Agarose reticulada ativada para o rápido desenvolvimento de resinas de cromatografia de afinidade-captura de anticorpos como um estudo de caso

Anticorpos monoclonais dominam o mercado biofarmacêutico e são tipicamente purificados pela cromatografia proteica A. A resina de segundo tempo é um grande driver de custo durante a produção, afetando o preço da terapêutica baseada em anticorpos. Aqui descrevemos um novo ligante de afinidade baseado na proteína fluorescente que é lida como um portador do epítope linear do anticorpo neutralizante do HIV 2F5.

Em geral, nosso método permite a rápida geração de resinas de cromatografia de afinidade que podem ser usadas para a captura de anticorpos monoclonais. Demonstramos essa capacidade capturando anticorpos 2F5 do extrato de planta bruta. Otimizamos as condições de captura e o buffer de solução, a fim de melhorar a capacidade dinâmica de ligação e a reutilização da resina.

Nossa resina permite condições geralmente mais frouxas do que a Proteína A e tem o potencial de reduzir os custos de purificação de anticorpos monoclonais. Além disso, a resina pode ser facilmente adaptada a outros anticorpos que se ligam a epítopos lineares. Para iniciar este procedimento, ajuste a concentração da solução de ligante de afinidade preparada de modo que esteja na faixa de 5 a 15 gramas por litro, conforme definido pelo desenho dos experimentos.

Armazene a solução no gelo até que a reação de acoplamento esteja pronta. Em seguida, encha uma seringa de dois mililitros com a solução DFE. E prepare um adaptador para montar as seringas nas colunas de agarose ativadas pelo NHS com um volume de cama de um mililitro.

Para cada 10 colunas utilizadas para acoplamento, prepare 30 mililitros de solução de desativação, 30 mililitros de solução de pH baixo e um mililitro de solução de armazenamento. Em seguida, prepare 20 mililitros de um ácido clorídrico mililitro em um tubo. E incubar no gelo por pelo menos 20 minutos.

Prepare uma balança de precisão para monitorar o fluxo através de frações para todas as etapas durante a reação de acoplamento. Depois disso, abra uma coluna de agarose cruzada ativada pelo NHS. Aplique uma gota de tampão na entrada do adaptador, para evitar que o ar entre na coluna.

Monte o adaptador de seringa na entrada da coluna. Lave a coluna com seis mililitros de gelo frio um ácido clorídrico mililitro, a uma taxa de fluxo menor que um mililitro por minuto. Usando uma seringa de dois mililitros, injete imediatamente 1,5 mililitros de solução DFE a uma taxa de fluxo inferior a um mililitro por minuto.

E coletar o fluxo através de fração em uma escala de precisão para análise subsequente. Sele a coluna em ambas as extremidades e incubar por 15 a 45 minutos, a 22 graus Celsius. Em seguida, injete seis mililitros da solução de ativação, seguidos por seis mililitros de solução de pH baixo, a uma taxa de fluxo inferior a um mililitro por minuto, remova ligantes não covalentemente ligados da resina.

Injete seis mililitros da solução de ativação e incubar a coluna por 15 minutos. Depois disso, injete seis mililitros de solução de pH baixa na coluna. Seguido por seis mililitros da solução de ativação.

Em seguida, injete outros seis mililitros de solução de pH baixo na coluna. Injete dois mililitros de solução de armazenamento na coluna e armazene-a a quatro graus Celsius. Primeiro prepare 100 mililitros do extrato da planta clarificada contendo 2F5, ou o sobrenante para o sistema de expressão baseado em células preferida, que também contém 2F5.

Em seguida, prepare o buffer de equilíbrio, e o buffer de ilusão de força X de alta altura, conforme descrito no protocolo de texto. Lave o sistema de cromatografia com os tampões. Monte uma coluna de afinidade DFE no sistema de cromatografia.

E equilibre-se com cinco CV de tampão de equilíbrio, a uma taxa de fluxo de um mililitro por minuto. Monitore a absorvância UV a 280 nanômetros. Em seguida, carregue 80 mililitros do extrato da planta clarificado, ou o sobrenante na coluna a uma taxa de fluxo de 5 mililitros por minuto.

Para garantir um tempo de contato de dois minutos. Colete o fluxo através de amostras em duas frações mililitros ou reconstrução de curva inovadora. Armazene o fluxo através de amostras a quatro graus Celsius, se a análise amostral imediata não for possível.

Depois desta lavagem a coluna com 6CV de tampão de equilíbrio. Colete uma amostra no início, meio e fim da lavagem. Diluir o MAB2F5 com cinco volumes de tampão de ilusão de alta resistência iônica.

Colete a fração DFE quando o sinal UV a 280 nanômetros tiver aumentado para cinco mili milimétricos de absorção acima da linha de base. Otimize o tampão de ilusão para cada par de anticorpos epitope- anticorpos, conforme descrito no protocolo de texto. A proteína de fusão DFE é expressa em plantas de tabaco transgênicas, cultivadas em uma estufa.

A recuperação global do DFE é de 23,5 miligramas por quilograma. Com uma pureza de mais de 90% A quantidade absoluta de DFE imobilizada na resina aumenta com a massa de DFE injetada na coluna, e planaltos em torno de 15 gramas por litro, enquanto o rendimento do acoplamento diminui continuamente à medida que mais DFE é injetado. As moléculas dfe são vistas para manter sua florescência vermelha, mesmo após o acoplamento.

A intensidade da cor corresponde à quantidade total de DFE imobilizado. Portanto, a cor da coluna pode ser usada como um simples parâmetro de controle de qualidade para estimar a eficiência do acoplamento e a qualidade da coluna. O anticorpo 2F5 recombinante é produzido transitoriamente em plantas nicotiana benthamiana cultivadas em um fitotrono.

A captura de 2F5 do extrato da planta bruta, é testada usando colunas de afinidade, juntamente com aproximadamente sete miligramas de DFE purificado. Uma concentração de cloreto de magnésio de 1,25 molar é suficiente para elute 2F5 da resina de afinidade DFE com uma recuperação próxima de 100% e uma pureza de aproximadamente 97%, o que é comparável às resinas da proteína A. O DBC da resina de afinidade DFE a 10%2F5 avanço, diminui linearmente ao longo dos 25 ciclos, para cerca de 15% do valor inicial.

Usamos um desenho de abordagem de experimentos para otimizar a capacidade de acoplamento do nosso ligante de afinidade. Essas condições podem ser afinadas para outros ligantes no futuro. Nosso método usa proteína florescente para roscar uma proteína sub-portadora para o ligante específico do produto.

Ao mesmo tempo, basta adicionar funções como um indicador de qualidade visual do procedimento de mobilização, fornecendo um feedback imediato e intuitivo ao operador.