Fabricação de células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) para imunoterapia adotiva

De-lib-er-ating um produto CAR T Cell com competência funcional que engrafe, prolifera e tem atividade cit-el-úrica após a infusão é um componente-chave de uma imunoterapia adotiva eficaz. Por exemplo, em tumores sólidos, as células CAR T podem penetrar tumores sólidos e recebem estimulação ideal de antígeno;no entanto, seu enxerto geral e proliferação é impedido nas pessoas. O principal benefício dessa abordagem é que ela pode manter a qualidade das células CAR T ou o estado de diferenciação das células CAR T sem gerar células T terminais diferenciadas ou esgotadas, o que teria diminuído a capacidade proliferativa ou a má função efetiva após a infusão.

Essa técnica pode ser difícil porque as células T são muito sensíveis à concentração celular ou à superfície dos vasos em que sua cultura se forma. Assim como suas necessidades metabólicas. Essencialmente, as células T precisam ser mantidas felizes durante todo o processo, caso contrário elas não crescerão.

Para começar este procedimento, estabeleça pratos de cultura de 6 poços. Ative células T humanas primárias frescas ou crio-preservadas misturando-as com contas magnéticas anti-CD3 CD28, a uma proporção de três contas por célula T nos poços dos pratos da cultura. Cultura as células T em X-Vivo 15 médio suplementado com soro AB humano normal, L-glutamina, ele-xixi e IL2.

Ative as células T a uma concentração de um milhão de células T por mililitro durante a expansão. E cultuá-los a 37 graus Celsius com 20% de oxigênio, 5% de dióxido de carbono e 95% de umidade. Após a estimulação durante a noite, os supernacantes lentivirais às células T ativadas.

Calcule o volume de supernacantes necessários para alcançar uma multiplicidade de infecção entre três e cinco. Continue a cultura das células usando as mesmas condições. No terceiro dia, recolham uma alíquota representativa das células de criopreservação.

Antes da criopreservação, remova as contas magnéticas por tubulação suave e separação magnética. Prepare o meio de congelamento, que contém PBS com 0,5%DMSO. E armazená-lo a quatro graus Celsius até estar pronto para usar.

Em seguida, centrifugar as células T a 300 vezes G por cinco minutos. Descarte o supernatante e adicione cinco mililitros de PBS. Centrifugar as células novamente a 300 vezes G por cinco minutos e descartar o PBS.

Suspendemos o pellant em um mililitro de meio criopreservador frio. Congele as células T em um recipiente de congelamento refrigerado. E armazene a menos 80 graus Celsius por 48 horas.

Depois disso, transfira as células congeladas para nitrogênio líquido. Lave o resto das células T uma vez em cinco mililitros de PBS para eliminar qualquer vetor residual. Centrifugar a 300 vezes G por cinco minutos.

Em seguida, decante o PBS e suspenda novamente o pellant celular em meio de cultura celular T a uma concentração de 500.000 células por mililitro. Divida as células T em duas culturas projetadas 45 e 9. Conte as células T por citometria de fluxo usando contas de contagem e anticorpos monoclonais para CD4 humano e CD8.

Bem como um corante de viabilidade. Realirem as culturas dia sim, dia não para mantê-las em uma concentração de 500.000 células por mililitro. No quinto dia, conte e crio-preserve o dia cinco culturas como descrito anteriormente.

No sétimo dia, lave 500 mil células na PBS. E suspendê-los em 100 microliters de fluorescência ativado tampão de classificação celular. Em seguida, detecte a expressão da proteína da superfície do CAR por imuno-coloração com um anti-CAR 19 conjugado fluorescente por citometria de fluxo.

No nono dia, conte e crio-preserve o dia nove culturas como descrito anteriormente. Neste estudo são medidas a função e a eficácia das células CAR T que são colhidas em intervalos variados ao longo da cultura X-Vivo. Usando os métodos descritos neste vídeo, as células T são estimuladas e expandidas por três ou nove dias.

O perfil de diferenciação das células, conforme indicado pela estratégia de gating aqui mostrada, é analisado medindo a abundância de glicoproteínas distintas expressas na superfície celular. Uma mudança progressiva para a diferenciação de efeitos é vista ao longo do tempo durante a cultura X-Vivo. A função efetivadora e a capacidade proliferativa das células CAR T em resposta ao antígeno são então avaliadas.

As células que são expandidas menos são funcionalmente superiores às extensivamente cultivadas ao longo de uma duração mais longa. Em um modelo de rato xenógrafo humano de ALL a potência das células CAR T colhidas em diferentes períodos de tempo é comparada. As células de nove dias mostram uma resposta anti-mormica dependente de dose com uma resposta completa no valor de uma alta dose de três milhões; e uma perda de eficácia para a baixa dose de 500.000.

No entanto, no dia três células apresentaram controle persistente do tumor em doses altas e baixas. Esta resposta está associada à contagem absoluta de CAR-T 19 no sangue periférico de camundongos. No geral, esses resultados fornecem evidências de que as células CAR T colhidas anteriormente, superam as colhidas posteriormente.

Após este procedimento, ensaios adicionais de função, como ensaio de cavalos-marinhos, podem ser realizados para medir suas propriedades metabólicas, como consumo de oxigênio ou capacidade de espia-lo. Várias rodadas de re-estimulação também podem ser realizadas para fornecer insights sobre sua diferenciação e persistência das células CAR T. Usando esse trabalho como base, nós e outros pesquisadores estamos envolvidos em estudos para abreviar ainda mais o processo cultural.

Também pode ser estendido em abordagens centrais para outros antígenos de câncer. Cuidados sempre devem ser tomados quando você trabalha com lentivírus. Mas mesmo quando o lentivírus é projetado para ser replicado incompetente.