Name: Métodos de Pesquisa em Cloroplastos: Investigando o Alvo, Localização e Interações das Proteínas Cloroplastas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 2 min 45 s
Description: Explore métodos de pesquisa em cloroplastos para investigar importação, localização e interações proteicas usando Arabidopsis thaliana. Essas técnicas complementares avançam o conhecimento sobre biogênese de cloroplastos e biotecnologia vegetal.

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<ol><li>Jarvis, P., López-Juez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+and+homeostasis+of+chloroplasts+and+other+plastids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).</li>
<li>Ling, Q., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+import+into+chloroplasts+isolated+from+stressed+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein import into chloroplasts isolated from stressed plants.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).</li>
<li>Aronsson, H., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+isolating+import-competent+Arabidopsis+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">A simple method for isolating import-competent Arabidopsis chloroplasts.</a> FEBS Letters. 529 (2-3), 215-220 (2002).</li>
<li>Fitzpatrick, L. M., Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+isolating+a+high+yield+of+Arabidopsis+chloroplasts+capable+of+efficient+import+of+precursor+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">A method for isolating a high yield of Arabidopsis chloroplasts capable of efficient import of precursor proteins.</a> Plant Journal. 27 (1), 59-65 (2001).</li>
<li>Ling, Q., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+chloroplast+protein+import+by+the+ubiquitin+E3+ligase+SP1+is+important+for+stress+tolerance+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of chloroplast protein import by the ubiquitin E3 ligase SP1 is important for stress tolerance in plants.</a> Current Biology. 25 (19), 2527-2534 (2015).</li>
<li>Lee, J., Kang, H., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+protein+import+into+chloroplasts+using+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Studying protein import into chloroplasts using protoplasts.</a> Journal of Visualized Experiments. (142), (2018).</li>
<li>Asher, A., Ganesan, I., Klasek, L., Theg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+physiologically+active+thylakoids+and+their+use+in+energy-dependent+protein+transport+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of physiologically active thylakoids and their use in energy-dependent protein transport assays.</a> Journal of Visualized Experiments. (139), (2018).</li>
<li>Bouchnak, I., Moyet, L., Salvi, D., Kuntz, M., Rolland, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+chloroplast+sub-compartments+from+Arabidopsis+for+the+analysis+of+protein+Localization+by+immunoblotting+or+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of chloroplast sub-compartments from Arabidopsis for the analysis of protein Localization by immunoblotting or proteomics.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).</li>
<li>Salvi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AT_CHLORO%3A+the+first+step+when+looking+for+information+about+subplastidial+localization+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">AT_CHLORO: the first step when looking for information about subplastidial localization of proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1829, 395-406 (2018).</li>
<li>Shanmugabalaji, V., Douet, V., Agne, B., Kessler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+purification+of+chloroplast+translocon+protein+complexes+using+the+TAP+tag%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Affinity purification of chloroplast translocon protein complexes using the TAP tag.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), (2018).</li>
<li>Kikuchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Ycf2-FtsHi+heteromeric+AAA-ATPase+complex+is+required+for+chloroplast+protein+import%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A Ycf2-FtsHi heteromeric AAA-ATPase complex is required for chloroplast protein import.</a> Plant Cell. 30 (11), 2677-2703 (2018).</li>
<li>Rantala, M., Paakkarinen, V., Aro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+thylakoid+membrane+protein+complexes+by+blue+native+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analysis of thylakoid membrane protein complexes by blue native gel electrophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. (139), (2018).</li>
<li>Kikuchi, S., Hirohashi, T., Nakai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+preprotein+translocon+at+the+outer+envelope+membrane+of+chloroplasts+by+blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the preprotein translocon at the outer envelope membrane of chloroplasts by blue native PAGE.</a> Plant and Cell Physiology. 47 (3), 363-371 (2006).</li>
<li>Chen, L. J., Li, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+megadalton+TOC-TIC+supercomplexes+as+major+mediators+of+protein+import+into+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Stable megadalton TOC-TIC supercomplexes as major mediators of protein import into chloroplasts.</a> Plant Journal. 92 (2), 178-188 (2017).</li>
<li>Jarvis, R. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJarvis%2C+RP+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. JM, W. alker 775, Humana Press. New York City. 432(2011).</li>
<li>Jarvis, R. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJarvis%2C+RP+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. JM, W. alker 774, Humana Press. New York City. 374(2011).</li>
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métodos de pesquisa em cloroplastos: investigando o alvo, localização e interações das proteínas cloroplastas

Chloroplast Research Methods: Probing The Targeting, Localization And Interactions Of Chloroplast Proteins

Métodos de Pesquisa em Cloroplastos: Investigando o Alvo, Localização e Interações das Proteínas Cloroplastas

Chloroplasts are the organelles that define plants1. Along with many other metabolic, developmental and signaling functions, chloroplasts are responsible ...

Bem-vindo às Coleções de Métodos JoVE sobre Métodos de Pesquisa em Cloroplastos, curadas pelo nosso editor convidado, Paul Jarvis. Esta coleção abrange uma ampla variedade de técnicas in vitro e in vivo que caracterizam interações proteicas dentro dos cloroplastos. Pesquisadores da Universidade de Oxford descrevem um método in vitro usando cloroplastos isolados, que são incubados com proteínas marcadas radioativamente para monitorar sua absorção.Esse método é um desenvolvimento de abordagens anteriores usadas para estudar a importação de proteínas de cloroplastos in vitro. Em seguida, de forma complementar, a importação de proteína de cloroplasto é examinada in vivo. Esse método utiliza expressão transitória de proteínas quiméricas e protoplastos para examinar mudanças no tamanho da proteína e localização, por meio de imunoblotting e microscopia de fluorescência.Neste vídeo de método, os autores examinaram o sistema de membranas tilacoides presente nos cloroplastos. Ao isolar as membranas, as vias de translocação de proteínas são elucidadas nos cloroplastos por meio de SDS-PAGE e imagem por fósforo. Pesquisadores na França aplicam diferentes métodos de centrifugação para isolar os subcompartimentos encontrados nos cloroplastos.Essas frações celulares isoladas são então analisadas por imunoblotting e proteômica para fornecer informações sobre a localização suborganela das proteínas cloroplastas. Em seguida, pesquisadores suíços utilizaram purificação por afinidade de complexos multiproteicos de cloroplastos para examinar a maquinaria molecular envolvida na importação de proteínas. Especificamente, os complexos multiproteicos de fala e carrapato embutidos nas membranas do envelope.Em uma abordagem complementar, os cientistas caracterizam o complexo proteico tilacoide da planta em Arabidopsis usando Blue Native PAGE, ou BN-PAGE, que permite a separação dos complexos proteicos em sua forma nativa e funcional. Os complexos são analisados mais detalhadamente via página SDS 2D. Você acabou de ter um vislumbre dos vários métodos usados para estudar proteínas de cloroplastos em nossa Coleção de Métodos JoVE.Você pode ver os artigos em detalhes na página da Coleção de Métodos de Pesquisa sobre Cloroplastos mostrada no link na tela.

chloroplast-research-methods-probing-targeting-localization

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

A abordagem descrita comparativa, quantitativa proteómica visa obter conhecimentos sobre a composição de complexos multiproteicos sob diferentes condições e é demonstrada através da comparação geneticamente diferentes estirpes. Para a análise quantitativa de volumes iguais de diferentes fracções de um gradiente de densidade de sacarose são misturados e analisados ​​por espectrometria de massa.

Uma Nova Abordagem para a Análise Comparativa de Complexos Multiproteicos Baseado em<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabólica Labeling e quantitativa Espectrometria de Massa

A formação de complexos de proteína in vivo, podem ser visualizados por fluorescência bimolecular complementação. Parceiros de interacção são fundidas com as peças complementares de marcas fluorescentes e transitoriamente expressa em folhas de tabaco, resultando num sinal fluorescente reconstituído na estreita proximidade das duas proteínas.

Interações proteína-proteína visualizado por Bimolecular Fluorescência de Complementação em tabaco Protoplastos e folhas

Aqui nós descrevemos um novo método para estudar importação proteína em cloroplastos isolados sob estresse. O método é simples e rápida, e pode ser aplicado para estudar as consequências das diferentes condições de estresse para a importação de proteína do cloroplasto, e os mecanismos de regulação correspondentes.

Análise de importação proteína em cloroplastos isolados de plantas estressadas

Aqui, apresentamos um protocolo de captura interativo aplicado aos protoplastos de mesofila da folha de Arabidopsis thaliana . Este método baseia-se criticamente na reticulação UV in vivo e permite o isolamento e identificação de proteínas de ligação a mRNA de plantas a partir de um ambiente fisiológico.

Capacidade de interactomo do mRNA a partir de protoplastos de plantas

Apresentamos os protocolos neste documento para isolamento de alto rendimento de fisiologicamente ativo contém e ensaios de transporte da proteína para a translocação de arginina gêmeo cloroplasto (cpTat), secretora (cpSec1) e percursos de partícula (cpSRP) de reconhecimento de sinal.

Isolamento de fisiologicamente ativo contém e a sua utilização em ensaios de transporte de energia-dependente da proteína

Aqui descrevemos um protocolo para expressar proteínas em protoplastas usando o método de transformação mediada por PEG. O método fornece fácil expressão de proteínas de interesse e investigação eficiente de localização da proteína e o processo de importação para as várias condições experimentais in vivo.

Estudando a importação de proteínas em cloroplastos usando protoplastas

Aqui apresentamos um protocolo testado e comprovado para a purificação do cloroplasto complexos de importação de proteínas (complexo de TIC-TOC) usando a torneira-tag. O protocolo de afinidade-isolamento de uma etapa potencialmente pode ser aplicado a qualquer proteína e ser usado para identificar novos parceiros de interação por espectrometria de massa.

Purificação da afinidade do cloroplasto Translocon proteínas complexos usando a marca de torneira

Aqui, descrevemos um método para purificar cloroplastos intactos de Arabidopsis folhas e seus três principais compartimentos sub (envelope, estroma e contém), usando uma combinação de centrifugações diferenciais, contínuo de Percoll, e gradientes de sacarose descontínuo. O método é valioso para subplastidial e Localização subcellular das proteínas por immunoblotting e proteômica.

Preparação de cloroplasto sub compartimentos de Arabidopsis para a análise da localização da proteína pelo Immunoblotting ou Proteomics

Muitas espécies de plantas alteram o posicionamento de cloroplastos para otimizar a absorção de luz. Este protocolo descreve como usar um instrumento simples e caseiro para investigar o movimento do cloroplasto nas folhas arabidopsis thaliana usando mudanças na transmissão da luz através de uma folha como proxy.

Usando mudanças na transmissão de folhas para investigar movimento de cloroplasto em Arabidopsis thaliana

A necessidade de novas abordagens para o estudo dos sítios de contato com membranas (SCM) tem crescido devido ao crescente interesse no estudo dessas estruturas celulares e seus componentes. Aqui, apresentamos um protocolo que integra tecnologias de microscopia previamente disponíveis para identificar e quantificar complexos proteicos intra-organelas e interorganelas que residem em SCGs.

Visualização e quantificação de interações endógenas intra-organelas em sítios de contato ER-mitocôndrias por ensaios de ligadura de proximidade

Explore métodos de pesquisa em cloroplastos para investigar importação, localização e interações proteicas usando Arabidopsis thaliana. Essas técnicas complementares avançam o conhecimento sobre biogênese de cloroplastos e biotecnologia vegetal.

Métodos de Pesquisa em Cloroplastos: Investigando o Alvo, Localização e Interações das Proteínas Cloroplastas

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