Name: Microarrays de DNA e RNA de alta densidade-síntese fotolitográfica, hibridação e preparação de grandes bibliotecas de ácidos nucleicos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Aprenda a sintese fotolitográfica de microarrays de DNA e RNA para estudos de interações entre ácidos nucleicos e proteínas. Este método permite criar bibliotecas de sequências com alta diversidade.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado pelo Austrian Science Fund (FWF concede P23797, P27275 e P30596) e pela Swiss National Science Foundation (Grant #PBBEP2_146174).

<ol><li>Bumgarner, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBumgarner%2C+R+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22">Current protocols in molecular biology</a>. 101, 22(2013).</li>
<li>Berger, M. F., Bulyk, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+protein-binding+microarrays+for+the+comprehensive+characterization+of+the+DNA-binding+specificities+of+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors.</a> Nature Protocols. 4 (3), 393-411 (2009).</li>
<li>Tietjen, J. R., Donato, L. J., Bhimisaria, D., Ansari, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-specificity+and+energy+landscapes+of+DNA-binding+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Sequence-specificity and energy landscapes of DNA-binding molecules.</a> Methods in enzymology. 497, 3-30 (2011).</li>
<li>Katilius, E., Flores, C., Woodbury, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+sequence+space+of+a+DNA+aptamer+using+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Exploring the sequence space of a DNA aptamer using microarrays.</a> Nucleic Acids Research. 35 (22), 7626-7635 (2007).</li>
<li>Franssen-van Hal, N. L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+Light-Directed+Synthesis+of+Aptamer+Microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Optimized Light-Directed Synthesis of Aptamer Microarrays.</a> Analytical Chemistry. 85 (12), 5950-5957 (2013).</li>
<li>Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+Chemistry+.4.+Synthesis+of+Deoxyoligonucleotides+on+a+Polymer+Support%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Nucleotide Chemistry .4. Synthesis of Deoxyoligonucleotides on a Polymer Support.</a> Journal of the American Chemical Society. 103 (11), 3185-3191 (1981).</li>
<li>Eroshenko, N., Kosuri, S., Marblestone, A. H., Conway, N., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Assembly+from+Chip-Synthesized+Oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Gene Assembly from Chip-Synthesized Oligonucleotides.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 2012, (2012).</li>
<li>Kosuri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+gene+synthesis+by+selective+amplification+of+DNA+pools+from+high-fidelity+microchips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Scalable gene synthesis by selective amplification of DNA pools from high-fidelity microchips.</a> Nature Biotechnology. 28 (12), 1295(2010).</li>
<li>Richmond, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+and+assembly+of+chip-eluted+DNA+%28AACED%29%3A+a+method+for+high-throughput+gene+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Amplification and assembly of chip-eluted DNA (AACED): a method for high-throughput gene synthesis.</a> Nucleic Acids Research. 32 (17), 5011-5018 (2004).</li>
<li>Schmidt, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+amplification+of+strand+subsets+from+chip-synthesized+oligonucleotide+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Scalable amplification of strand subsets from chip-synthesized oligonucleotide libraries.</a> Nature Communications. 6, (2015).</li>
<li>Grass, R. N., Heckel, R., Puddu, M., Paunescu, D., Stark, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+Chemical+Preservation+of+Digital+Information+on+DNA+in+Silica+with+Error-Correcting+Codes%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Robust Chemical Preservation of Digital Information on DNA in Silica with Error-Correcting Codes.</a> Angewandte Chemie International Edition. 54 (8), 2552-2555 (2015).</li>
<li>Erlich, Y., Zielinski, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Fountain+enables+a+robust+and+efficient+storage+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">DNA Fountain enables a robust and efficient storage architecture.</a> Science. 355 (6328), 950-953 (2017).</li>
<li>Garalde, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+parallel+direct+RNA+sequencing+on+an+array+of+nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly parallel direct RNA sequencing on an array of nanopores.</a> Nature Methods. 15 (3), 201-206 (2018).</li>
<li>Cleary, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+complex+nucleic+acid+libraries+using+highly+parallel+in+situ+oligonucleotide+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Production of complex nucleic acid libraries using highly parallel in situ oligonucleotide synthesis.</a> Nature Methods. 1 (3), 241-248 (2004).</li>
<li>LeProust, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+high-quality+libraries+of+long+%28150mer%29+oligonucleotides+by+a+novel+depurination+controlled+process%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Synthesis of high-quality libraries of long (150mer) oligonucleotides by a novel depurination controlled process.</a> Nucleic Acids Research. 38 (8), 2522-2540 (2010).</li>
<li>Lietard, J., Damha, M. J., Somoza, M. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLietard%2C+J+%22Enzymatic+and+Chemical+Synthesis+of+Nucleic+Acid+Derivatives%22">Enzymatic and Chemical Synthesis of Nucleic Acid Derivatives</a>. Fernández-Lucas, J. , Wiley Online Books. (2018).</li>
<li>Fodor, S. P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+Addressable+Parallel+Chemical+Synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spatially Addressable Parallel Chemical Synthesis.</a> Science. 251 (4995), 767-773 (1991).</li>
<li>Singh-Gasson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maskless+fabrication+of+light-directed+oligonucleotide+microarrays+using+a+digital+micromirror+array%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Maskless fabrication of light-directed oligonucleotide microarrays using a digital micromirror array.</a> Nature Biotechnology. 17 (10), 974-978 (1999).</li>
<li>Pease, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-Generated+Oligonucleotide+Arrays+for+Rapid+DNA-Sequence+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Light-Generated Oligonucleotide Arrays for Rapid DNA-Sequence Analysis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (11), 5022-5026 (1994).</li>
<li>Holz, K., Lietard, J., Somoza, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Power+365+nm+UV+LED+Mercury+Arc+Lamp+Replacement+for+Photochemistry+and+Chemical+Photolithography%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Sustainable+Chemistry+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">High-Power 365 nm UV LED Mercury Arc Lamp Replacement for Photochemistry and Chemical Photolithography.</a> ACS Sustainable Chemistry & Engineering. 5 (1), 828-834 (2017).</li>
<li>Lackey, J. G., Mitra, D., Somoza, M. M., Cerrina, F., Damha, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetal+Levulinyl+Ester+%28ALE%29+Groups+for+2%E2%80%B2-Hydroxyl+Protection+of+Ribonucleosides+in+the+Synthesis+of+Oligoribonucleotides+on+Glass+and+Microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Acetal Levulinyl Ester (ALE) Groups for 2′-Hydroxyl Protection of Ribonucleosides in the Synthesis of Oligoribonucleotides on Glass and Microarrays.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (24), 8496-8502 (2009).</li>
<li>Lackey, J. G., Somoza, M. M., Mitra, D., Cerrina, F., Damha, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-situ+chemical+synthesis+of+rU-DNA+chimeras+on+chips+and+enzymatic+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Chimica+Oggi-Chemistry+Today%22%5BJournal%5D)">In-situ chemical synthesis of rU-DNA chimeras on chips and enzymatic recognition.</a> Chimica Oggi-Chemistry Today. 27 (6), 30-33 (2009).</li>
<li>Lietard, J., Ameur, D., Damha, M., Somoza, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+RNA+microarrays+synthesized+in+situ+by+photolithography%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">High-density RNA microarrays synthesized in situ by photolithography.</a> Angewandte Chemie International Edition. 57 (46), 15257-15261 (2018).</li>
<li>Agbavwe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency%2C+Error+and+Yield+in+Light-Directed+Maskless+Synthesis+of+DNA+Microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficiency, Error and Yield in Light-Directed Maskless Synthesis of DNA Microarrays.</a> Journal of Nanobiotechnology. 9, (2011).</li>
<li>Sack, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Express+photolithographic+DNA+microarray+synthesis+with+optimized+chemistry+and+high-efficiency+photolabile+groups%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Express photolithographic DNA microarray synthesis with optimized chemistry and high-efficiency photolabile groups.</a> Journal of Nanobiotechnology. 14, (2016).</li>
<li>Kretschy, N., Holik, A. K., Somoza, V., Stengele, K. P., Somoza, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-Generation+o-Nitrobenzyl+Photolabile+Groups+for+Light-Directed+Chemistry+and+Microarray+Synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Next-Generation o-Nitrobenzyl Photolabile Groups for Light-Directed Chemistry and Microarray Synthesis.</a> Angewandte Chemie International Edition. 54 (29), 8555-8559 (2015).</li>
<li>Sack, M., Kretschy, N., Rohm, B., Somoza, V., Somoza, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Light-Directed+Synthesis+of+Mirror-Image+Microarrays+in+a+Photochemical+Reaction+Cell+with+Flare+Suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Light-Directed Synthesis of Mirror-Image Microarrays in a Photochemical Reaction Cell with Flare Suppression.</a> Analytical Chemistry. 85 (18), 8513-8517 (2013).</li>
<li>Lietard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Base-cleavable+microarrays+for+the+characterization+of+DNA+and+RNA+oligonucleotides+synthesized+in+situ+by+photolithography%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Base-cleavable microarrays for the characterization of DNA and RNA oligonucleotides synthesized in situ by photolithography.</a> Chemical Communications. 50 (85), 12903-12906 (2014).</li>
<li>Krotz, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+stability+and+degradation+pathway+of+deoxyribonucleoside+phosphoramidites+in+acetonitrile%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleosides+Nucleotides+%26+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Solution stability and degradation pathway of deoxyribonucleoside phosphoramidites in acetonitrile.</a> Nucleosides Nucleotides & Nucleic Acids. 23 (5), 767-775 (2004).</li>
<li>Hargreaves, J. S., Kaiser, R., Wolber, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Degradation+of+Dg+Phosphoramidites+in+Solution%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleosides+Nucleotides+%26+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">The Degradation of Dg Phosphoramidites in Solution.</a> Nucleosides Nucleotides & Nucleic Acids. 34 (10), 691-707 (2015).</li>
<li>McGall, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficiency+of+light-directed+synthesis+of+DNA+arrays+on+glass+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">The efficiency of light-directed synthesis of DNA arrays on glass substrates.</a> Journal of the American Chemical Society. 119 (22), 5081-5090 (1997).</li>
<li>Collett, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+RNA+microarrays+for+high-throughput+screening+of+antiprotein+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Functional RNA microarrays for high-throughput screening of antiprotein aptamers.</a> Analytical Biochemistry. 338 (1), 113-123 (2005).</li>
<li>Buenrostro, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+RNA-protein+interactions+on+a+massively+parallel+array+reveals+biophysical+and+evolutionary+landscapes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of RNA-protein interactions on a massively parallel array reveals biophysical and evolutionary landscapes.</a> Nature Biotechnology. 32 (6), 562-568 (2014).</li>
<li>Wu, C. -H., Holden, M. T., Smith, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+Fabrication+of+High-Density+RNA+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Enzymatic Fabrication of High-Density RNA Arrays.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (49), 13514-13517 (2014).</li>
<li>Tian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+multiplex+gene+synthesis+from+programmable+DNA+microchips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Accurate multiplex gene synthesis from programmable DNA microchips.</a> Nature. 432 (7020), 1050-1054 (2004).</li>
<li>Lietard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+affinity+landscape+of+Thrombin-binding+aptamers+on+2%27F-ANA%2FDNA+chimeric+G-Quadruplex+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Mapping the affinity landscape of Thrombin-binding aptamers on 2'F-ANA/DNA chimeric G-Quadruplex microarrays.</a> Nucleic Acids Research. 45 (4), 1619-1632 (2017).</li>
</ol>

Os autores certificam que não têm nenhuma afiliação com nenhuma organização para fins lucrativos.

A síntese de DNA e RNA de fase sólida é o pão e a manteiga de todos os laboratórios de química de ácidos nucleicos, e embora a adição do componente de fotolitografia seja reconhecidamente uma operação complexa, a fabricação de Microarray mediada pela luz UV também é um processo muito confiável . É, além, o único método disponível para a síntese in situ do RNA em Microarrays. Ainda assim, como em qualquer procedimento experimental em vários estágios, há um amplo espaço para o erro humano.
Talvez o passo mais crítico é o acoplamento de um phosphoramidite, como ele precisa ser uma reação química constantemente de alto rendimento, a fim de pagar oligonucleotídeos com poucos erros sintéticos. Em nosso protocolo da síntese do microarray, o acoplamento do monomers é ainda mais crucial à qualidade total da síntese desde que o processo da fabricação contorna tampando e impede a purificação do oligonucleotide. As eficiências Stepwise do acoplamento acima de 99% foram calculadas para todos os phosphoramidites fotossensível do ADN e do RNA, mesmo para tempos de acoplamento muito curtos (15 s)24 mas uns rendimentos mais baixos do acoplamento podem ocasionalmente ocorrer, particular no caso de DG amidites. A estabilidade dos fosfatos solubilizados à temperatura ambiente tem sido investigada antes e mostrou-se depender da natureza da nucleobase, com fosfatos de guanosina propensas a degradação extensiva em apenas uma questão de dias29, a 30. Mas, quando armazenada a-25 ° c, a dG fosamidites dissolvidos na ACN como solução de 30 mM foi encontrada estável durante várias semanas. No entanto, a instabilidade relativa das soluções de fosfoidite da dG à temperatura ambiente significa que não devem ser mantidas ligadas ao sintetizador de ADN durante vários dias.
Para Fosfito de RNA, o rendimento do acoplamento é muito dependente da qualidade de fosfoidite (que pode ser avaliado por espectroscopia de RMN de 31P) e tempo de acoplamento. Os tempos de acoplamento de 5 minutos para rA, rG, rC e 2 min para rU parecem necessários. Certamente, nós encontramos que encurtando o tempo da condensação a 2 minutos para todos os phosphoramidites do RNA conduzidos aos sinais significativamente mais baixos da hibridação.
O sintetizador de DNA em si, bem como os reagentes e solventes, certamente precisa ser tão limpo quanto possível, a fim de alcançar o maior rendimento de síntese de oligonucleotídeo. No entanto, materiais insolúveis, sais ou partículas, podem se acumular ao longo do tempo nas linhas e tubulações do sistema de parto, levando a uma diminuição gradual no consumo de reagentes e reactantes. Quando uma limpeza geral do sintetizador não resolver um volume de saída baixo, um aumento no número de pulsos pode ser uma solução alternativa. Particularmente útil no caso de baixo consumo de fosfoidite, a linha no protocolo de acoplamento correspondente ao bombeamento de uma mistura de fosfoidite e ativador (terceira linha da subseção de acoplamento na tabela 1 e tabela 2) pode ser modificada, de 6 a 9 pulsos sem qualquer efeito negativo apreciável na qualidade da síntese. Além disso, o número de pulsos de ativador necessário para trazer a mistura de amidite/ativador para o substrato de síntese (atualmente 6, quarta linha na subseção de acoplamento, ver tabela 1 e tabela 2) depende do próprio sintetizador de DNA, bem como em comprimento da tubagem na célula de síntese. Este número pode ser ajustado após a substituição do monomers com uma solução colorida e contando o número de pulsos necessários para empurrar a mistura colorida para o substrato de vidro para acoplamento.
O método descrito nisto permite a síntese do ADN e do RNA de prosseguir simultaneamente, no mesmo microarray. Os híbridos do ADN e do RNA podem igualmente ser preparados sem nenhuma mudança aos protocolos da fabricação da disposição, e contanto que o protocolo da desproteção da três-etapa for seguido. Entretanto, deve-se notar que os microarrays RNA-somente exigem uma desproteção em duas etapas: um decyanoethylation primeiramente com o et3N seguido pelo hidroxila e pela desproteção baixa com hydrazine. Os nucleobases do ADN foram encontrados para ser desprotegidos incompletamente aquelas circunstâncias, e precisam a etapa adicional em EDA a fim efetuar a remoção completa de grupos do phenoxyacetyl (PAC). Este tratamento extra com EDA é mais curto (5 min) do que para a desproteção padrão de Microarrays de DNA31, mas é suficiente para conduzi-lo para a conclusão após os tratamentos de Trietilamina e hidrazina. Além, um tempo de reação curto com EDA limita a exposição de um oligonucleotide inteiramente-deprotected do RNA às condições básicas.
Uma vantagem da síntese in situ da disposição do RNA sobre métodos alternativos como a mancha ou a transcrição32do ADN,33,34 são a habilidade de armazenar o microchip sintetizado do RNA na forma protegida até o uso, assim evitando o risco de degradação potencial do RNA. Os procedimentos pós-sintéticos para RNA, por outro lado, implicam que os consumíveis e reagentes são mantidos estéreis e que o manuseio é realizado condições livres de RNase. Da nota, nós encontramos que a adição de inibidor de RNase à mistura da hibridação não rende uns sinais mais fortes da hibridação para as características do RNA.
A síntese de bibliotecas de DNA em um monómero sensível à base é mais complexa do que a síntese de algumas seqüências de controle em uma superfície, e como tal é certamente mais propensos a erros de design. No entanto, assumindo que o design da sequência (ou seja, a natureza e o número de sequências) está correto, transformando esta lista em uma coleção de máscaras de exposição e uma série ordenada de ciclos de acoplamento continua a ser um processo simples. No entanto, variações importantes da síntese de Microarray padrão existem e são críticas para uma fabricação bem-sucedida de uma matriz de biblioteca de alta densidade.
Primeiro, um monômero DT sensível à base é acoplado como o primeiro monomers após a síntese do vinculador. O rendimento de acoplamento deste monómero (Figura 1) foi encontrado relativamente baixo, cerca de 85%28, razão pela qual são envidados esforços para melhorar a sua taxa de incorporação, quer aumentando a sua concentração na ACN de 30 mm para 50 mm, ou repetindo o etapa de acoplamento: duas reações de acoplamento consecutivas usando monómeros frescos, ou dois ciclos de acoplamento separados mas consecutivos.
A segunda alteração é a adição de uma solução de β-caroteno na câmara traseira da célula de síntese, que absorve convenientemente a luz de 365 nm. Esta é uma modificação importante da instalação do photolithography porque impede que a luz UV reflita para trás no substrato da disposição. Na verdade, depois de atravessar o meio intersticial entre os substratos, saídas de luz UV de entrada através do slide perfurado e atinge o bloco de quartzo da célula. As equações de Fresnel prevêem que ~ 4% da luz UV do incidente perpendicularmente refletirá de cada uma das três interfaces de ar-vidro a jusante (lado da saída do substrato 2ND e ambos os lados do bloco de quartzo) e de volta para o substrato de síntese, levando a exposição não intencional de oligonucleotides fotoprotegidos. A difração e a dispersão também contribuem para a fotoproteção "off-Target" e, portanto, para a inserção de nucleotídeo, que afeta diretamente a taxa de erro de síntese, mas essas contribuições são muito menores que as reflexões e podem ser abordadas principalmente por reduzindo a densidade de síntese (deixando lacunas entre as feições). Nós encontramos que o nível de solução do β-caroteno na câmara mais baixa da pilha tende a diminuir ligeiramente somente durante os primeiros minutos da síntese da disposição, e conseqüentemente precisa de ser monitorado e readjusted.
Finalmente, a terceira mudança é a solução de desproteção, substituindo EtOH por tolueno, que mantém a biblioteca de DNA clivada ligada à superfície, presumivelmente através de interações eletrostáticas. A aplicação de uma pequena quantidade de água na área de síntese após a lavagem da ACN permite que a biblioteca seja convenientemente recolhida. O processo é entretanto somente bem sucedido se o índice de água no EDA e no tolueno for mínimo, tornando o ácido nucleico inteiramente insolúvel no cocktail do desproteção. Alternativamente, as bibliotecas do ADN podem ser clivadas fora da microplaqueta usando a amônia9,10,14,35, a seguir desprotegidas mais por aquecer o ADN-contendo a solução aquosa da amônia a 55 ° c durante a noite. A recuperação de bibliotecas do ADN que usam a amônia não é entretanto compatível com RNA. Os oligonucleotídeos do RNA em uma carcaça base-cleavable podem ser eluída da superfície usando o mesmo procedimento de EDA/Toluene descrito acima, mas somente no penúltimo estágio após a estratégia de desproteção do dois-passo de et3N e de hidrazina28.
As estratégias alternativas para recuperar associações do oligonucleotide dos Microarrays sem a necessidade para um tratamento básico específico existem, são no princípio compatíveis com photolithography e confiam no uso das enzimas. Por exemplo, um único nucleotide do deoxyuracil pode ser o alvo do uracil-ADN glicolisase (UDG) e extirpado do descanso da seqüência do ADN, ou uma única unidade do RNA pode ser reconhecida pelo tipo 2 enzimas de RNase H e pela ligação 5 do fosfodiéster ao RNA clivada , liberando o 5 ' DNA parte23.
Nós temos agora um método poderoso, de confiança e high-density para a síntese do ADN, do RNA, e dos Microarrays híbridos do ADN/RNA. Estes podem não somente serir como plataformas para a hibridação ou os ensaios de ligação36, mas igualmente representam uma maneira rápida e barata de produzir bibliotecas complexas do ácido nucleico. Para o armazenamento de dados digital baseado em DNA, a fotolitografia de Microarray pode se tornar uma solução potencial para o gargalo de "escrita" (ou seja, para a codificação de informações por síntese). O sucesso na codificação digital no ADN e no conjunto do gene de de novo depende da fidelidade da seqüência que, a nível da síntese, traduz na taxa de erro. Os erros sintéticos e óticos em nossos protocolos atuais da fabricação da disposição serão discutidos e relatados em em outra parte. Paralelamente, os esforços estão agora em andamento para aumentar ainda mais a escala de fabricação e a taxa de transferência.

O uso prático de Microarrays de DNA tem sido tradicionalmente no estudo das variações nos níveis de expressão gênica entre duas populações celulares, utilizando vertentes complementares e fluorescência como método de detecção1. Ocasionalmente, os microarrays de DNA se aventuram em eventos vinculativos com ligantes de ácido não nucleico, como proteínas, com uma estratégia de permutação sistemática de sequências que oferece uma visão abrangente da paisagem vinculativa2,3, 4,5. Esta aproximação transforma eficazmente Microarrays das superfícies simples da hibridação em plataformas com a cobertura larga da seqüência, que seria um recurso para o estudo do mundo mais rico e mais complexo da estrutura e da função do RNA. Apoiado pela reação extremamente eficiente do acoplamento do monomers6, as matrizes sintetizadas in situ do ADN podem agora igualmente ser consideradas como uma fonte barata do ADN7, que está tornando-se particular relevante Considerando a demanda cada vez maior para material de ácido nucleico para o conjunto de genes8,9,nanoestruturas baseadas em DNA10, armazenamento de informações ou sequenciamento11,12. Da mesma forma, as tecnologias de sequenciamento provavelmente se beneficiarão do desenvolvimento de métodos que produzem misturas muito complexas de oligonucleotídeos de RNA13. Neste contexto, os protocolos da fabricação da disposição que permitem que os oligonucleotídeos sejam sintetizados in situ e na alta densidade são coloc idealmente para encontrar as necessidades do campo ràpida de expansão da biotecnologia ácida nucleico. Entretanto, com um campo tão diverso quanto a biotecnologia, a finalidade de cada aplicação pode exigir que o ADN no microarray esteja produzido no elevado-throughput ou com uma quantidade muito baixa de erros sintéticos14,15, ou ambos, exigindo um olhar mais atento para os protocolos de síntese de Microarrays de DNA que, historicamente, foram otimizados principalmente para ensaios de hibridação. Entrementes, a síntese in situ de Microarrays do RNA foi encontrada para ser um esforço desafiante, com a maioria da dificuldade associada com o grupo de protecção para a função 2 '-Oh, geralmente um metade do trimetilsilílicos na síntese padrão da contínuo-fase que é removida com reagentes à base de flúor, produtos químicos incompatíveis com superfícies de vidro ou silício. Estas edições e os desafios na síntese do microarray do ADN e do RNA têm sido ultimamente o assunto de um grande corpo do trabalho, no detalhe com a aproximação da fotolitografia16.
Photolithography usa a luz UV para desbloquear oligonucleotídeos antes do acoplamento e exige máscaras para construir um teste padrão da exposição UV, organizando desse modo espacialmente e controlando o crescimento de oligonucleotídeos. As máscaras físicas foram substituídas por microespelhos controlados por computador cuja inclinação reflete seletivamente a luz UV sobre o substrato microarray17,18,19. Como uma fonte de UV, usamos 365 nm luz de uma fonte de LED de alta potência20. As configurações fotolitográficas atuais são equipadas com as matrizes do micromirror que contêm 1024 × 768 espelhos, correspondendo a mais de 780.000 pontos individualmente enderezáveis ("características") em uma área pequena de apenas 1,4 cm2, ou 1080p com matrizes de 1920 × 1080, ou > 2 milhões de espelhos. Cada um dos espelhos no dispositivo, portanto, tem controle direto sobre a seqüência cultivada no recurso correspondente. Com exceção da luz UV, a fotolitografia funciona como uma técnica de síntese de fase sólida e adota a química de fosfoidite baseada em ciclo. Somente exige uma estratégia inteiramente diferente da proteção para que a síntese do RNA suceda. Nós desenvolvemos uma série nova de fosfatos luz-sensíveis do RNA que carregam grupos protegendo hydrazine-labile21. Estes monómeros permitem que o RNA seja desprotegido condições suaves que não afetam a integridade da superfície. Uma primeira etapa da desproteção usa a trietilamina para remover os grupos de protecção do fosfodiéster do ácido, quando o hidrazina for usado em um segundo, etapa separada para remover aqueles no 2 '-Oh e nas funções exocíclicas da amina. Ao fazer isso, o RNA oligonucleotídeos ~ 30-NT de comprimento e de qualquer seqüência pode agora ser sintetizado in situ em Microarrays22,23. Paralelamente, também recentemente começamos a abordar as questões de produtividade, qualidade e velocidade na fotolitografia de DNA e RNA. Foram mensuradas as eficiências de acoplamento > 99% para todos os amiditos de DNA e RNA (Figura 1) e investigaram cada etapa individual no ciclo de alongamento do oligonucleotídeo, desde o tempo de oxidação, à escolha do ativador e à exposição UV ideal24 , 25. We trouxeram em grupos de protecção 5 ' Light-sensitive novos que podem ser removidos nos segundos somente, transformando a síntese de centenas de milhares de 100mers em um processo de poucas horas-longo26. Nós também dobramos a produção de matriz de fabricação, expondo dois substratos simultaneamente27. Finalmente, nós introduzimos um monomers do descolamento que contem um grupo base-sensível do succinyl como uma maneira conveniente de Cleave, coletam e analisam oligonucleotides do ADN e do RNA, que é central à preparação28da biblioteca.
Apesar do aspecto relativamente mundano da síntese de fase sólida de DNA e RNA, especialmente para os químicos de ácidos nucleicos, a fotolitografia de Microarray continua sendo uma atualização não trivial que exige uma configuração complexa, controle cuidadoso e supervisão do processo, e instruções separadas para manuseio pós-sintético, dependendo da natureza do oligonucleotídeo e do tipo de aplicação. Neste artigo, desejamos fornecer uma apresentação detalhada de todo o procedimento passo a passo da síntese in situ de Microarrays de DNA e RNA por fotolitografia, desde o delineamento experimental até a análise dos dados, com ênfase na elaboração de instrumentos e Consumíveis. Em seguida, descrevemos os métodos de desproteção pós-sintéticos que correspondem à finalidade pretendida da fabricação de Microarray (ou seja, a hibridação ou a recuperação de bibliotecas de ácidos nucleicos).

<table><tbody><tr><td>Funcionalidade de slide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético >99,8%</td><td>Sigma</td><td>33209</td><td>Para roteador CNC de desproteção de RNA</td></tr><tr><td></td><td>Stepcraft</td><td>300 CK</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>VWR</td><td>1.07017.2511</td><td>Para desproteção e funcionalização</td></tr><tr><td>N-(3-trietoxissililpropil)-4-hidroxibutiramida</td><td>Gelest</td><td>SIT8189.5</td><td>Reagente de silanização</td></tr><tr><td>Nexterion Glass D lâminas de microscópio</td><td>Schott</td><td>1095568</td><td></td></tr><tr><td>Polymax 1040</td><td>Heidolph</td><td></td><td>Agitador orbital</td></tr><tr><td>Proclean 507 Banho-maria ultrassônico</td><td>Ulsonix</td><td></td><td>Para limpar lâminas após a perfuração</td></tr><tr><td>Tickopur RW 77 Limpador para fins especiais</td><td>Sigma</td><td>Z860086</td><td>Para limpar lâminas após a perfuração</td></tr><tr><td>Síntese de microarray</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.25 M dicyanoimidazole em ACN</td><td>Biosolve</td><td>0004712402BS</td><td>Ativador</td></tr><tr><td>0.7 XGA DMD</td><td>Texas Instruments</td><td></td><td>Digital Micromirror Device</td></tr><tr><td>20 mM I2 em piridina/H2O/THF</td><td>Sigma</td><td>L860020-06</td><td>Oxidante</td></tr><tr><td>250 &mu; m grosso Chemraz 584 perfluoroelastômero</td><td>FFKM</td><td></td><td>Junta de teflon inferior</td></tr><tr><td>2'-O-ALE RNA fosforamiditos</td><td>ChemGenes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>365 nm UV-LED de alta potência</td><td>Nichia</td><td>NVSU333A</td><td></td></tr><tr><td>5'BzNPPOC DNA fosforamidites</td><td>Orgentis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5'NPPOC DNA fosforamidites</td><td>FlexGen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrila</td><td>Biosolve</td><td>0001205402BS</td><td>Para síntese de DNA</td></tr><tr><td>Diluente de amidita para síntese de DNA</td><td>Sigma</td><td>L010010</td><td>Para dissolver fosforamiditas</td></tr><tr><td>dT Cleavável</td><td>ChemGenes</td><td></td><td>Monômero sensível à base para preparação de biblioteca</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Biosolve</td><td>0004474701BS</td><td>Como solvente de exposição</td></tr><tr><td>DNA e desproteção de microarray de RNA </td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>etilenodiamina >99,5%</td> <td>Sigma</td><td>3550</td><td>Para desproteção</td></tr><tr><td>Expedite 8909</td><td>Sintetizador de DNA</td><td>PerSeptive Biosystems</td><td></td></tr><tr><td>Hidrato de hidrazina 50-60% hidrazina</td><td></td><td>Sigma 225819</td><td>Para desproteção de RNA</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma</td><td>56750</td><td></td></tr><tr><td>Força Industrial fita de PTFE de baixa densidade</td><td>Gasoila</td><td></td><td>Fina, superior teflon gaxeta</td></tr><tr><td>Piridina >99%</td> <td>Sigma</td><td>P57506</td><td>Para desproteção de RNA</td></tr><tr><td>Trietilamina >99%</td> <td>Sigma</td><td>T0886</td><td>Para desproteção</td></tr> de <tr><td>RNA&beta;-caroteno</td><td>Sigma</td><td>C9750</td><td>Para preparação</td></tr> <tr><td>de bibliotecaHibridização e digitalização</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20x Citrato de Sódio Salino Roth</td><td></td><td>1054.1</td><td></td></tr><tr><td>5'Cy3-marcado fio complementar</td><td>Eurogentec</td><td></td><td>Para hibridização duplex</td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga Biopur Safe-Lock</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA (10 mg/mL)</td><td>Promega</td><td>R3961</td><td></td></tr><tr><td>EDTA grau de biologia molecular</td><td>Promega</td><td>H5031</td><td></td></tr><tr><td>GenePix 4100A</td><td>Dispositivos Moleculares</td><td></td><td>Microarray scanner</td></tr><tr><td>Forno de hibridização</td><td>Boekel Scientific</td><td>230500</td><td></td></tr><tr><td>MES monohidratado</td><td>Sigma</td><td>69889</td><td></td></tr><tr><td>MES sódio</td><td>Sigma</td><td>M3058</td><td></td></tr><tr><td>NaCl >99,5%</td> <td>Sigma</td><td>71376</td><td></td></tr><tr><td>SecureSeal SA200 câmara de hibridização</td><td>Grace BioLabs</td><td>623503</td><td></td></tr><tr><td>Spectrafuge mini</td><td>Labnet</td><td>C1301</td><td>Microarray Microarray</td></tr><tr><td>grau Tween-20 grau de biologia molecular</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Extração de dados</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>para extração de dados</td></tr><tr><td>MatLab</td><td>MathWorks</td><td></td><td>Microarray design</td></tr><tr><td>NimbleScan 2.1</td><td>Roche NimbleGen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dessalinização e quantificação</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One Espectrofotômetro</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tolueno</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZipTip C18</td><td>Millipore</td><td>ZTC18s008</td><td>Pontas de pipeta de dessalinização</td></tr></tbody></table>

microarrays de dna e rna de alta densidade-síntese fotolitográfica, hibridação e preparação de grandes bibliotecas de ácidos nucleicos

High-Density DNA and RNA microarrays - Photolithographic Synthesis, Hybridization and Preparation of Large Nucleic Acid Libraries

Photolithography é uma técnica poderosa para a síntese de oligonucleotídeos do ADN em corrediças de vidro, porque combina a eficiência de reações do acoplamento do monomers com a precisão e a densidade da luz UV refletida dos espelhos micrometer-feitos medida. A fotolitografia produz Microarrays que podem acomodar de centenas de milhares até vários milhões de seqüências de DNA diferentes, 100-NT ou mais, em apenas algumas horas. Com este espaço muito grande da seqüência, os microarrays são plataformas ideais para explorar os mecanismos do ácido nucleico · interações do ligand, que são particular relevantes no caso do RNA. Nós relatado recentemente na preparação de um jogo novo de phosphoramidites do RNA compatíveis com o photolithography in situ e que foram usados subseqüentemente para crescer oligonucleotides do RNA, homopolímeros assim como seqüências da misturado-base. Aqui, ilustramos detalhadamente o processo de fabricação de Microarray de RNA, desde o projeto experimental, até a configuração instrumental, síntese de matriz, desproteção e ensaio de hibridação final usando uma seqüência de modelo 25mer contendo todas as quatro bases como um exemplo. Paralelamente, vamos além de experimentos baseados em hibridação e exploramos a fotolitografia de Microarray como uma porta de entrada barata para bibliotecas de ácidos nucleicos complexos. Para isso, os microarrays de DNA de alta densidade são fabricados em um monómero sensível à base que permite que o DNA seja convenientemente clivada e recuperado após síntese e desproteção. O protocolo de fabricação é otimizado de modo a limitar o número de erros sintéticos e, para esse efeito, uma camada de solução de β-caroteno é introduzida para absorver fótons de UV que, de outra forma, podem refletir de volta para os substratos de síntese. Nós descrevemos em uma maneira passo a passo o processo completo da preparação da biblioteca, do projeto à clivagem e à quantificação.

Hibridação do microarray do ADN e do RNA A Figura 5 mostra os resultados de um ensaio da hibridação executado em um microarray que contem as versões do ADN e do RNA de uma seqüência 25mer (5 '-GTCATCATCATGAACCACCCTGGTC-3 ' no formulário do ADN). A varredura na Figura 5a aparece em um formato de greenscale correspondente ao espectro de excitação/emissão de fluorescência Cy3, com intensidade de fluorescência registrada em unidades arbitrárias entre 0 e 65536. O design da matriz seguiu o layout de recurso 25:36 descrito na seção de protocolo. A digitalização é mostrada após a orientação adequada da matriz, com o canto superior esquerdo preenchido com a cadeia mais longa de recursos de características. Aqui, as características da propriedade contêm a versão do ADN do 25mer e devem, no princípio, sempre dar um sinal positivo da fluorescência a fim executar o alinhamento da varredura e a extração dos dados. O microarray hibridizado deve aparecer uniformemente brilhante, com as bordas da área de síntese sendo no entanto geralmente mais brilhante do que o centro (até 50% mais brilhante). A grande quantidade de repetições de sequências, distribuídas aleatoriamente em toda a área, reduz o impacto de artefatos espaciais. Aqui, cada seqüência (DNA e RNA) foi sintetizada em 2.000 locais aleatórios. Há tipicamente baixo ruído da fluorescência (fundo), &lt; 50 u.a., que conduz a uma relação do sinal/ruído na ordem de 200:1 a 800:1 em ensaios da hibridação. Após a extração dos dados, intensidades de fluorescência são médias e plotadas ± DP.
Há variabilidade significativa nos valores de fluorescência absoluta entre experimentos. Aqui, mostramos os resultados de três sínteses independentes utilizando os mesmos parâmetros de fabricação e o mesmo manuseio pós-sintético. O DNA 25mer, quando hibridizado a sua vertente complementar Cy3-etiquetada do ADN, produzirá os sinais da fluorescência que variam em qualquer lugar de 20.000 a 30.000, muito raramente acima ou abaixo. O RNA 25mer, quando hibridizado ao mesmo complemento Cy3-etiquetado do ADN, dará intensidades da fluorescência nas características correspondentes que variam de 15.000 a 20.000. Entretanto, a intensidade da fluorescência dos duplex do RNA/ADN cairá ocasionalmente abaixo de 8.000, quando os duplex correspondentes do ADN/ADN ainda fluorescência dentro da escala 20000-30000. Em tais casos, os resultados para o RNA podem ser considerados como secundário-optimal. Uma síntese ou falha de hibridação, seja para DNA ou RNA, será imediatamente perceptível durante a digitalização a partir da óbvia falta de fluorescência. Há umas oportunidades múltiplas para que a síntese do RNA falhe ou seja parcialmente suceder e serão esboçadas na divisória da discussão.
Desproteção, clivagem e recuperação da biblioteca Dependendo da complexidade e da densidade da biblioteca, a forma e o contorno da matriz sintetizada podem ser vistos sem ampliação, mas iluminação adequada (Figura 4), com o DNA ainda em forma protegida. Após a desproteção com EDA/tolueno, e antes da adição de água, a fim de coletar a biblioteca clivada, a área de síntese contendo os oligonucleotídeos agora desprotegidos pode se destacar como uma zona hidrofílica, quando o resto da lâmina de vidro aparecerá coberto com uma camada hidrofóbica turva. A observação direta da área de síntese depende da área total utilizada para sintetizar oligonucleotídeos: maior uso da área de síntese corresponderá a maior chance de distinção clara entre regiões hidrofílicas e hidrofóbicas na superfície. Inversamente, bibliotecas sintetizadas usando menos espelhos e com recursos menores podem não ser imediatamente observáveis.
Da mesma forma, a quantidade de DNA recuperado após a dessalinagem é diretamente proporcional à área total usada para síntese. Se todas as características são usadas para a síntese do oligonucleotide, a clivagem e o procedimento da recuperação devem render entre 25 e 30 pmol do ADN. Um uso de 10% da área de síntese, portanto, vai pagar apenas cerca de 3 pmol de DNA.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig1v2.jpg"> Figura 1 . As estruturas químicas do DNA e do RNA phosphoramidites usaram-se na síntese do oligonucleotide pela fotolitografia do Microarray. Os grupos de protecção fotossensível padrão de nitrophenylpropyloxycarbonyl (nppoc) no 5 '-Oh são usados na síntese regular do microarray do ADN e do RNA para finalidades da hibridação. Para a síntese de bibliotecas complexas do ADN, mais fotolábeis Benzyl-nppoc (bznppoc) é preferido no 5 '-Oh, porque bznppoc é removido duas vezes tão rapidamente quanto nppoc, que reduz significativamente o tempo total da síntese do Microarray. Os oligonucleotídeos do ADN para bibliotecas igualmente exigem o acoplamento de um monômero ligante do descolamento na extremidade 3 '. Este monómero, que carrega uma função de éster succinílico, será clivada durante a desproteção, permitindo que o DNA seja coletado do microchip. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig2v2.jpg"> Figura 2 . Exemplo de uma máscara como um arquivo de imagem enviado para o dispositivo Micromirror durante a exposição UV. Os pixels brancos correspondem aos espelhos que serão inclinados na posição "on", refletindo a luz UV sobre a célula de síntese. Pixels pretos correspondem a "off" espelhos, onde a luz UV será refletida longe da célula. Os pixéis brancos permitirão conseqüentemente para o acoplamento do monomers entrante seguinte nos oligonucleotídeos encontrados nas características correspondentes nos substratos de vidro. Os oligonucleotides sintetizados nas características cujos espelhos correspondentes são, neste arquivo da máscara, os pixéis pretos permanecerão inertes entretanto durante o evento de acoplamento seguinte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig2v2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig3v2.jpg"> Figura 3 . Fotografias do microarray fotolitografia óptica e configuração de síntese. (A) circuito óptico para exposição A UV. A luz UV do UV-LED é homogeneizada pela primeira vez através de um tubo de luz retangular-cross-section, em seguida, reflete sobre os microespelhos. Os microespelhos que foram inclinados em uma posição "OFF" refletirão a luz UV longe da célula de síntese, mas os microespelhos na posição "ON" refletirão a luz na célula de síntese, situada no plano focal, pela primeira passagem através de um relé 1:1 Offner sistema de imagem. (B) a célula de síntese, uma vez montada, consiste em uma corrediça perfurada colocada primeiramente no bloco de quartzo da pilha, separada por uma gaxeta grossa de PTFE (não mostrada). Um segundo, não-perfurou a corrediça é posicionada então sobre a corrediça perfurada, separada por uma gaxeta fina de PTFE. Uma armação metálica (não mostrada) mantém a montagem unida. (C). para a preparação da biblioteca, uma vez que a célula de síntese é anexada no plano focal de entrada de luz UV, a câmara localizada entre o bloco de quartzo e o slide perfurado é preenchido com uma solução de 1% de β-caroteno em ch2CL2. Para isso, um tubo de entrada e saída adicional é anexado ao bloco de quartzo e a solução laranja flui do mais à direita para a posição mais à esquerda. O fluxo de reagentes e solventes para a síntese é mostrado em setas brancas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig4.jpg"> Figura 4 . A área de síntese é geralmente visível a olho nu. Aqui, uma biblioteca de DNA pode ser vista na superfície de vidro logo após a síntese, com o DNA ainda em forma protegida. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig5v2.jpg"> Figura 5 . Os ensaios da hibridação às seqüências do ADN 25mer e do RNA sintetizados in situ em Microarrays. (A) varredura da fluorescência do ADN e do microarray hibridizados inteiros do RNA. Os oligonucleotídeos do ADN e do RNA 25mer são hibridizados a suas costas complementares Cy3-etiquetadas. A matriz foi digitalizada com um laser em um comprimento de onda de excitação de 532 nm, com resolução de 5 μm. (B) intensidades de fluorescência (unidades arbitrárias) do DNA: DNA e RNA: duplex de DNA em três experimentos distintos. Os dados verdes claros para oligonucleotídeos sintetizados in situ do RNA podem ser considerados suboptimal, quando comparados à intensidade da fluorescência das seqüências correspondentes do ADN. As barras de erro são SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig5large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig6v2.jpg"> Figura 6 . Representação esquemática do procedimento de desproteção, clivagem e recuperação para bibliotecas de DNA sintetizadas em Microarrays. As sequências de DNA são cultivadas em um nucleosídeo DT clivável sensível à base (mostrado na área ampliada). Após a síntese, a desproteção dos oligonucleotídeos do ADN (os grupos de protecção da base são representados como esferas vermelhas) em EDA/Toluene sae do material deprotected ligado electrostaticamente à superfície e pode então pipetado para fora aplicando uma pequena quantidade de água na área sintetizada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig6large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig7v3.jpg"> Figura 7 . Espectro representativo da absorvência (220-350 nanômetro) de uma biblioteca cleaved, demolhado do ADN que contem 4.000 seqüências diferentes, 100-NT no comprimento. Um total de 940 ng do ADN foi isolado de uma única síntese da disposição, correspondendo a 30 pmol do total do ADN, ou 15 pmol por o substrato de vidro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig7large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/59936/59936table1.jpg"> Tabela 1. Protocolo representativo do ciclo para o acoplamento/oxidação/photodeprotection de 5 '-bznppoc-da, supondo que o monomers correspondente estêve carregado no porto "a". O tempo de acoplamento (em segundos) é mostrado na linha "monômero de casal". O tempo de fotodeproteção UV, aqui correspondente a uma energia radiante de 3 J/cm2 (fotoquímica bznppoc), é calculado como o tempo decorrido entre os dois sinais de comunicação "evento 2 out".
<img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/59936/59936table2.jpg"> Tabela 2. Protocolo representativo do ciclo para o acoplamento/oxidação/photodeprotection de 5 '-nppoc-ra, supondo que o monomers correspondente do RNA estêve carregado no porto "a". O tempo de acoplamento (em segundos) é mostrado na linha "monômero de casal". O tempo de fotodeproteção UV, aqui correspondente a uma energia radiante de 6 J/cm2 (fotoquímica nppoc), é calculado como o tempo decorrido entre os dois sinais de comunicação "evento 2 out".

Neste artigo, apresentamos e discutimos novos desenvolvimentos na síntese e aplicações de Microarrays de ácidos nucleicos fabricados in situ. Especificamente, mostramos como os protocolos de síntese de DNA podem ser estendidos ao RNA e como os microarrays podem ser usados para criar bibliotecas de ácidos nucleicos recuperáveis.

Microarrays de DNA e RNA de alta densidade-síntese fotolitográfica, hibridação e preparação de grandes bibliotecas de ácidos nucleicos

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite ...

Microarrays de DNA e RNA são muito úteis para estudar as interações entre ácidos nucleicos e proteínas, mas também são um método conveniente para a preparação de bibliotecas de sequências. A fotolithografia permite que centenas de milhares de sequências únicas sejam sintetizadas em paralelo e é atualmente o único método direto para a síntese de RNA em microarrays. A síntese fotolithográfica in situ de microarrays também pode ser estendida a oligonucleotídeos quimicamente modificados, por exemplo, com dois fluoros primos de ácidos nucleicos de peptídeos.Ver o processo de fabricação e manuseio de microarray pode ajudar a entender como esse maquinário complexo foi desenvolvido a partir da conhecida síntese de DNA de fase sólida padrão. Inicie este procedimento com design de microarray e funcionalidade deslizante, conforme descrito no protocolo de texto. Ligue o LED UV sintetizador de DNA e seu ventilador de resfriamento.Conecte um medidor de intensidade UV no ponto focal da luz UV de entrada e ligue-o. No computador, inicie o software WiCell Controller. Ligue e inicialize o dispositivo de micromere.Carregue um arquivo de máscara toda branca clicando com o botão direito do mouse em DMD e, em seguida, selecionando a imagem de carga. Clique com o botão direito do mouse no ícone UVS e selecione abertura do obturador UV. Leia o valor de potência no medidor de intensidade e conte 60 segundos.Após 60 segundos, leia novamente o valor de energia e observe os valores de início e fim. Feche o obturador selecionando o obturador UV e desligue o medidor de intensidade. Calcule o valor médio de intensidade UV em milímetros por centímetro quadrado.No software WiCell, carregue os arquivos de trabalho, sequência e protocolo em suas respectivas sub-janelas e clique em enviar os arquivos de sequência e protocolo para o sintetizador de DNA. Para montar a célula de síntese coloque uma espessa junta perfluoroelestomer no bloco de quartzo da célula. Em seguida, coloque um slide de microscópio perfurado e funcionalizado em cima da primeira junta, e verifique se os orifícios nos slides se conectam com a entrada e a tubulação de saída da célula de síntese.Coloque uma segunda junta de politetrafluoroetileno fina sobre o escorregador perfurado, ao redor dos dois orifícios. Por fim, coloque um segundo slide funcionalizado, mas não ondulado, em cima da segunda junta. Agora coloque uma estrutura metálica de 4 parafusos em cima da célula de substrato duplo montada Aperte o parafuso à mesma força de fixação usando uma chave de fenda de torque.Conecte a entrada e a tubulação de saída ao sintetizador de DNA. Prime a linha de lavagem de acetonitrila e verifique o fluxo adequado de acetonitrilo através dos substratos. Meça o volume de acetonitrila na linha de resíduos depois de passar por sete ciclos de escoramento de acetonitrilo.Este volume deve ser de dois mililitros. Conecte a célula de síntese no plano focal da luz UV de entrada. No caso da preparação da biblioteca, conecte uma linha extra de entrada e saída na parte de trás da célula e encha a câmara traseira com os dois mililitros da solução betacarotena.Inicie a síntese clicando pela primeira vez em Executar no software WiCell. No primeiro comando de espera no arquivo de trabalho, pressione o sintetizador de DNA. Após a síntese de microarrays regulares, desconecte a célula do sintetizador e desmonte a célula.Use uma caneta de diamante para gravar o número da síntese nas lâminas de vidro. Etch o número na face não sintetizada de cada slide. Transfira os slides para tubos de centrífugas de 50 mililitros e armazene em uma área dessecada até que seja mais utilizado.Após a síntese de microarrays da biblioteca, primeiro drene a solução betacarotena para fora da câmara e depois lave a câmara duas vezes, fluindo cinco mililitros de cloreto de metileno antes de drenar. Para desproteção de microardo de DNA, encha um frasco de vidro de coloração com 20 mililitros de etanol e 20 mililitros de EDA. Coloque as microarrays somente de DNA verticalmente no frasco, feche a tampa e deixe os slides para desprotegir por duas horas à temperatura ambiente.Depois de duas horas, recupere os slides usando pinças e enxágue-as completamente com água duplamente destilada. Seque as lâminas em uma centrífuga de microarray por alguns segundos antes de armazená-las em um desiccador. Para desproteção de microarray RNA, prepare uma solução seca de trietilamina de 20 mililitros e 30 mililitros de acetonitrilo em um tubo de centrífuga de 50 mililitros.Transfira um slide de microarraia de RNA para o tubo de centrífuga, feche a tampa e enrole com filme de vedação de plástico. Agite suavemente o tubo de centrífuga em um agitador orbital por uma hora e 30 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, remova o slide e lave duas vezes com 20 mililitros de acetonitrilo seco antes de secar em uma centrífuga de microarray por alguns segundos.Após a primeira etapa de desproteção, transfira o deslizamento de RNA para a solução de hidrazina, feche a tampa e enrole com filme de vedação de plástico. Depois de duas horas tremendo suavemente em um agitador orbital, remova o slide e lave-o duas vezes com 20 mililitros de acetonitrila seca. Em seguida, seque em uma centrífuga microarray por alguns segundos.Se a microarray RNA também contiver nucleotídeos de DNA, proceda com uma terceira etapa de desproteção. Adicione a microarraia dna/RNA a um tubo de 50 mililitros contendo uma solução de um a um EDA-etanol Após 5 minutos à temperatura ambiente, remova a lâmina e lave a microarray duas vezes com 20 mililitros de água estéril. Seque o escorregador em uma centrífuga de microarray e armazene em um desiccador.Em um tubo de microcentrifuso estéril de 1,5 mililitro, prepare o tampão de hibridização contendo DNA rotulado cy3, conforme descrito no protocolo de texto. Misture e vórtice a solução. Coloque cuidadosamente uma câmara de hibridização de 300 microliter autoadesivo sobre a área de síntese em cada slide e tubulação na solução de hibridização.Cubra os orifícios da câmara com pontos adesivos e enrole todo o slide em papel alumínio. Coloque o deslizamento de microarray no forno de hibridização, cubra e deixe girar suavemente na temperatura de hibridização selecionada por duas horas. Após duas horas, retire o slide, remova a folha de alumínio, pipeta a solução de hibridização e retire cuidadosamente a câmara de hibridização.Transfira os slides para um tubo de centrífuga contendo 30 mililitros de buffer de lavagem não rigoroso. Agite vigorosamente por dois minutos em temperatura ambiente. Transfira o slide para um tubo de centrífuga contendo 30 mililitros de Tampão de Lavagem Rigoroso e agite vigorosamente por um minuto.Finalmente, transfira o slide para um tubo de centrífuga contendo 30 mililitros de Buffer de Lavagem Final. Agite por alguns segundos. Seque o deslizamento em uma centrífuga de microarray.Agora, coloque a microarray seca, área de síntese voltada para baixo, no porta-slides do scanner de microarray. Para desprotegar e cortar bibliotecas de DNA, mergulhe o slide na solução de decote, em um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Feche o tubo e enrole com filme de vedação de plástico, antes de girar suavemente em um agitador orbital por duas horas em temperatura ambiente.Depois de duas horas, remova o escorregador e lave duas vezes com 20 mililitros de acetonitrilo escrupulosamente seco antes de deixá-lo secar o ar. Com uma pipeta, aplique 100 microliters de água estéril sobre a área de síntese agora perceptível. Enconha a solução algumas vezes antes de transferi-la para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.Repita o processo e misture a microarraia no mesmo tubo. Evaporar o chip eluar até o ressecamento e, em seguida, ressolver em 10 microlitres de H2O sem nuclease. Aqui estão os resultados de um ensaio de hibridização realizado em uma microarray contendo as versões de DNA e RNA de uma sequência de 25mer.O escaneamento aparece em um formato de escala verde correspondente à excitação, espectro de emissão de fluorescência Cy3, com intensidade de fluorescência registrada em unidades arbitrárias. Há variabilidade significativa nos valores absolutos de fluorescência entre os experimentos. Os resultados de três sínteses independentes usando os mesmos parâmetros de fabricação e o mesmo manuseio pós-sintético são mostrados.O DNA de 25mer, quando hibridizado à sua vertente de DNA com rótulo Cy3 complementar, produzirá sinais de fluorescência que variam de 20.000 a 30.000, muito raramente acima ou abaixo. O RNA de 25mer, quando hibridizado para o mesmo complemento de DNA rotulado cy3, dará intensidades de fluorescência nas características correspondentes que variam de 15.000 a 20.000. No entanto, a intensidade de fluorescência dos duplexes de RNA/DNA ocasionalmente cairá abaixo de 8.000, quando os duplexes correspondentes de DNA/DNA ainda fluorescem dentro da faixa de 20.000 a 30.000.Nesses casos, os resultados do RNA podem ser considerados como sub-ideais. Como em qualquer outro experimento baseado em RNA, é importante lembrar que as microarrays de RNA são sensíveis à degradação e devem ser tratadas em condições estéreis. Bibliotecas de ácido nucleico coletadas a partir de microarrays podem ser usadas em sequenciamento de DNA ou RNA, bem como na codificação de informações digitais no DNA.O NED produz uma luz UV intensa que não deve ser diretamente examinada. Por causa disso, é aconselhável usar óculos de proteção enquanto o instrumento estiver em uso.

high-density-dna-rna-microarrays-photolithographic-synthesis

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Grande Escala Telas de Bibliotecas metagenomic

Este vídeo é uma demonstração técnica do protocolo de hibridização para todo o genoma azulejos caminho disposição CGH, que escaneia todo o genoma humano usando apenas 25-100 ng de DNA que podem ser isoladas a partir de uma variedade de fontes, incluindo o material de arquivo formol fixa.

Demonstração de técnicas Whole Genome hibridização genômica comparativa de matriz

Devido à natureza transitória do pré-mRNA, pode ser difícil isolar e...

Um método rápido de alta capacidade para Ribonucleoproteínas Mapping (RNPs) no pré-mRNA Humanos

O método de Hi-C permite a identificação imparciais, de todo o genoma de interações cromatina (1). Oi-C casais ligadura proximidade e seqüenciamento massivamente paralelo. Os dados resultantes podem ser usados ​​para estudar a arquitetura genômica em múltiplas escalas: resultados iniciais identificadas características como territórios cromossomo, a segregação da cromatina abertas e fechadas, e estrutura da cromatina na escala megabase.

Oi-C: um método para estudar a arquitetura tridimensional de Genomas.

Nós demonstramos o uso de microarrays de DNA para perfis de expressão do sistema nervoso. Descrevemos RNA controle de qualidade, rotulagem da amostra, e hibridização da matriz e de digitalização.

Microarrays de DNA: Controle de Qualidade da amostra, Hibridação Array e Digitalização

Este artigo vídeo descreve um método de microarray baseado in vitro para determinar os genes alvos e sítios de ligação para dois reguladores de resposta do sistema de componentes.

DNA-afinidade-purificada Método Chip (DAP-chip) para determinar genes alvos para bacteriana Dois Sistemas Regulatórios componentes

Gel-seq permite aos investigadores simultaneamente preparar bibliotecas para ambos DNA - e RNA-seq insignificante custo adicionado a partir de 100-1000 células usando um dispositivo simples de hidrogel. Este trabalho apresenta uma abordagem detalhada para a fabricação do dispositivo, bem como o protocolo biológico para gerar bibliotecas emparelhadas.

Gel-seq: Um método para a preparação de biblioteca simultânea de sequenciamento de DNA e RNA usando matrizes de hidrogel

Um protocolo detalhado para a geração de Microarrays humanos Self-assembled da proteína para a seleção de inibidores da quinase é apresentado.

Triagem de inibidores da quinase em Microarrays de proteínas humanas Automontados

Aqui, apresentamos um protocolo para capturar as interações DNA-DNA de cromatina associadas ao RNA para mapear a organização do genoma tridimensional relacionada ao RNA.

Método de Interação DNA-DNA de Cromatina Associada a RNA

Aqui, detalhamos o método de equação de S de sorgo de P soralen reticulado, L igado e Híbridos H elegidos (SPLASH), que permite o mapeamento genômico de interações intramoleculares e intermoleculares RNA-RNA in vivo . SPLASH pode ser aplicado para estudar os interactomas de RNA de organismos, incluindo leveduras, bactérias e seres humanos.

Mapeando as Interações RNA-ARN Globalmente Usando Psoraleno Biotinilado

Aprenda a sintese fotolitográfica de microarrays de DNA e RNA para estudos de interações entre ácidos nucleicos e proteínas. Este método permite criar bibliotecas de sequências com alta diversidade.

Microarrays de DNA e RNA de alta densidade-síntese fotolitográfica, hibridação e preparação de grandes bibliotecas de ácidos nucleicos (Vídeo) | JoVE Journal

Microarrays de DNA e RNA de alta densidade-síntese fotolitográfica, hibridação e preparação de grandes bibliotecas de ácidos nucleicos

Explorar mais vídeos