetativas, transfira 5 mL da mistura de PBS-Food para um tubo cônico de 15 mL contendo 10 mL de RPM. Fixe a tampa firmemente.</li>
		<li>Para selecionar para esporos, aqueça os restantes 5 mL de mistura de PBS-Food a 85 ° c durante 15 min e depois transfira para um tubo cônico de 15 mL contendo 10 mL de RPM. Fixe a tampa firmemente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vórtice e inverta as culturas Food-RPM para garantir a mistura completa.</li>
	<li>Vede firmemente os tubos cônicos e enrole as tampas com película de parafina ou envoltório plástico para garantir um ambiente anaeróbio.</li>
	<li>Incubar durante a noite (ON) a 37 ° c.</li>
	<li>Na manhã seguinte, anote qualquer turbidez ou fermentação em tubos RPM.</li>
</ol>3. TSC "sanduíche" chapeamento
<ol><li>Inoculate em culturas RPM em agar TSC usando uma técnica de "sanduíche" (Figura 2) descrita abaixo.</li>
	<li>Prepare o agar TSC de acordo com as instruções do fabricante.<ol>
<li>Prepare a camada de base das placas de TSC Transferindo 10 mL de agar TSC derretido para pratos de Petri estéreis e permita solidificar. Estes podem ser preparados em avançado e armazenados a 4 ° c. Assegure-se de que as placas estejam aqueceu à temperatura ambiente antes do uso.</li>
		<li>Para a camada superior da placa de TSC, mantenha o ágar derretido restante de TSC em 40 ° c. Nota: embora o ponto de derretimento do agar esteja acima de 85 ° c, o agar derretido solidifica em torno de 32 – 45 ° c.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recupere cuidadosamente as culturas ON RPM e transfira 100 μL para a base de agar TSC. Por causa da fermentação, algumas culturas podem estar pressão. Certifique-se de usar todos os EPI apropriados.</li>
	<li>Espalhe o inóculos RPM usando grânulos de vidro esterilizados ou propagador de células.</li>
	<li>Permitir que o RPM seja "absorvido" em agar TSC por 5 – 10 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Transfira cuidadosamente 20 mL de agar TSC derretido de 40 ° c para a placa utilizando uma pipeta serológica.</li>
	<li>Substitua a tampa do prato de Petri e permita que o agar TSC se solidifique completamente à temperatura ambiente.</li>
	<li>Inverta o prato de Petri e incubar a 37 ° c ON.</li>
	<li>Se as diluições seriais forem desejadas, realize diluições das culturas ON RPM em RPM pré-aquecido antes da inoculação em agar TSC.</li>
</ol>4. sub-cultivo de colônias redutoras de sulfitos
<ol><li>Na manhã seguinte, retire as placas da incubadora e examine o crescimento bacteriano. Bactérias aeróbias podem estar presentes na superfície do agar. As bactérias anaeróbias serão encontradas crescendo incorporado dentro do ágar. As bactérias redutoras de sulfito vão virar preto Agar circundante. As colônias possíveis de C. perfringens serão pretas e encaixadas no ágar.</li>
	<li>
As colônias suspeitas de C. perfringens serão positivas para a redução do sulfito e parecerá pretas, encaixadas dentro do agar. Usando um conta-gotas estéril, de uso único, "Pluck" as colônias pretas do agar e transferência para 10 mL de RPM fresco em um tubo cônico de 15 mL. É importante que o ar do conta-gotas seja expulso antes do agar piercing.</li>
	<li>Se houver uma quantidade densa de crescimento bacteriano aeróbio na superfície da placa, use um raspador de células estéreis para remover colônias de áreas selecionadas. Várias colônias suspeitas de C. perfringens podem ser amostradas a partir da mesma placa de TSC em culturas de RPM separadas.</li>
	<li>Firmemente segura tampas de tubo cônicos e enrole em filme de parafina ou plástico Wrap. Incubar ON a 37 ° c.</li>
</ol>5. extração de DNA
<ol><li>Remova as culturas ON RPM e examine os sinais de crescimento, incluindo turbidez e fermentação.</li>
	<li>Inverta suavemente a cultura de RPM para dispersar qualquer bactéria liquidada e abrir cuidadosamente. Transfira 1 mL da cultura para um tubo de microcentrífuga.</li>
	<li>Centrifugador na velocidade superior (aproximadamente 15.000 x g) para 10 minutos às bactérias da pelota.</li>
	<li>Lave a pelota com 1 mL de PBS estéril.<ol>
<li>Em algumas circunstâncias, gelatina não digerida vai assentar em cima de bactérias peletizadas. Para remover a gelatina, "fluff" fora de gelatina, agitando suavemente com PBS usando uma micropipeta. Isso vai "fluff-up" a gelatina, deixando a pelota bacteriana intacta.</li>
		<li>Retire a mistura de PBS-gelatina com aspiração suave. Resuspender a pelota bacteriana remanescente com 1 mL de PBS fresco.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugue a pelota bacteriana ressuscipended na velocidade superior por 10 minutos e Aspire com cuidado o sobrenadante.</li>
	<li>Execute imediatamente a extração do ADN usando um jogo da extração do ADN e um protocolo criado especificamente para o ADN da extração das bactérias Gram-positive (veja a tabela dos materiais).</li>
	<li>Use o DNA extraído imediatamente ou armazene a-20 ° c até a análise do PCR.</li>
</ol>6. detecção de C. perfringens via PCR genotipagem
<ol><li>Para determinar se as culturas são positivas para os toxinotypes de C. perfringens , examine o ADN extraído para genes diferentes da toxina através do PCR. Nota: como estamos mais interessados na toxina Epsilon produzindo cepas tipo B e D C. perfringens, avaliamos a presença dos genes alfa, beta e toxina épsilon. Os primers estão listados na tabela 2. Os primers para o ADN ribosomal 16s são usados como um controle da extração do ADN. Os primers adicionais podem ser usados para testar toxinotypes a através de G e podem ser encontrados na literatura publicada2,12,13.</li>
	<li>Use o ADN previamente extraído de C. perfringens como um controle positivo. Este controle assegura-se de que todos os componentes das reações do PCR estejam trabalhando. Utilizamos DNA extraído de C. perfringens tipo B (atcc 3626) como nosso controle positivo. Cresça ATCC 3636 ON em RPM a 37 ° c e extraia o DNA usando os mesmos métodos descritos nas etapas 5.1 – 5.7. Armazene o DNA extraído a-20 ° c até o uso.</li>
	<li>Defina as condições do PCR da seguinte maneira: 94,0 ° c por 3 min; 94,0 ° c por 30 s; 47,9 ° c para 30 s, 72,0 ° c por 1 min (repita os passos 2 – 4 para 35 ciclos); 72,0 ° c por 10 min.</li>
	<li>Para confirmar produtos do PCR, funcione reações do PCR em um gel do agarose de 1,8 g/100 mL usando técnicas padrão. Os tamanhos de produto de PCR esperados estão listados na tabela 2. Os resultados típicos da PCR são exibidos na Figura 3.</li>
</ol>

<ol><li>Petit, L., Gibert, M., Popoff, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+perfringens%3A+toxinotype+and+genotype%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Clostridium perfringens: toxinotype and genotype.</a> Trends in Microbiology. 7, 104-110 (1999).</li>
<li>Rood, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+the+Clostridium+perfringens+toxin-based+typing+scheme%5BTitle%5D)+AND+%22Anaerobe%22%5BJournal%5D)">Expansion of the Clostridium perfringens toxin-based typing scheme.</a> Anaerobe. , (2018).</li>
<li>Murrell, T. G., O'Donoghue, P. J., Ellis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+sheep-multiple+sclerosis+connection%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Hypotheses%22%5BJournal%5D)">A review of the sheep-multiple sclerosis connection.</a> Medical Hypotheses. 19, 27-39 (1986).</li>
<li>Rumah, K. R., Linden, J., Fischetti, V. A., Vartanian, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Clostridium+perfringens+type+B+in+an+individual+at+first+clinical+presentation+of+multiple+sclerosis+provides+clues+for+environmental+triggers+of+the+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Isolation of Clostridium perfringens type B in an individual at first clinical presentation of multiple sclerosis provides clues for environmental triggers of the disease.</a> PLoS One. 8, 76359(2013).</li>
<li>Wagley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+Clostridium+perfringens+epsilon+toxin+associated+with+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Multiple+Sclerosis%22%5BJournal%5D)">Evidence of Clostridium perfringens epsilon toxin associated with multiple sclerosis.</a> Multiple Sclerosis. , 1352458518767327 (2018).</li>
<li>Linden, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+perfringens+Epsilon+Toxin+Causes+Selective+Death+of+Mature+Oligodendrocytes+and+Central+Nervous+System+Demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Clostridium perfringens Epsilon Toxin Causes Selective Death of Mature Oligodendrocytes and Central Nervous System Demyelination.</a> MBio. 6, 02513(2015).</li>
<li>Popoff, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epsilon+toxin%3A+a+fascinating+pore-forming+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Epsilon toxin: a fascinating pore-forming toxin.</a> FEBS Journal. 278, 4602-4615 (2011).</li>
<li>Lee, C. A., Labbe, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+Enterotoxin-+and+Epsilon-Positive+Clostridium+perfringens+Spores+in+U.S.+Retail+Spices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Protection%22%5BJournal%5D)">Distribution of Enterotoxin- and Epsilon-Positive Clostridium perfringens Spores in U.S. Retail Spices.</a> Journal of Food Protection. 81, 394-399 (2018).</li>
<li>Wen, Q., McClane, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+enterotoxigenic+Clostridium+perfringens+type+A+isolates+in+American+retail+foods%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Detection of enterotoxigenic Clostridium perfringens type A isolates in American retail foods.</a> Applied and Environmental Microbiology. 70, 2685-2691 (2004).</li>
<li>Cooper, K. K., Bueschel, D. M., Songer, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+Clostridium+perfringens+in+retail+chicken+livers%5BTitle%5D)+AND+%22Anaerobe%22%5BJournal%5D)">Presence of Clostridium perfringens in retail chicken livers.</a> Anaerobe. 21, 67-68 (2013).</li>
<li>Strong, D. H., Canada, J. C., Griffiths, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+Clostridium+perfringens+in+American+foods%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Incidence of Clostridium perfringens in American foods.</a> Applied and Environmental Microbiology. 11, 42-44 (1963).</li>
<li>Buogo, C., Capaul, S., Hani, H., Frey, J., Nicolet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+Clostridium+perfringens+type+C+enteritis+in+pigs+using+a+DNA+amplification+technique+%28PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Medicine%2C+Series+B%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of Clostridium perfringens type C enteritis in pigs using a DNA amplification technique (PCR).</a> Journal of Veterinary Medicine, Series B. 42, 51-58 (1995).</li>
<li>Yamagishi, T., Sugitani, K., Tanishima, K., Nakamura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction+test+for+differentiation+of+five+toxin+types+of+Clostridium+perfringens%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction test for differentiation of five toxin types of Clostridium perfringens.</a> Microbiology and Immunology. 41, 295-299 (1997).</li>
<li>Johansson, A., Engstrom, B. E., Frey, J., Johansson, K. E., Baverud, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+clostridium+perfringens+during+simulated+transport+and+stability+of+some+plasmid-borne+toxin+genes+under+aerobic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Veterinaria+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Survival of clostridium perfringens during simulated transport and stability of some plasmid-borne toxin genes under aerobic conditions.</a> Acta Veterinaria Scandinavica. 46, 241-247 (2005).</li>
<li>Erickson, J. E., Deibel, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+medium+for+rapid+screening+and+enumeration+of+Clostridium+perfringens+in+foods%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">New medium for rapid screening and enumeration of Clostridium perfringens in foods.</a> Applied and Environmental Microbiology. 36, 567-571 (1978).</li>
<li>Regan, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+epsilon+toxin-producing+Clostridium+perfringens+strains+in+American+retail+food%5BTitle%5D)+AND+%22Anaerobe%22%5BJournal%5D)">Identification of epsilon toxin-producing Clostridium perfringens strains in American retail food.</a> Anaerobe. 54, 124-127 (2018).</li>
</ol>

Sem divulgações.

Aqui nós descrevemos um método para identificar a predominância de C. perfringens em amostras do alimento de varejo com repicagem limitado e sem uso de um sistema anaeróbio da câmara. Este método utiliza uma combinação de técnicas para aumentar a identificação de C. perfringens a partir de amostras de alimentos. Usando uma versão modificada da mídia RPM, permitimos o crescimento seletivo de C. perfringens. Ao imprensar o RPM inoculado entre as camadas de agar TSC, somos capazes de identificar e isolar bactérias anaeróbicas, redutoras de sulfito, características de C. perfringens. Para confirmar a presença de C. perfringens, as colônias de redução de sulfito são subcultivadas em RPM fresco. A versão modificada ou RPM permite-nos extrair facilmente o DNA das culturas, permitindo a confirmação do PCR de genes específicos da toxina. A confirmação de C. perfringens contaminou amostras de alimento pode ser conseguida dentro de três dias.
Em experimentos precoces, amostras de alimentos foram simplesmente inoculadas em RPM e DNA extraído de culturas ON. Este método resultou na detecção de C. perfringens em um número limitado de amostras (dados não mostrados). Embora o RPM seja seletivo para o crescimento de c. perfringens , não é exclusivo para o crescimento de c. perfringens . Outros, gram-positivos, D-cycolserine bactérias resistentes ainda pode crescer em RPM. Nós supor que a contaminação por outras espécies bacterianas pode ter diminuído nossa deteção de tensões de C. perfringens diminuindo a sensibilidade de nossa análise do PCR em nossa primeira cultura do RPM. Um passo crítico no aumento da detecção de C. perfringens foi a inclusão da técnica de "sanduíche" de agar TSC. Isso nos permitiu diferenciar e selecionar para colônias anaeróbicas, de redução de sulfito, características de C. perfringens. Uma etapa chave neste processo é assegurar-se de que a camada superior de agar derretido de TSC esteja em 40 ° c. Embora algumas cepas de C. perfringens possam crescer a temperaturas elevadas (46 – 48 ° c)15,16, aadição de agar derretido a temperaturas elevadas reduz consideravelmente a quantidade de culturas recuperadas, provavelmente devido à morte celular .
Existem várias limitações potenciais para este método. Como mencionado anteriormente, nem a RPM nem o agar TSC selecionam ou diferenciam para C. perfringens exclusivamente, permitindo o crescimento de outras espécies bacterianas presentes em amostras de alimentos. Isto pode reduzir a sensibilidade do ensaio para seleccionar apenas C. perfringens . No entanto, esta é uma limitação comum em quase todas as técnicas de cultivo. A confirmação de genotipagem de isolados purificados é o melhor método para identificar definitivamente C. perfringens e outras espécies bacterianas. Outra limitação deste estudo é que não testamos os isolados purificados. Nós propositadamente fizemos isso para limitar a quantidade de subculturação, como a subculturação repetida é temida a resultar em perda de plasmídeo. Porque nós não isolamos à pureza, é possível que os toxinotypes múltiplos de C. perfringens possam estar atuais na mesma amostra ou Subculture. Se os pesquisadores desejam obter isolados purificados, métodos de purificação padrão podem ser usados na última cultura de RPM descrita neste método; Isso normalmente requer o uso de câmaras anaeróbias. Embora originalmente usado para isolar c. perfringens de alimentos, este método pode ser usado para identificar e isolar c. perfringens de uma infinidade de fontes. Especificamente, uma tal aplicação deste método é testar amostras fecais dos seres humanos (ou dos animais) que são suspeitados para ser contaminados com C. perfringens e toxinotype as bactérias para compreender melhor a fonte de infecção.

Clostridium perfringens (C. perfringens) é um Gram positivo, anaeróbio, esporo-formando, haste em forma de bactéria que é encontrado onipresente no ambiente. Esta espécie de bactéria transporta genes que codificam por mais de 17 toxinas e, historicamente, tem sido caracterizada em cinco toxinotipos (A-E) com base na presença de quatro genes de toxina diferentes: alfa, beta, Épsilon e toxina Iota (tabela 1)1. Recentemente, tem sido sugerido que este esquema de digitação precisa ser expandido para incluir os tipos F e G, que abrigam a toxina C. perfringens enterotoxina (CPE) e NetB, respectivamente2. Entretanto, mais pesquisa é precisada antes que este sistema planejando seja aceitado formalmente. Quando o gene da toxina alfa for localizado estritamente cromossomicamente, o gene de CPE pode ser encontrado no cromossoma e nos Plasmids. Em comparação, os genes restantes das toxinas são encontrados em vários plasmídos de tamanho diferente. Estamos particularmente interessados na prevalência de C. perfringens tipos B e D como estas cepas produzem toxina épsilon, uma toxina extremamente potente, formando poros, que tem sido sugerido para desempenhar um papel no desencadeamento da esclerose múltipla (MS) em seres humanos3 ,4,5,6,7. Como as pessoas se tornam infectadas ou colonizadas por essas cepas é desconhecido. Uma possível explicação é através do consumo de produtos alimentares contaminados. Para ajudar a responder a esta pergunta, procurou-se determinar a prevalência de diferentes toxinotipos de C. perfringens em amostras de alimentos americanas.
A presença de C. perfringens toxinotypes em amostras de alimentos americanas é subestudada e muitas vezes requer o uso de sistemas de contêineres anaeróbios e inúmeras etapas de subculturação8,9,10,11 . Embora inúmeras etapas de subculturação sejam necessárias para a obtenção de isolados purificados, esse método pode levar à perda de plasmídeo ao longo do tempo12,13,14, possivelmenteafetando a detecção de genes de toxina de origem plasmática incluindo o gene da toxina épsilon. Procurou-se desenvolver um método fácil, com menos etapas de subculturação, para seletivamente cultura C. perfringens sem o uso de câmaras anaeróbias, frascos, ou sacos. Brevemente, as amostras de alimentos são inoculadas em Rapid perfringens Media (RPM) durante a noite (ON), em seguida, "imprensado" em agar TSC e incubadas ON. Colônias suspeitas de ser C. perfringens são então SUBCULTIVADAS em RPM e incubadas novamente em. O DNA é extraído e a PCR é realizada para determinar o genótipo (Figura 1). Optou-se por utilizar a RPM, como foi demonstrado para aumentar a recuperação de cepas de C. perfringens de amostras de alimentos em comparação com outros meios mais padrão15. Além, o RPM foi usado com sucesso para isolar uma toxina do Epsilon que produz a tensão do tipo B de um paciente de MS4. Nós usamos uma versão modificada do RPM em vez da versão original para permitir a extração fácil do ADN. Enquanto este método permite a fácil identificação de genes de toxinas dentro de amostras, é possível que uma amostra individual conterá mais de um C. perfringens toxinotype. Como nosso método não isola cepas purificadas usando várias rodadas de purificação, a identificação de vários toxinotipos de uma amostra não é possível. No entanto, técnicas de purificação padrão (tipicamente estrias em placas de TSC ou placas de agar sangue) podem ser aplicados no final do nosso protocolo para alcançar culturas purificadas.

<table><tbody><tr><td>D-Cycloserine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6880</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Sigma Life Science</td><td>D9434-250G</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de transferência descartáveis</td> qualquer <td>marca</td><td></td><td>Selecione uma com ponta fina como Thermo Scientific Pipetas de transferência descartáveis 137116M / EMD</td></tr><tr><td>DNeasy Blood & Kits de tecidos</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td>Nota: vários kits de extrações de DNA e plasmídeo foram avaliados, este kit deu os resultados mais desejáveis.</td></tr><tr><td>Incubadora Seca</td><td>de qualquer marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Meio de tioglicolato fluido</td><td>Remel</td><td>R453452</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina de pele suína</td><td>Sigma Life Science</td><td>G1890-500G</td><td></td></tr><tr><td>Primers individuais</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de ferro (II) heptahidratado</td><td>Sigma Life Science</td><td>F8633-250 G</td><td></td></tr><tr><td>Lisozima de clara de ovo de galinha</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td>Necessário para extração de DNA, não fornecido no kit</td></tr><tr><td>tubo de microcentrífuga</td><td>qualquer marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>parafilme ou filme plástico</td><td>qualquer marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peptona de caseína e outras proteínas animais</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70173-100G</td><td></td></tr><tr><td>Perfringens Agar Base (TSC + SFP)</td> <td>Oxoid</td><td>CM0587</td><td>Faça TSC agar de acordo com as instruções</td></tr><tr><td>Fosfato de potássio dibásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2222-100G</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-7653</td><td></td></tr><tr><td>Raspador de células estéreis</td><td>qualquer marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espalhador de células estéreis</td><td>qualquer marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri estéreis</td><td>de qualquer marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suprimentos e equipamentos para eletroforese em gel</td><td>qualquer centrífuga de mesa de marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>qualquer marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Taq&nbsp; Kit de mistura mestre de PCR</td><td>Qiagen</td><td>201443</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador para reação de PCR</td><td>qualquer marca</td> banho-maria qualquer marca <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70161-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

enriquecimento e detecção de toxinotipos de clostridium perfringens em amostras de alimentos para varejo

Enrichment and Detection of Clostridium perfringens Toxinotypes in Retail Food Samples

Clostridium perfringens (C. perfringens) é um produtor prolífico da toxina e causa uma escala larga das doenças em vários anfitriões. C. perfringens é categorizado em cinco diferentes toxinotipos, a através de E, com base no transporte de quatro genes principais da toxina. A prevalência e distribuição destes vários toxinotipos é subestudada, especialmente a sua difusão em alimentos de retalho americanos. De particular interesse para nós são as estirpes tipo B e D, que produzem toxina épsilon, uma toxina extremamente letal sugerida para ser o gatilho ambiental da esclerose múltipla em seres humanos. Para avaliar a presença de diferentes toxinotipos de C. perfringens em várias amostras de alimentos, desenvolvemos um método fácil para a cultura seletiva dessas bactérias sem o uso de um sistema de Container anaeróbio envolvendo apenas três etapas de cultivo. Os alimentos são comprados em mercearias locais e transportados para o laboratório em condições ambientais. As amostras são picadas e inoculadas em meios de perfringens rápidos modificados (RPM) e incubadas durante a noite em 37 ° c em um tubo cônico selado, hermético. Culturas overnight são inoculadas em uma camada inferior de sólidos Triptse sulfito cicloserina (TSC) Agar, e, em seguida, sobrepostas com uma camada superior de agar TSC derretido, criando um "imprensado", ambiente anaeróbio. As placas de agar são incubadas durante a noite a 37 ° c e, em seguida, avaliadas para o aparecimento de colônias pretas, com redução de sulfito. C. perfringens-as colônias suspeitadas são removidas do agar de TSC usando os conta-gotas estéreis do olho, e INOCULADOS no RPM e subcultivados durante a noite em 37 ° c em um tubo cônico hermético. O DNA é extraído da subcultura RPM e, em seguida, analisado para a presença de genes de toxina C. perfringens via reação em cadeia da polimerase (PCR). Dependendo do tipo de alimento amostrado, tipicamente 15 – 20% das amostras testam positivo para C. perfringens.

Usando este método, 15 – 20% de nossos alimentos amostrados testam positivo para C. perfringens. Quando a maioria de tensões forem positivas para o toxinotype A, nós detectamos com sucesso o tipo B e o D em amostras de alimento. Em um artigo publicado anteriormente, testamos um total de 216 amostras de alimentos compradas em lojas de varejo de Nova York16 (tabela 3). Estas amostras incluíram várias amostras de carne (carne bovina, cordeiro, porco e cordeiro), amostras de aves (frango e Peru) e amostras de frutos do mar (bacalhau, salmão, mariscos, pardos, linguado, Lula, tilápia, atum e vários outros peixes). Amostras de produtos e laticínios também foram testadas. De 216 amostras, 34 (16%) foram positivas para C. perfringens. Das 34 amostras positivas de C. perfringens , 31 amostras (91,2%) continha a toxina alfa, uma amostra (2,9%) continha a toxina alfa, beta e épsilon, e duas amostras (5,9%) continha a toxina alfa e Épsilon.
Curiosamente, também descobrimos que C. perfringens foi mais prevalente como células vegetativas em comparação com esporos. Vinte e cinco amostras foram comparadas para a presença de células vegetativas de C. perfringens ou esporos. Os esporos foram selecionados por amostras de calor chocantes a 85 ° c por 15 min. Das 25 amostras testadas, 16% foram positivas para cepas vegetativas de C. perfringens versus 4% para esporos. Isso indica que pode ser mais rentável para testar somente células vegetativas em vez de ambos.
<img alt="Diagrama de fluxo de trabalho de análise de PCR de amostra de alimentos para extração de DNA de células/esporos por meio do método de choque térmico." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59931/59931fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: visão geral do procedimento. As amostras de alimentos são triturados e diluídos em PBS estéril. Metade da amostra de PBS-Food é inoculada em RPM para selecionar para células vegetativas. A amostra restante do PBS-alimento é calor chocado em 85 ° c por 15 minutos para selecionar para esporos antes da inoculação no RPM. As culturas são incubadas sobre a 37 ° c, em seguida, banhado em agar TSC. O agar TSC é incubado ON a 37 ° c e as culturas redutores de sulfito são subcultivadas em RPM fresco. As culturas subcultivadas do RPM são incubadas sobre em 37 ° c e o ADN é extraído para executar genotipagem através do PCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59931/59931fig01large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Diagrama de eletroforese em gel em camadas; Camadas de TSC e RPM para separação de DNA em placa de Petri." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59931/59931fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2: esquema da técnica de sanduíche de agar TSC. Os meios do RPM que contêm as bactérias de C. perfringens são chapeados entre duas camadas de agar de TSC a fim promover um ambiente anaeróbio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59931/59931fig02large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Resultados da eletroforese; Bandas de DNA; identificação de espécies; diagrama de gel; Escada de 250-750bp." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59931/59931fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3: resultados de PCR selecionados. Exemplo de imagens dos resultados genotipantes de c. perfringens de sete tipos diferentes de alimentos, e um controle positivo de c. perfringens tipo B. Uma escada de peso molecular (primeira pista de cada gel) foi utilizada para aproximar o tamanho dos resultados da PCR em pares de base (BP). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59931/59931fig03large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Toxinotipo</td>
			<td>Alfa</td>
			<td>Beta</td>
			<td>Epsilon</td>
			<td>Iota</td>
			<td>Cpe</td>
			<td>NetB</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">Estabelecido</td>
			<td>Um</td>
			<td>+</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>B</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>C</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>D</td>
			<td>+</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>E</td>
			<td>+</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Proposta</td>
			<td>F</td>
			<td>+</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>G</td>
			<td>+</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="8"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="8">+ presente -Não está presente +/-pode ou não estar presente</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: visão geral dos genótipos de C. perfringens . Um gráfico das combinações de toxinas produzidas por cada C. perfringens toxinotype.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Alvo</td>
			<td>Pares da primeira demão</td>
			<td>Produto esperado do PCR (BP)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Alfa</td>
			<td>F: GCT AAT GTT ACT GCC GTT GA R: CCT CTG ATA CAT CGT GTA AG</td>
			<td>325</td>
		</tr>
<tr>
<td>Beta</td>
			<td>F: GCG AAT ATG CTG AAT CAT CTA R: GCA GGA ACA ATT GTA TAT CTT C</td>
			<td>196</td>
		</tr>
<tr>
<td>Epsilon</td>
			<td>F: GCG GTG ATA TCC ATC TAT TC R: CCA CTT ACT TGT CCT ACT AAC</td>
			<td>655</td>
		</tr>
<tr>
<td>16s RNA</td>
			<td>F: AGA GTT TGA TCC TGG CTC A R: GGT TAC CTT GTT ACG ACT T</td>
			<td>~ 1300</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: primers e produtos esperados de PCR para genes de toxina selecionados. Primers utilizados na etapa de genotipagem de PCR.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3" rowspan="2">Tipo de alimento</td>
			<td colspan="2">Tipo A</td>
			<td colspan="2">Tipo B</td>
			<td colspan="2">Tipo C</td>
			<td colspan="2">Tipo D</td>
			<td colspan="2">C. perf +</td>
		</tr><tr><td colspan="2">positivo da toxina alfa</td>
			<td colspan="2">Alfa, beta e toxina épsilon positivas</td>
			<td colspan="2">Alfa e beta toxina positiva</td>
			<td colspan="2">toxina alfa e Épsilon positiva</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr><tr><td colspan="2"></td>
			<td>N</td>
			<td>N</td>
			<td>%</td>
			<td>N</td>
			<td>%</td>
			<td>N</td>
			<td>%</td>
			<td>N</td>
			<td>%</td>
			<td>N</td>
			<td>%</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">Carne</td>
			<td>Carne</td>
			<td>38</td>
			<td>8</td>
			<td>21</td>
			<td>1</td>
			<td>3</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>9</td>
			<td>24</td>
		</tr><tr><td>Cordeiro</td>
			<td>10</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>Porco</td>
			<td>15</td>
			<td>2</td>
			<td>13</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>2</td>
			<td>13</td>
		</tr><tr><td>Misto</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>100% de</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>100% de</td>
		</tr><tr><td>Subtotal</td>
			<td>64</td>
			<td>11</td>
			<td>17</td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>12</td>
			<td>19</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Aves</td>
			<td>Frango</td>
			<td>19</td>
			<td>5</td>
			<td>26</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>5</td>
			<td>26</td>
		</tr><tr><td>Turquia</td>
			<td>7</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>Subtotal</td>
			<td>26</td>
			<td>5</td>
			<td>19</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>5</td>
			<td>19</td>
		</tr><tr><td rowspan="11">Marisco</td>
			<td>Bacalhau</td>
			<td>4</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>Misto</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>Salmão</td>
			<td>11</td>
			<td>2</td>
			<td>18</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>2</td>
			<td>18</td>
		</tr><tr><td>amêijoas</td>
			<td>32</td>
			<td>1</td>
			<td>3</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>3</td>
		</tr><tr><td>Snapper</td>
			<td>4</td>
			<td>3</td>
			<td>75% de</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>3</td>
			<td>75% de</td>
		</tr><tr><td>Solha</td>
			<td>12</td>
			<td>4</td>
			<td>33% de</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>4</td>
			<td>33% de</td>
		</tr><tr><td>Lula</td>
			<td>4</td>
			<td>1</td>
			<td>25</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>25</td>
		</tr><tr><td>Tilápia</td>
			<td>21</td>
			<td>2</td>
			<td>10</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>2</td>
			<td>10</td>
			<td>4</td>
			<td>19</td>
		</tr><tr><td>Atum</td>
			<td>3</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>Outros</td>
			<td>8</td>
			<td>1</td>
			<td>13</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>13</td>
		</tr><tr><td>Subtotal</td>
			<td>100</td>
			<td>14</td>
			<td>14</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>16</td>
			<td>16</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">Leiteria</td>
			<td>vaca</td>
			<td>3</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>Cabra</td>
			<td>4</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>Leite</td>
			<td>3</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>Subtotal</td>
			<td>10</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">Produzir</td>
			<td>Vegetal</td>
			<td>12</td>
			<td>1</td>
			<td>8</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>8</td>
		</tr><tr><td>Fruta</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>Erva</td>
			<td>3</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>Subtotal</td>
			<td>16</td>
			<td>1</td>
			<td>6</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>6</td>
		</tr><tr><td>Total</td>
			<td></td>
			<td>216</td>
			<td>31</td>
			<td>14</td>
			<td>1</td>
			<td>0,50% de</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>2</td>
			<td>0,90% de</td>
			<td>34</td>
			<td>16</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 3: prevalência de diferentes toxinotipos de C. perfringens em 216 amostras de alimentos. Um exemplo dos resultados obtidos ao usar este método para testar o alimento de varejo para C. perfringens. Esta tabela foi modificada do manuscrito publicado anteriormente, Regan et al.16.

O objetivo deste protocolo é detectar diferentes toxinotipos de Clostridium perfringens em alimentos adquiridos localmente, particularmente a toxina Epsilon produzindo tipos de estirpe B e D, sem o uso de câmaras anaeróbias.

Enriquecimento e detecção de toxinotipos de Clostridium perfringens em amostras de alimentos para varejo

Clostridium perfringens (C. perfringens) is a prolific toxin producer and causes a wide range of diseases in various hosts. C. perfringens is categorized ...

Desenvolvemos um método fácil para testar amostras de alimentos para os diferentes toxinotipos de c perfringens. Estamos particularmente interessados na prevalência de toxinotipos B e D que produzem a toxina epsilon. Nosso protocolo permite fácil enriquecimento e detecção dos vários toxinotipos c perfringens sem o uso de câmaras anaeróbicas ou incubadoras com subcultura limitada.Este método também poderia ser usado para testar solo, água, amostras fecais e muito mais. Demonstrando o procedimento estarão Zuha Anwar e Samantha Regan, técnicos do laboratório. Comece preparando perfringens rápidos modificados médio, ou RPM.Misture os ingredientes de acordo com as instruções do manuscrito e autoclave a mistura a 121 graus Celsius por 15 minutos. Deixe o meio esfriar a aproximadamente 40 graus Celsius, em seguida, adicione D-cicloserina a uma concentração final de 440 miligramas por litro. Transferir aseticamente o RPM para tubos cônicos de 15 mililitros, e armazenar a quatro graus Celsius por até um mês.Antes de usar, aqueça o médio a 37 graus Celsius. Ao coletar amostras a serem testadas, transfira o alimento para o laboratório de acordo com as instruções do manuscrito. Se não for testado imediatamente, o alimento pode ser armazenado a menos 20 graus Celsius.Anote o tipo de alimento e o país de origem, bem como quaisquer outras informações relevantes. Para testar o alimento, transfira aproximadamente de um a dois gramas para uma placa de Petri estéril, e pique-a finamente com uma lâmina de barbear estéril ou bisturi. Inocular-o em 10 mililitros de PBS em um tubo cônico de 15 mililitros, e misture bem.Selecione para células vegetativas transferindo cinco mililitros da mistura de alimentos PBS para um tubo cônico de 15 mililitros com 10 mililitros de RPM e fechando a tampa firmemente. Selecione para esporos aquecendo os cinco mililitros restantes da mistura a 85 graus Celsius por 15 minutos. E, em seguida, transferi-lo para um tubo com RPM e fechar a tampa firmemente.Para garantir a mistura completa, vórtice e inverter as culturas de RPM alimentar. Em seguida, sele firmemente os tubos cônicos e enrole as tampas com filme de parafina para criar um ambiente anaeróbico. Incubar os tubos durante a noite a 37 graus Celsius e notar qualquer turbidez ou fermentação na manhã seguinte.Prepare Tryptose Sulfite Cycloserine ou TSC Agar de acordo com a direção do fabricante e, em seguida, use a técnica do sanduíche para inocula-lo com culturas de RPM durante a noite. Prepare a camada base das placas transferindo 10 mililitros do Ágar derretido para placas de Petrie estéreis e permitindo que ela solidifique. Mantenha o TSC Agar restante a 40 graus Celsius para a camada superior, e transfira cuidadosamente 100 microliters da cultura RPM durante a noite para a base de Ágar.Algumas culturas podem estar sob pressão devido à fermentação, por isso não deixe de usar todos os equipamentos de proteção individual apropriados. Espalhe a inoculina com contas de vidro estéreis ou um espalhador de células, e permita que o RPM seja absorvido no Ágar por cinco a 10 minutos. Em seguida, use uma pipeta sorológica para transferir cuidadosamente 20 mililitros do TSC Agar derretido para a placa.Substitua a tampa da placa de Petrie e permita que o TSC Agar solidifique completamente à temperatura ambiente, depois inverta a placa e incuba-a a 37 graus Celsius durante a noite. Se necessário, realize diluições seriais da cultura RPM antes da inoculação no TSC Agar. Após a incubação, examine as placas para o crescimento bacteriano.Bactérias aeróbicas podem estar presentes na superfície do Ágar, enquanto bactérias anaeróbicas serão incorporadas no Ágar. As bactérias redutoras de Sulfite tornarão o ágar ao redor preto, e possíveis colônias de c perfringens serão negras e incorporadas no Ágar. Se houver uma densa quantidade de crescimento bacteriano aeróbico na superfície da placa, use um raspador de células para remover colônias de áreas selecionadas.Use um conta-gotas de uso único estéril para arrancar as colônias suspeitas de C perfringens do Ágar, certificando-se de expulsar o ar antes de perfurar o Ágar. Transfira as colônias para 10 mililitros de RPM fresco em um tubo cônico de 15 mililitros. Várias colônias poderiam ser amostradas da mesma placa em culturas RPM separadas.Segure firmemente as tampas cônicas do tubo, enrole-as em filme de parafina e incuba-as durante a noite a 37 graus Celsius. C perfringens é um organismo BSL dois. É importante usar as precauções de segurança adequadas em todos os momentos, especialmente ao abrir culturas de RPM durante a noite e descontaminar cuidadosamente e descartar os meios usados.No dia seguinte, remova as culturas da noite para o dia e examine-as para turbidez e fermentação, em seguida, proceder com extração de DNA. Inverta suavemente a cultura RPM para dispersar qualquer bactéria assentada e abrir cuidadosamente o tubo. Transfira um mililitro para um tubo de microcentrífuga e pelota as bactérias por centrifugação.Lave a pelota com um mililitro de PBS estéril. Se a gelatina não digerida se estabeleceu em cima das bactérias, fluff-lo agitando-se com PBS. Aspire suavemente a gelatina e a PBS e suspenda a pelota bacteriana restante com um mililitro de PBS fresco.É importante remover qualquer gelatina pelleted com perturbação limitada da pelota celular. A não remoção da gelatina pode inibir a extração de DNA e a PCR. Centrifugar as bactérias por 10 minutos e aspirar cuidadosamente o supernante.Em seguida, realize a extração de DNA usando um kit especificamente projetado para bactérias gram positivas. Use o DNA imediatamente ou armazene-o a menos 20 graus Celsius. Realize pcr no DNA extraído para determinar se as culturas são positivas para toxinotipos de c perfringens.Use o DNA de perfringens C como um controle positivo para garantir que todos os reagentes PCR estejam funcionando. Execute o PCR de acordo com as instruções do manuscrito e analise os produtos com eletroforese de gel agarose. Este protocolo foi usado para testar um total de 216 amostras de alimentos compradas em lojas de varejo de Nova York.As amostras incluíram várias amostras de carne, amostras de aves e amostras de frutos do mar. C perfringens Tipo B foi utilizado como um controle positivo. Verificou-se que 15 a 20% dos alimentos amostrados testam positivo para c perfringens.Das 34 amostras positivas, 31 amostras continham a toxina alfa, uma amostra continha a toxina alfa, beta e epsilon. E duas amostras continham a toxina alfa e epsilon. Desenvolvemos um método fácil para testar amostras de alimentos para os diferentes toxinotipos de c perfringens.Estamos particularmente interessados na prevalência de toxinotipos B e D que produzem a toxina epsilon.

enrichment-detection-clostridium-perfringens-toxinotypes-retail-food

Research

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Um protocolo envolvendo concentração integrada, enriquecimento e detecção colorimétrica de ponto final de patógenos transmitidos por alimentos em grandes volumes de água agrícola é apresentado aqui.  A água é filtrada através de Swabs de Moore modificados (MMS), enriquecidos com meios seletivos ou não seletivos, e a detecção é realizada usando dispositivos analíticos baseados em papel (μPAD) embutidos com substratos colorimétricos indicativos bacterianos.

Papel colorimétrico à base de Detecção de<em&gt; Escherichia coli</em&gt;,<em&gt; Salmonella</em&gt; Spp. E<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; A partir de grandes volumes de água Agrícola

O objetivo geral do presente protocolo é para sintetizar nanosensors funcional para o portátil, econômica, e rápida detecção de direcionado especificamente bactérias patogênicas através de uma combinação de relaxação magnética e as modalidades de emissão de fluorescência.

Patógeno de origem alimentar rastreio usando Nanosensor Magneto-fluorescente: Rápida detecção de Escherichia Coli O157: H7

Um protocolo para o desenvolvimento de um biosensor eletroquímico de DNA composta por um eletrodo de carbono ácido-estável, ouro de nanopartículas-modificado, serigrafado polilático para detectar o Vibrio parahaemolyticus é apresentado.

Desenvolvimento de um Biosensor eletroquímico do DNA para detectar um patógeno de origem alimentar

Campylobacter é a principal causa de gastroenterite bacteriana transmitida por alimentos em todo o mundo. Apesar de os estabelecimentos adotarem medidas para reduzir a prevalência em todas as suas instalações, os produtos contaminados chegam consistentemente aos consumidores. A técnica desenvolvida nos últimos doze anos aborda as limitações dos métodos existentes para isolar e detectar Campylobacter spp.

Detecção e Isolamento de Campylobacter spp.

Aprenda um método simplificado para detectar toxinotipos B e D de Clostridium perfringens em amostras de alimentos, eliminando a necessidade de câmaras anaeróbias. Esta técnica de enriquecimento e PCR facilita a vigilância microbiológica.

Enriquecimento e detecção de toxinotipos de Clostridium perfringens em amostras de alimentos para varejo

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