Name: Geração de uma plataforma de xenoenxerto de melanoma uveal humano ortotópico do fígado em camundongos imunodeficientes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 2 s
Description: Aprenda a criar modelos ortotópicos de xenoenxerto de melanoma uveal humano no fígado de camundongos imunodeficientes usando implante cirúrgico e injeção de células cultivadas. Este método permite avaliar com precisão o comportamento tumoral e a eficácia de drogas.

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Somos gratos a M. Ohara, K. Saito e M. Terai, por revisaro manuscrito. Os autores reconhecem a revisão crítica para o auxílio editorial e inglês deste manuscrito pelo Dr. R. Sato no centro do cancer da perseguição da raposa. O trabalho aqui descrito foi apoiado pelo Bonnie Kroll Research Fund, o Mark Weinzierl Research Fund, o Eye Melanoma Research Fund da Thomas Jefferson University, the Osaka Community Foundation e JSPS KAKENHI Grant Number JP 18K15596 em Osaka City Universidade. Estudos no laboratório do Dr. A. Aplin foram apoiados pela concessão do NIH R01 GM067893. Este projeto também foi financiado pelo Prêmio de Ciência Transformadora do Reitor, um Prêmio de Iniciativa Programática da Universidade Thomas Jefferson.

Os pacientes inscritos no estudo devem fornecer consentimento por escrito permitindo o uso de amostras cirúrgicas descartadas para fins de pesquisa e estudos genéticos, de acordo com um protocolo aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional. Este protocolo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais Laboratoriais dos Institutos Nacionais de Saúde e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC).
1. Coleção de tecido tumoral fresco derivado do paciente
<ol><li>Obtenha o tecido tumoral derivado do paciente a partir de uma cirurgia ou uma biópsia de agulha em uma sala de cirurgia do hospital.</li>
	<li>Coloque o tecido tumoral em um recipiente de 100 mL contendo a solução de sal equilibrado de Hanks (HBSS) no gelo.</li>
	<li>Transfira o tecido para um capô estéril (Nível 2 de Biossegurança) em laboratório.</li>
	<li>Vá para o segundo passo o mais rápido possível. Nota: Por razões de segurança, exclua pacientes com infecções conhecidas por HIV ou hepatite B ou C.</li>
</ol>2. Processamento de tecido tumoral fresco derivado do paciente
<ol><li>Coloque o tecido em um tubo de 50 mL contendo solha soline tampão de fosfato (PBS) no gelo. Para lavar o tecido, adicione PBS no tubo e descarte PBS do tubo duas vezes.</li>
	<li>Transfira o tecido em uma placa de Petri contendo PBS no gelo.</li>
	<li>Usando fórceps estéreis e tesouras, retire as partes necróticas do tecido. Mantenha o tecido úmido e frio durante os passos 2,3 a 2,5. Para amostras de biópsia de agulha, pule o passo 2.3 e 2.5, e não corte as amostras. Nota: O tecido necrótico muitas vezes se rompe facilmente quando tocado.</li>
	<li>Corte o tecido em 1 mm3 cubos para implantação hepática cirúrgica.</li>
	<li>Corte o resto do tecido em cubos de 2 mm na placa de Petri.</li>
	<li>Transfira-os para um microtubo de 1,7 mm com formalina de 4% para análise histológica e para outro tubo para análise genômica e proteômica.</li>
	<li>Coloque os microtubos em um frasco de nitrogênio líquido com nitrogênio líquido. Transfira os tubos para um congelador de -80°C para armazenamento permanente. Nota: O tempo entre a remoção da amostra do paciente e o processamento do tecido não deve exceder 30 min.</li>
</ol>3. Implantação hepática cirúrgica com tecido tumoral derivado do paciente
<ol><li>Spray todos os objetos que entram na capa para a cirurgia com 70% de álcool etílno. Nota: Isso inclui instrumentos cirúrgicos, almofadas de aquecimento e máquinas de anestesia.</li>
	<li>Medir o peso de um cotonete e folha de tecido.</li>
	<li>Anestesiar um rato com um vaporizador de isoflurano de 3 a 5%, colocando-o na câmara de indução.</li>
	<li>Uma vez que o rato é anestesiado inteiramente, coloc o na posição supine em uma almofada de aquecimento. Coloque o cone isoflurane no cnout do rato para inalar 1,5-3% isoflurane para manutenção de anestesia. Nota: O rato precisa de estar na almofada de aquecimento durante o procedimento inteiro. A falta de aquecimento pode causar hipotermia.</li>
	<li>Confirme a anestesia adequada por nenhuma reação quando o pé do rato é picado com fórceps ultrafinos.</li>
	<li>Injete buprenorfina (0,6 mg/kg) subcutâneamente no flanco usando uma agulha 27 G em uma micro seringa antes da cirurgia.</li>
	<li>Aplique 70% de álcool etílico no abdômen e espalhe a pele para cima e para baixo. Depois de espalhar a pele, confirme uma visualização mais fácil da pele abaixo da área subcostal esquerda para um corte mais fácil. Não raspe a pele do abdômen. Nota: A pele esconderá o local da incisão após a cirurgia e impedirá que o rato risque a operação do borne da incisão. No entanto, você pode raspar a pele para evitar a infecção do site de incisão de acordo com os padrões institucionais.</li>
	<li>Aplique o iodo e deixe-o ser absorvido na pele.</li>
	<li>Coloque uma cortina cirúrgica estéril com um buraco de 2 cm no mouse.</li>
	<li>Levante a pele abdominal com fórceps ultrafinos curvos e faça uma incisão subcostal esquerda transversal de 1 cm com tesoura curva.</li>
	<li>Insira a ponta da tesoura curva a pele da incisão e abra-as ligeiramente para separar o peritônio da pele. Retire a tesoura da incisão com lâminas fechadas. Nota: Abrir e fechar tesouradentro do rato pode causar danos e sangramento.</li>
	<li>Localizar o fígado o peritônio. Confirme uma cor avermelhada escura através do peritônio.</li>
	<li>Com tesoura curva, faça uma incisão transversal de 1 cm no peritônio. Se uma artéria peritoneal sangra da vanguarda, parar imediatamente o sangramento com cautery.</li>
	<li>Pegue o tecido adiposo usando fórceps ultrafinos curvos com uma mão, insira a borda de um cotonete o lobo do fígado esquerdo e enrole o cotonete para baixo com a outra mão para trazer o fígado. Nota: Agarrar o tecido gordo é importante manter o tecido gordo da colagem ao cotonete.</li>
	<li>Exteriorize o fígado no cotonete e coloque o fígado em uma folha de tecido absorvente não tecido. Nota: A folha da tela joga dois papéis essenciais em estabilizar o fígado e em absorver a hemorragia.</li>
	<li>Faça uma incisão de 5 mm de largura e profundidade usando uma lâmina de bisturi estéril nº 11 para formar um bolso no parenchyma enquanto pressiona suavemente o local da incisão com o cotonete.<ol>
<li>Insira a lâmina em paralelo com a superfície do fígado e corte horizontalmente.</li>
		<li>Pressione o local da incisão com o cotonete para parar qualquer hemorragia. Nota: Não mantenha a lâmina vertical, caso contrário, você vai romper o fígado e ferir grandes vasos no meio do fígado.</li>
	</ol></li>
	<li>Enrole o cotonete para cima para abrir o local da incisão e implante um cubo de 1 mm3 de tecido tumoral no bolso com fórceps ultrafinos curvos. Retraia os fórceps enquanto rola o cotonete em rotação reversa e pressionando para baixo. Nota: Pressionar para baixo no local da incisão com o cotonete ao retrair os fórceps ajuda a impedir o deslocamento do tumor dentro do bolso.</li>
	<li>Tire delicadamente o cotonete do local da incisão após a implantação. Avance para a etapa 3.19 o mais rápido possível.</li>
	<li>Coloque um hemostat absorvível no local da incisão.</li>
	<li>Confirme a hemostasis. Se o sangramento continuar, adicione mais hemostat no local da incisão.</li>
	<li>Descasque o fígado fora da folha de tecido com fórceps (de preferência sem corte) e coloque o fígado de volta na cavidade abdominal.</li>
	<li>Suture peritoneum com dupla ligadura usando 5-0 sutura absorvível.</li>
	<li>Sutura de pele com ligadura tripla usando 5-0 sutura absorvível. Nota: A ligadura tripla ajuda a impedir a dehiscência da incisão cirúrgica.</li>
	<li>Observe o mouse até ficar completamente acordado e colocá-lo de volta na gaiola.</li>
	<li>Medir o peso do cotonete e da folha de tecido com sangue para o volume de sangramento durante a cirurgia. Compare-os com seus pesos originais antes da cirurgia. Reduzir o sangramento durante a cirurgia para menos de 10% do volume de sangue circulante no mouse.</li>
</ol>4. Coleta e processamento de cultura do fígado humano metastático Uveal Melanoma Cell Line
<ol><li>Prepare as células cultivadas.</li>
	<li>Coletar células e calcular o número de células usando um contador de células.</li>
	<li>Prepare uma quantidade apropriada de suspensão celular para 10,0 x 106 células em um tubo de 15 mL.</li>
	<li>Gire o tubo a 300 x g por 5 min em uma centrífuga à temperatura ambiente.</li>
	<li>Retire o supernatant no tubo de 15 mL. Deixe a pelota celular na parte inferior do tubo.</li>
	<li>Adicione 50 μL de RPMI 1640 médio em um tubo de 1,7 mL.</li>
	<li>Corte a ponta de uma ponta de 200 μL com tesoura para ampliar a abertura da ponta.</li>
	<li>Adicione 60 μL da matriz da membrana do porão usando uma pipeta com a ponta de corte no tubo de 1.7 mL que tem RPMI.</li>
	<li>Misture RPMI e matriz no tubo de 1,7 mL. Vórtice-lo.</li>
	<li>Adicione 110 μL da mistura na pelota celular no tubo de 15 mL. Transfira a suspensão celular para um novo tubo de 1,7 mL.</li>
	<li>Mantenha o tubo no gelo antes da injeção da agulha.</li>
</ol>5. Implantação cirúrgica da agulha da linha de pilha metastática metastática cultivada da pilha de Uveal do fígado no fígado
<ol><li>Siga o protocolo acima das etapas 3.1 a 3.15.</li>
	<li>Recolher a suspensão celular com uma microseringa com uma agulha 27 G.</li>
	<li>Insira a agulha ao longo da superfície do fígado e avançar a ponta da agulha 5 mm mais profundo.</li>
	<li>Injetar 20 μL de suspensão celular no fígado.</li>
	<li>Cauterizar o ponto de inserção do fígado para evitar que as células injetadas vazem. Confirme a hemostasis.</li>
	<li>Siga o protocolo acima das etapas 3.21 a 3.24.</li>
</ol>6. Tomografia computadorizada
<ol><li>Coloque o rato em um contidor no estado acordado.</li>
	<li>Limpe a cauda com uma almofada de álcool estéril para desinfecção e vasodilatação.</li>
	<li>Injete 100 μL de agente de contraste tc na veia da cauda com uma agulha de 27 G em uma seringa de 1 mL.</li>
	<li>Aguarde 4 h após a injeção antes de fazer a tomografia computadorizada. Nota: Leva 4 h até que o agente é levado por células de fígado Kupffer.</li>
	<li>Quatro horas após a injeção, anestesiao o rato tumor-rolamento com isoflurane vaporizado de 3-5% coloc o na câmara da indução.</li>
	<li>Uma vez que o mouse é totalmente anestesiado, coloque-o na posição propensa em um CT. Coloque o cone isoflurane no mirante do mouse para inalar isoflurane de 1,5-3% para manutenção de anestesia.</li>
	<li>Confirme a anestesia adequada por nenhuma reação quando o pé do rato é picado com fórceps ultrafinos.</li>
	<li>Faça uma tomografia por 15 min.</li>
	<li>Certifique-se de que o mouse até que seja totalmente despertado após a tomografia computadorizada e colocá-lo de volta na gaiola.</li>
	<li>Avalie a existência do tumor e meça o tamanho do tumor nas imagens de TC. Nota: O agente de contraste melhora o parenchyma normal do fígado de modo que seja fácil reconhecer o tumor não realçado. Não interprete mal a vesícula biliar e o estômago como tumor.</li>
</ol>7. Tecido de colheita e processamento
<ol><li>Eutanásia ratos usando CO2 seguido de deslocamento cervical, colocando o dedo indicador e polegar atrás do crânio e puxando o corpo pela base da cauda. Avance para o passo 7.2 o mais rápido possível.</li>
	<li>Coloque o mouse em uma posição supina e pulverizar o abdômen com 70% de álcool etílno.</li>
	<li>Use fórceps estéreis e tesouras estéreis para fazer uma incisão transversal de 3 cm abaixo do processo xifórido para expor os órgãos abdominais.</li>
	<li>Extirpar o tecido tumoral e realizar etapas 2.1 a 2.2.</li>
	<li>Corte o resto do tumor em cubos de 2 mm na placa de Petri.</li>
	<li>Transfira-os para um tubo criogênico com criomémetro para reimplantação após criopreservação.</li>
	<li>Coloque os tubos em um recipiente de congelamento criogênico cheio de isopropanol.</li>
	<li>Transfira o recipiente para um congelador de -80°C para armazenamento temporário. Não coloque os criotubos com criomémetro diretamente em um tanque de nitrogênio líquido. Congelá-los lentamente a uma taxa de resfriamento de -1 °C/min para preservar o tecido tumoral.</li>
	<li>No dia seguinte, transfira os tubos para um tanque de nitrogênio líquido para armazenamento permanente.</li>
</ol>8. Reimplante
<ol><li>Mantenha os tubos congelados em um frasco líquido de nitrogênio com nitrogênio líquido até que esteja pronto para implantar tecido. Minimize a exposição do tecido à temperatura ambiente para manter a viabilidade e aumentar as chances de enxerto.</li>
	<li>Descongele tubo criopreservado em um banho de água de 37 °C.</li>
	<li>Executar etapas 2.2-2.4.</li>
	<li>Implante o tumor descongelado em camundongos, conforme descrito nos passos 3.1-3.24.</li>
</ol>

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<li>Boll, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-CT+based+experimental+liver+imaging+using+a+nanoparticulate+contrast+agent%3A+a+longitudinal+study+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Micro-CT based experimental liver imaging using a nanoparticulate contrast agent: a longitudinal study in mice.</a> PLoS One. 6 (9), e25692(2011).</li>
<li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+gene+expression+profiling+confirms+the+molecular+fidelity+of+primary+tumor-based+orthotopic+xenograft+mouse+models+of+medulloblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">Global gene expression profiling confirms the molecular fidelity of primary tumor-based orthotopic xenograft mouse models of medulloblastoma.</a> Neuro-Oncology. 14 (5), 574-583 (2012).</li>
<li>Rubio-Viqueira, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+platform+for+translational+drug+development+in+pancreatic+cancer.Clinical%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">An in vivo platform for translational drug development in pancreatic cancer.Clinical.</a> Cancer Research. 12 (15), 4652-4661 (2006).</li>
<li>Siolas, D., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+tumor+xenografts%3A+transforming+clinical+samples+into+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models.</a> Cancer Research. 73 (17), 5315-5319 (2013).</li>
<li>Alkema, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biobanking+of+patient+and+patient-derived+xenograft+ovarian+tumour+tissue%3A+efficient+preservation+with+low+and+high+fetal+calf+serum+based+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Biobanking of patient and patient-derived xenograft ovarian tumour tissue: efficient preservation with low and high fetal calf serum based methods.</a> Scientific Reports. 6 (5), 14495(2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Os modelos ortotópicos atuais do xenograft são labor-intensive, demorados, e caros criar. Modelos de camundongos xenoenxerto de tumor ortotópico para câncer de fígado foram estabelecidos há mais de duas décadas há19,20,21. No entanto, esta técnica é complicada e requer o uso de equipamentos especiais, como um suporte de microagulha e 6-0 a 8-0 suturas finas um microscópio. Tumor e tecido hepático normal devem ser costurados cuid...

O melanoma uveal é o tumor maligno intraocular mais comum entre adultos no mundo ocidental. Nos últimos 50 anos, a incidência de melanoma uveal (5,1 casos por milhão) manteve-se estável nos Estados Unidos1,2. O melanoma uveal surge de melanócitos na íris, corpo ciliário ou choroide, e é uma doença extremamente letal quando desenvolve metástase. A taxa de mortalidade de pacientes com metástase de melanoma uveal foi de 80% aos 1 ano e 92% aos 2 anos após o diagnóstico inicial das metástases. O tempo entre o diagnóstico de metástases e morte é tipicamente curto, menos de 6 meses, sem levar em conta a terapia3,4. O câncer se espalha através do sangue e tende a metástase dominante mente para o fígado (89-93%)4,5. Um modelo eficaz do rato é urgente necessário para uma investigação mais adicional da melanoma uveal fígado-metastática. Para a pesquisa translacional, há uma clara demanda para gerar um modelo de camundongo uveal metastático localizado no fígado.
Espera-se que os modelos de camundongos tumorais derivados do paciente forneçam estratégias de medicamentos individualizados. Estes modelos podem ser preditivos de desfechos clínicos, ser úteis para avaliação de medicamentos pré-clínicos e ser usados para estudos biológicos de tumores6. Os modelos representativos de PDX são camundongos xenoenxerto supada tumoralmente ectópica, que têm tumor em locais subcutâneos. A maioria dos pesquisadores pode fazer cirurgia para implantação subcutânea sem prática especial7,8. Eles também podem monitorar tumores subcutâneos facilmente. Embora os modelos PDX subcutâneos se tornaram populares na fase de pesquisa, eles têm alguns obstáculos na mudança para uso prático. Implantação subcutânea força tumores derivados do paciente a enxetorgravura em um microambiente diferente da origem tumoral, de modo que leva à falha do enxerto e ao crescimento lento do tumor 9,10,11, 12,13,14. O enxerto ortotópico pode ser uma abordagem mais ideal e racional para um modelo PDX porque usa o mesmo órgão que o tumor original15,16.
Recentemente, desenvolvemos protocolos para técnicas cirúrgicas de implantação ortotópica de tumores de melanoma uveal metastáticos do fígado derivados do paciente e técnicas de injeção de agulha com uma linha de células de melanoma uveal metastático do fígado humano cultivada no NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) ratos17,18. Os protocolos resultam em taxas de sucesso técnico consistentemente altas. Também estabelecemos técnicas de tomografia computadorizada que são úteis para detectar tumores hepáticos interiores, e desenvolvemos reimplantação de tumores criopreservados na plataforma PDX. Nós encontramos que os modelos uveal do xenograft do melanoma mantêm as características do tumor paciente original do fígado, incluindo suas características histopatológicas e moleculares. Juntas, essas técnicas fornecem uma plataforma melhor para modelos de tumorortópico hepático para melanoma uveal em pesquisatranscional.

<table><tbody><tr><td><forte>Materiais, tecidos e animais</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 tanque</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Criomedium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Exitron nano 12000 (agente de contraste de nanopartículas à base de metal alcalino-terroso)</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>130-095-700</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 1x, com cálcio e magnésio</td><td>Corning</td><td>21-020-CM</td><td></td></tr><tr>Linha <td></td><td></td><td></td><td>celular de melanoma uveal metastático de fígado</td></tr><tr><td>humano Tecido de melanoma uveal humano no fígado</td><td></td><td></td><td>Todo o manuseio de tecidos deve ser feito em um capuz de nível 2 de biossegurança. Tenha cuidado ao trabalhar com tecido humano; Sempre use luvas e evite o contato direto com a pele. Suponha que os pacientes possam ter sido infectados com HIV ou outros organismos altamente transmissíveis. Não processe amostras conhecidas por serem portadoras de infecções.</td></tr><tr><td>Produtos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>67618-150-17</td><td></td>de<td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher científico</td><td>A416-1</td> do <td>isoflurano Purdue do iodo Evite o contato direto à pele e aos olhos e a inalação do agente anestésico.</td></tr><tr><td>Nitrogênio</td><td></td><td></td><td></td>líquido</tr><tr><td>Matrigel HC</td><td>BD 354248</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) camundongos</td><td>Jackson Lab</td><td>5557</td><td>4 a 8 semanas de idade</td></tr><tr><td>PBS 1x, sem cálcio e magnésio</td><td>Corning</td><td>21-031-CM</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Almofada de preparação de álcool estéril (álcool isopropílico 70%)</td> <td>Produtos Nice-Pak</td><td>B603</td><td></td></tr><tr><td>Solução tampão de fosfato de paraformaldeído a 4%</td><td>Wako</td><td>163-20145</td><td></td></tr><tr><td>Solução de álcool etílico a 70%</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-122</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</strong</td></tr><tr><td>>Equipamentos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemostático absorvível</td><td>Johnson and Johnson</td><td>63713-0019-61</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medida</td><td></td><td></td><td></td>do peso corporal</tr><tr><td>Cautery</td><td>Bovie Medical</td><td>MC-23009</td><td></td></tr><tr><td>Contador de células</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuzer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cotonete</td><td></td><td></td> de algodão<td></td></tr><tr><td>Recipiente de congelamento criogênico</td><td>NALGENE</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>Cryotube</td><td>SARSTEDT</td><td>72.379</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura curva</td><td>World Precision Instruments</td><td>503247</td><td></td></tr><tr><td>Pinça ultrafina curva</td><td>World Precision Instruments</td><td>501302</td><td></td></tr><tr><td>Freezer</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>de folha de tecido</td></tr><tr><td>Filtro F / AIR Canister</td><td>Harvard Apparatus</td><td>600979</td><td></td></tr><tr><td>Almofada</td><td></td><td></td><td></td>de aquecimento</tr><tr><td>Vaporizador de isoflurano</td><td>Artisan Scientific</td><td>66317-1</td><td></td></tr><tr><td>Nitrogênio</td><td></td><td></td><td></td>líquido</tr><tr><td>Frasco de nitrogênio líquido</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2123</td><td></td></tr><tr><td>Micro-CT scan</td><td>Siemens</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Porta-agulhas</td><td>World Precision Instruments</td><td>501246</td><td></td></tr><tr><td>placas de Petri</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Frasco</td><td></td><td></td><td></td>de spray</tr><tr><td>Capuz</td><td></td><td></td> estéril <td>Armário de nível 2 de biossegurança</td></tr><tr><td>Bisturi estéril nº 11</td><td>AD Surgical</td><td>A300-11-0</td><td></td></tr><tr><td>Pinça reta</td><td>World Precision Instruments</td><td>14226</td><td></td></tr><tr><td>Campo</td><td></td><td></td><td></td>cirúrgico</tr><tr><td>Limitador de veias da cauda</td><td>Braintree Scientific</td><td>TV-150-STD</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 1 mL TB com agulha de 27 G</td><td>BD</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>tubo de 1,7 mL</td><td>Bioexpress</td><td>C-3260-1</td><td></td></tr><tr><td>5-0 PDO Sutura</td><td>AD Surgical</td><td>S-D518R13</td><td></td></tr><tr><td>tubos cônicos de 15 mL</td><td>AZER SCIENTIFIC</td><td>ES-9152N</td><td></td></tr><tr><td>agulha de 27 G</td><td>BD</td><td>780301</td><td></td></tr><tr><td>agulha de 27 G</td><td>Hamilton</td><td>7803-01</td><td></td></tr><tr><td>tubos cônicos de 50 mL</td><td>AZER SCIENTIFIC</td><td>ES-9502N</td><td></td></tr><tr><td>50 &micro; L micro seringa</td><td>BD</td><td>80630</td><td></td></tr><tr><td>50 &micro; L micro seringa</td><td>Hamilton</td><td>7655-01</td><td></td></tr><tr><td>recipiente de 100 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>12594997</td><td></td></tr><tr><td>200&mu; Ponta</td><td></td><td></td><td></td> em L</tr></tbody></table>

geração de uma plataforma de xenoenxerto de melanoma uveal humano ortotópico do fígado em camundongos imunodeficientes

Generation of a Liver Orthotopic Human Uveal Melanoma Xenograft Platform in Immunodeficient Mice

Nas últimas décadas, tumores xenoenxertos subcutâneos implantados no paciente ou linhas de células humanas cultivadas têm sido cada vez mais reconhecidos como modelos mais representativos para estudar cânceres humanos em camundongos imunodeficientes do que a célula humana estabelecida tradicional linhas in vitro. Recentemente, modelos de xenoenxerto tumoral derivados do paciente (PDX) ortotópicos implantados em camundongos foram desenvolvidos para melhor replicar características dos tumores de pacientes. Espera-se que um modelo de camundongo xenoenxerto ortotópico do fígado seja uma plataforma útil de pesquisa sobre o câncer, fornecendo insights sobre biologia tumoral e terapia medicamentosa. No entanto, a implantação do tumor ortotópico do fígado é geralmente complicada. Aqui descrevemos nossos protocolos para a implantação ortotópica de tumores uveal uveal metastáticos derivados do fígado. Nós cultamos linhas de células de melanoma uveal metastático do fígado humano em camundongos imunodeficientes. Os protocolos podem resultar em taxas de sucesso técnico consistentemente altas usando uma técnica de implantação ortotópica cirúrgica com pedaços de tumor de melanoma uveal derivado do paciente ou uma técnica de injeção de agulha com linha de células humanas cultivadas. Também descrevemos protocolos de tomografia computadorizada para detectar tumores hepáticos interiores e para técnicas de reimplantação usando tumores criopreservados para alcançar o reenxerto. Juntos, esses protocolos fornecem uma plataforma melhor para modelos de camundongos tumorais ortotópicos do fígado de melanoma uveal metastático do fígado em pesquisa translacional.

A implantação ortotópica cirúrgica usando o método do bolso do fígado pode transplantar o tumor uveal metastático da melanoma do fígado humano no fígado do rato com uma taxa de sucesso elevada de 80% dentro de seis meses. O tumor xenoenxerto enenxertos no fígado como um tumor solitário sem nódulos filha (Figura 1 e Figura 3A). A técnica cirúrgica de injeção ortotópica no fígado usando microagulhas enenxertou com sucesso células d...

Modelos ortotópicos de camundongos de melanoma uveal uveal uveal do fígado foram criados usando técnicas cirúrgicas de implantação ortotópica com esquema tumoral derivado do paciente e técnicas de injeção de agulha com linhas de células de melanoma uveal humana cultivadas.

Geração de uma plataforma de xenoenxerto de melanoma uveal humano ortotópico do fígado em camundongos imunodeficientes

In recent decades, subcutaneously implanted patient-derived xenograft tumors or cultured human cell lines have been increasingly recognized as more ...

A maioria dos modelos animais tumorais derivados do paciente são subcutâneamente implantados, impedindo a avaliação de características importantes dos tumores e da eficácia da droga. Abrigar os tumores implantados dentro do fígado facilitou essa análise sem o risco de desvios demais ocorrendo dentro do fígado. Antes de iniciar o procedimento, pulverize todos os materiais e instrumentos com 70% de álcool etílico.Confirme a falta de resposta ao beliscão do dedo do dedo do bicho anestesiado. Coloque o mouse na posição supina em uma almofada de aquecimento, e molhe a pele com álcool adicional de 70%. Espalhe a pele para visualizar a pele abaixo da área subcostal esquerda.Remova o cabelo e aplique iodo para ser absorvido na pele. Coloque uma cortina cirúrgica estéril com um buraco de dois centímetros sobre o mouse, e use fórceps ultra finos curvos para levantar a pele abdominal. Faça uma incisão subcostal esquerda transversal de um centímetro na pele e insira pontas de tesoura curvas na incisão para separar o peritônio da pele.Retraia a tesoura sem abrir as lâminas, e localize o fígado sob o peritônio por sua cor avermelhada escura. Use a tesoura curva para fazer uma incisão transversal

generation-liver-orthotopic-human-uveal-melanoma-xenograft-platform

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Um método é descrito para propagar tumores retinoblastoma humano em camundongos. Células tumorais são diretamente injetadas nos olhos de ratos imune deficiente. Tumores secundários foram estabelecidas com sucesso usando as duas células diretamente colhidas a partir de tumores humanos e tumorspheres cultivadas.

Estabelecimento e propagação de Tumores Humanos em Retinoblastoma Imune camundongos deficientes

A geração e caracterização de células T específicas de tumor utilizando ratinhos humanizados é descrita aqui. Tecido do timo humano e geneticamente modificadas de células-tronco hematopoiéticas são transplantadas em ratos imunocomprometidos. Isto resulta na reconstituição de um sistema imune humano permitindo engenharia para exame in vivo de anticorpos anti-tumorais respostas imunes.

Utilizando o rato como um BLT humanizado baseado Stem Modelo Gene Therapy célula tumoral

Neste vídeo, células de melanoma derivadas de humanos são implantadas por via subcutânea na região do flanco de um camundongo imunocomprometido. O modelo PDX permite a investigação pré-clínica de células de melanoma que melhor recapitulam a heterogeneidade tumoral e a agressividade do melanoma observadas em condições in vivo.

Modelagem de Xenoenxerto Derivado de Paciente: Uma Técnica para Gerar Modelos de Camundongos de Melanoma

Este vídeo demonstra um ensaio para gerar um modelo de camundongo xenoenxerto humanizado. Um camundongo imunocomprometido é injetado com ciclofosfamida para causar depleção de células imunológicas. Células tumorais derivadas de pacientes misturadas com células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs) em um hidrogel são injetadas por via subcutânea no camundongo, formando um tumor com células T infiltrantes.

Uma técnica para gerar um modelo humano de camundongo xenoenxerto humanizado enxertado com PBMC

Tumores humanos transplantados em ratos imunodeficientes são ferramentas valiosas para o estudo da biologia do câncer. Protocolos específicos para gerar xenoenxertos subcutâneos e intra-hepáticos a partir de células de carcinoma hepatocelular humano ou fragmentos do tumor são descritos. A regeneração hepática induzida por hepatectomia parcial em ratos destinatário é apresentado como uma estratégia para facilitar o enxerto intra-hepática.

Geração de subcutânea e intra-hepática Humanos carcinoma hepatocelular Xenoenxertos em Immunodeficient Ratos

Aqui, apresentamos um novo modelo de fígado de camundongo humanizado gerado em camundongos knockout celular mediado por receptor de toxina Alb (TRECK)/SCID após o transplante de células-tronco hepáticas humanas imaturas e expansíveis.

Geração de um humanizado rato Liver Usando células-tronco hepáticas humanas

Este protocolo fornece um método confiável para estabelecer camundongos humanizados com o sistema imunológico humano e células hepáticas. Os ratos imunodeficientes reconstituídos duplos conseguidos através da injeção pseudoaneurysms de hepatócitos humanos e de pilhas de haste hematopoietic de CD34+ são suscetíveis à infecção do vírus-1 da imunodeficiência humana e recapitulam dano de fígado como observado em Doentes infectados pelo VIH.

Estabelecimento do modelo humanizado duplo do rato de TK-NOG para a patogénese HIV-associada do fígado

O presente protocolo descreve o implante e a avaliação do melanoma em coroide murina utilizando tomografia de coerência óptica.

Implantação e Avaliação do Melanoma na Coroide Murina via Tomografia de Coerência Óptica

Organoides gerados a partir de tumores de pacientes são injetados ortotopicamente no fígado de camundongos. A ressecção do tecido hepático não tumoral leva a um ambiente regenerativo no tecido hepático onde o tumor está localizado.

Um modelo de xenoenxerto organoide derivado de paciente com câncer hepatocelular para investigar o impacto da regeneração hepática no crescimento do tumor

Linfoma de células do manto (MCL) é um difícil de tratar a doença associada a células B e é igualmente difícil estabelecer um modelo de rato de enxerto heterólogo do MCL primário para estudar e desenvolver a terapêutica. Aqui, descrevemos a criação bem sucedida de xenografts MCL em camundongos para ajudar a compreender a sua biologia subjacente.

Enxertia de tumor em um modelo do rato de enxerto heterólogo de linfoma de células do manto humano

Aprenda a criar modelos ortotópicos de xenoenxerto de melanoma uveal humano no fígado de camundongos imunodeficientes usando implante cirúrgico e injeção de células cultivadas. Este método permite avaliar com precisão o comportamento tumoral e a eficácia de drogas.

Geração de uma plataforma de xenoenxerto de melanoma uveal humano ortotópico do fígado em camundongos imunodeficientes

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