Name: Fabricação de células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) para imunoterapia adotiva (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Aprenda a fabricar células T CAR com competência funcional preservada para imunoterapia adotiva. Este método mantém a qualidade celular durante a cultura, evitando diferenciação terminal e exaustão.

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Este trabalho foi apoiado em parte através do financiamento fornecido pela Novartis Pharmaceuticals através de uma aliança de pesquisa com a Universidade da Pensilvânia (Michael C. Milone), bem como st. Baldrick's Foundation Scholar Award (Saba Ghassemi).

Todos os estudos em animais são aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee da Universidade da Pensilvânia.
1. Ativação de células T, transdução e expansão
<ol><li>Ativar células T humanas primárias frescas ou criopreservadas misturando-se com contas magnéticas anti CD3/CD28 (por exemplo, dynabeads) a uma proporção de 3 contas por célula T em pratos de cultura celular de 6 poços. Células T culturais no X-VIVO 15 médias complementadas com 5% de soro ab humano normal, 2 mM L-glutamina, 20 mM HEPES e IL2 (100 unidades/mL). Mantenha as células T em uma concentração de 106 células T/mL durante a expansão. Células T cultura a 37 °C, 20% O2,e 95% de umidade com 5% de CO2.</li>
	<li>Após a estimulação durante a noite, adicione o supernatant lentiviral às pilhas de T ativadas. Calcule o volume de supernatant necessário para conseguir um multiplicity da infecção (MOI) de 3-5. Nota: O plasmid do lentivirus do CAR cd19-BBérc consiste em uma dobradinha CD8, em domínio costimulatory de 4-1BB, e no domínio de sinalização21do CD3º. O supernatant lentiviral cd19-BBfoi gerado como descrito anteriormente21.</li>
	<li>No dia 3, recolher um alibado representativo de células para criopreservação. Antes da criopreservação, retire as contas magnéticas por pipetting suave e separação magnética. Prepare o meio de congelamento contendo soro soro para o soro vermelho-fosfato (PBS) com sulfoxida de dimetil de 0,5% (DMSO) e guarde em 4 °C até o uso.<ol>
<li>Células T centrífugas a 300 x g por 5 min. Descarte o supernatant e adicione 5 mL de PBS. Células centrífugas a 300 x g por 5 min e descartam o PBS.</li>
		<li>Resuspenda a pelota da pilha em 1 mL do meio frio da criopreservação. Congele as células T em um recipiente gelado e guarde a -80 °C por 48 h. Transfira as células congeladas para nitrogênio líquido.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lave o resto das células T uma vez em 5 mL de PBS para eliminar vetor residual. Centrífuga a 300 x g por 5 min. Decant o PBS e resuspender a pelota celular no meio de cultura de células T em uma concentração de 0,5 x 106 células/mL.</li>
	<li>Divida as células T em duas culturas, designadas para o dia 5 e o dia 9. Contagem de células T por citometria de fluxo usando contas de contagem(Mesa de Materiais)e anticorpos monoclonais para CD4 e CD8 humanos, bem como um dinamismo de viabilidade(Tabela de Materiais).<ol>
<li>Para medir a concentração de células T, prepare uma mistura mestra contendo 500 μL de PBS, 5 μL de contas de contagem, 10 μL de 7-Amino-actinomicina solução de viabilidade celular D, 4 μL de CD4-FITC e 4 μL de CD8-APC. Adicione 40 μL de células T à mistura mestra e meça a concentração celular por citometria de fluxo com base no número de células T vivas/contagem de contas. Refeed para manter as culturas em uma concentração de 0.5 x 106 pilhas/mL cada outro dia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>No dia 5, conte e criopreserve culturas do dia 5, conforme descrito nos passos 1,3 e 1,5.</li>
	<li>No dia 7, lave 0,5 x 106 células T na PBS e resuspenda em 100 μL de tampão de triagem celular ativada por fluorescência (FACS). Detectar a expressão da proteína de superfície DO CAR imunostaining com um idiotipo anti-CAR19 fluorescente-conjugado pela citometria do fluxo.</li>
	<li>No dia 9, contar dia 9 culturas e criopreservação, como descrito no passo 1.3.</li>
</ol>2. Avaliação phenotípica da diferenciação de células T
<ol><li>Prepare uma mistura mestra contendo anticorpos pré-titados para anti-CD3-BV605 (clone OKT3), anti-CD14-Pacific Blue (PB) (clone HCD14), anti-CD19-PB (clone HIB19), anti-CD4-BV510 (clone OKT4), anti-CD8-H7APC (clone SK1), anti-CCR7-FITC (clone 150503), anti-CD45RO-PE (clone UCHL1), anti-CD27-PE-Cy7 (clone 1A4CD27), anti-CD95-PerCP-Cy5.5 (Clone DX2) e anti-CAR19-APC.</li>
	<li>Prepare os controles individuais de fluorescência menos um (FMO) para controles anti-CD45RO-PE, anti-CCR7-FITC, anti-CD27-PE-Cy7 e anti-CD95-PerCP-Cy5.5 para distinguir células positivamente manchadas de fundo.</li>
	<li>Prepare a solução de coloração de células mortas diluindo reagente de estoque vivo/morto(Tabela de Materiais)1:10.000 na PBS.</li>
	<li>Descongele as células T do dia 3, dia 5 e dia 9 que foram previamente criopreservadas. Centrífuga 1 x 106 células T de cada grupo a 300 x g por 3 min. Descarte o supernatant. Lave as células uma vez com PBS. Centrífuga a 300 x g por 3 min e descartar o PBS.</li>
	<li>Misture as células T com a solução de coloração morta para 15 min à temperatura ambiente (RT), protegido da luz.</li>
	<li>Adicione 1 mL de buffer FACS para saciar o tinudura de coloração de células mortas. Centrífuga a 300 x g por 3 min, descartar o supernatant e resuspender a pelota celular em 100 μL de tampão FACS contendo o coquetel de anticorpos descrito na etapa 2.1 e 2.2. Incubar por 1 h a 4 °C.</li>
	<li>Adicione 1 mL de buffer FACS e centrífuga a 300 x g por 3 min para lavar anticorpo sem limites. Repita três vezes com tampão FACS.</li>
	<li>Resuspenda as células em paraformaldeído de 1% (PFA) e armazena a 4°C.</li>
	<li>À medida que a expressão cd45ro diminui após a fixação, analise as amostras por citometria de fluxo após a imunocoloração. Para avaliar a diferenciação, portão na seguinte ordem: singlets (FSC-H vs FSC-A), células CD3+ T ao vivo (Dump [violeta morto-vivo, CD14-PB e CD19-PB vs CD3-BV605], CD4-BV510 vs CD8-APC-H7). Em CD4+ e Subconjuntos CD8+, portão no CD45RO-PE vs CCR7-FITC para definir células T ingênuas (CD45RO-CCR7+), Tcm (CD45RO+CCR7+), Tem (CD45RO+CCR7-) e Tte (CD45RO-CCR7-). Para identificar Tscm, portão em células CD27+ T na população de células T ingênuas. Neste compartimento, Tscm são CD95+ e Tn são CD95-.</li>
</ol>3. Análise funcional in vitro
<ol><li>Proliferação de células T car e secreção de citocina
	<ol>
<li>Verifique a expressão do CAR, bem como a viabilidade celular, conforme descrito nos passos 1,5 e 1,7, por citometria de fluxo.</li>
		<li>Lave 5 x 106 células T de cada grupo (dia 3, dia 5 e dia 9) com PBS e resuspenda em uma solução de 1 μM de carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) na PBS por 3,5 min na RT.</li>
		<li>Adicione imediatamente 10 mL de PBS que contêm o soro bovino fetal de 10% (FBS) para saciar a reação.</li>
		<li>Centrífuga a solução a 300 x g para 3 min. Descarte o supernatant e repita este passo de lavagem três vezes. Conte as células na conclusão da coloração CFSE usando um contador Coulter(Tabela de Materiais).</li>
		<li>As células manchadas de CFSE (não estimuladas), resuspendem em 1% pfa e armazenam a 4 °C para análise por citometria de fluxo.</li>
		<li>Incubar o número desejado de células T CAR manchadas de CFSE com k562-CD19 irradiado (alvo), bem como células tipo K562-selvagem (controle) em uma proporção de 1:1 para 120 h em condições de cultura livre de citocina média e cultura, conforme descrito na etapa 1.1.</li>
		<li>Após 24 h, centrífuga o vaso de cultura a 300 x g por 5 min. Coletar 120 μL de supernatant celular. Avalie a produção dependente da ativação de IL2, IFNγ, TNFα, GM-CSF e outras citocinas inflamatórias (IL1β, IL4, IL5, IL6, IL8 e IL10) por análises Luminex de acordo com as recomendações do fabricante.</li>
		<li>Substitua o volume de supernatant que foi coletado na etapa 3.1.7 com um volume equivalente (120 μL) do meio fresco.</li>
		<li>No dia 3 (ou seja, após 96 h), conte e re-alimente a uma concentração de 0,5 x 106 células/mL usando citometria de fluxo à base de contas como anteriormente na etapa 1.5.</li>
		<li>No dia 5, conte as células CD3+ vivas e calcule a mudança de dobra das células T vivas em relação à contagem de células T vivas no dia 0.</li>
		<li>Realize uma análise abrangente da diluição cfse na divisão de células T CAR usando o software FlowJo para destacar rodadas sucessivas de divisão celular. NOTA: Os ensaios de proliferação são bem descritos no manual flowjo.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensaio de citotoxicidade Nota: A capacidade das células CART19 de matar células-alvo expressando CD19 é avaliada usando um ensaio de liberação 51Cr.<ol>
<li>Rotular as células-alvo, misturando 5 x 105 K562-CD19, células de controle do tipo K562-selvagem, ou células de leucemia NALM6 com 50 μL de Na251CrO4 e 0,5 mL de RPMI complementada com 10% FBS por 90 min na incubadora em 37 °C.</li>
		<li>Células centrífugas a 300 x g por 2,5 min. Descarte o supernatant radioativo em caixas de descarte apropriadas e lave as células-alvo em 5 mL da PBS. Repita os passos de lavagem duas vezes.</li>
		<li>Resuspender as células-alvo em fenol vermelho-livre médio contendo 5% FBS. Use este meio para o resto do procedimento para reduzir o fundo.</li>
		<li>Depois de avaliar a expressão do CAR e a viabilidade celular por citometria de fluxo (conforme descrito na seção 5.1), misture as células T CAR com células-alvo rotuladas em proporções de 10:1, 3:1 e 1:1, em triplicado. Transfira para uma placa inferior U de 96 poços.</li>
		<li>Em paralelo, inclua células-alvo isoladamente e células-alvo com sulfato dodócia de sódio de 1% (SDS), para determinar a liberação espontânea (S) e máxima (M) 51Cr, respectivamente.</li>
		<li>Células centrífugas a 300 x g para 5 min e incubam por 4 h ou 20 h em uma incubadora de 37 °C com 5% de CO2.</li>
		<li>Após o tempo designado, centrífuga o vaso de cultura em 300 x g para 5 min. Coletar 35 μL de supernatant celular e transferir para uma placa de leitor. Evite bolhas. Deixe a placa secar durante a noite.</li>
		<li>Selar a placa com um selo de placa padrão e contar com um contador de cintilação líquida. A abundância de cromo no supernatant fornece um proxy da matança da pilha do alvo. Calcule a porcentagem de lyse específica da seguinte forma: 100 x (contagens por minuto [cpm] liberação experimental - cpm S release)/ (cpm M release - cpm S release).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Análise Funcional In Vivo
<ol><li>Obtenha camundongos de 6 a 10 semanas de idade nod-scidγ c-/- (NSG), que não possuem um sistema imunológico adaptativo, e os designe ao grupo de tratamento/controle aleatoriamente.</li>
	<li>Injete animais por via via veia da cauda com 1 x 106 células NALM6 em 0,1 mL estéril PBS.</li>
	<li>Após 5 a 7 dias, confirme o enxerto tumoral por imagem de bioluminescência (BLI). Injetar 150 mg/kg de D-luciferin para camundongos que foram anestesiados com isoflurano (volume depende da massa corporal).</li>
	<li>Medir os valores de bioluminescência usando um sistema de imagem. Quantificar o fluxo total usando o software correspondente, desenhando retângulos de área idêntica em torno de ratos, atingindo da cabeça a 50% do comprimento da cauda. Subtraia o fundo para cada imagem individualmente.</li>
	<li>Após o estabelecimento de leucemia, injetar 3 x 106 dia 9 cart19 células, 0,5 x 106 dia 3 células T CAR, ou correspondentes não-transduced (NTD) células T humanas via veia da cauda em um volume de 100 μL de Estéril PBS / Ca2 +. Nota: Como a bioatividade das células colhidas em vários intervalos durante o processo cultural é diferente, a concentração escolhida das células do dia 3 é menor do que o dia 9.</li>
	<li>Para determinar a progressão da doença, medir os valores de bioluminescência duas vezes por semana, conforme descrito acima na etapa 4.3.</li>
	<li>Para determinar o enxerto de células T car, coletar 75 μL sangue através de sangramento retro-orbital em um tubo revestido edta. Transfira 50 μL de sangue para tubos de contagem absoluta.</li>
	<li>Manchar o sangue com anticorpos contra CD45, CD4, CD8 e CAR por 30 min em RT. Adicionar 400 μL de 1x FACS solução de leitura para os tubos e vórtice completamente. Após a coloração, analise a expressão do marcador de superfície pela citometria do fluxo. Nota: Outros marcadores de superfície podem ser usados para avaliar o status de diferenciação e exaustão das células T no sangue.</li>
	<li>Para medir os níveis de citocinas no sangue, o sangue de centrífuga em 1.200 x g por 30 min a 4 °C para separar o soro da camada superior do sangue.</li>
	<li>Coletar soro e medir as citocinas com uma placa de leitor designado de acordo com as instruções do fabricante.</li>
</ol>

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<li>Cui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-7-Induced+Glycerol+Transport+and+TAG+Synthesis+Promotes+Memory+CD8+T+Cell+Longevity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">IL-7-Induced Glycerol Transport and TAG Synthesis Promotes Memory CD8 T Cell Longevity.</a> Cell. 161 (4), 750-761 (2015).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closely+related+T-memory+stem+cells+correlate+with+in+vivo+expansion+of+CAR.CD19-T+cells+and+are+preserved+by+IL-7+and+IL-15%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Closely related T-memory stem cells correlate with in vivo expansion of CAR.CD19-T cells and are preserved by IL-7 and IL-15.</a> Blood. 123 (24), 3750-3759 (2014).</li>
<li>Singh, N., Perazzelli, J., Grupp, S. A., Barrett, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+memory+phenotypes+drive+T+cell+proliferation+in+patients+with+pediatric+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Early memory phenotypes drive T cell proliferation in patients with pediatric malignancies.</a> Science Translational Medicine. 8 (320), 320ra323(2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Aqui descrevemos abordagens para medir a função e eficácia das células T CAR colhidas em intervalos variados ao longo da cultura ex vivo. Nossos métodos fornecem uma visão abrangente sobre ensaios projetados para avaliar a capacidade proliferativa, bem como a função efetiva in vitro. Descrevemos como medir a atividade das células T car após a estimulação através do CAR e detalhar os modelos de xenoenxerto de leucemia usando células T CAR colhidas no dia 3 vs dia 9 de sua fase de expansão logarítica.
<p class="jove_co...

Os receptores de antígenos quiméricos (CARs) fornecem uma abordagem promissora para redirecionar as células T contra antígenos tumorais distintos. Cars são receptores sintéticos que ligam um alvo de antígeno. Embora sua composição precisa seja variável, os CARs geralmente contêm 3 domínios distintos. O domínio extracelular direciona a ligação a um antígeno alvo e normalmente é composto por um único fragmento de anticorpo de cadeia ligado ao CAR através de uma dobradiça extracelular. O segundo domínio, comumente derivado da cadeia CD3 do complexo do receptor de células T (TCR), promove a ativação de células T após o engajamento da RCA. Um terceiro domínio costimulatory é incluído para realçar a função da pilha de T, engraftment, metabolismo, e persistência. O sucesso da terapia com células T CAR em várias neoplasias hematopoiéticas, incluindo leucemia linfoblástica aguda (LLA) de células B, leucemia linfocítica crônica (LlCa) e mieloma múltiplo destaca a promessa terapêutica desta abordagem1,2,3,4,5,6. As recentes aprovações da Food and Drug Administration (FDA) para duas terapias específicas de células T car específicas para CD19, tisagenlecleucel para TODOS pediátricos e adultos jovens e ciloleucel axicabtagene para linfoma difuso de grandes células B, reforça o mérito translacional da terapia de células T CAR.
As abordagens baseadas em CAR envolvem o isolamento das células T do sangue periférico, ativação, modificação genética e expansão ex vivo. A diferenciação é um parâmetro importante que regula a eficácia das células T do CAR. Assim, restringir a diferenciação de células T durante a cultura ex vivo aumenta a capacidade do produto infundido de enxertar, expandir e persistir, fornecendo imunovigilância de longo prazo após transferência adotiva2,7,8,9. As células T consistem em vários subconjuntos distintos, incluindo: células T ingênuas (Tn), memória central (Tcm), memória efeora (Tem), efecionista diferenciada (Tte) e memória de células-tronco (Tscm). As células T diferenciadas effector têm potente capacidade ctolítica; no entanto, eles são de curta duração e enxerto mal10,11,12. Em contraste, as células T com um fenótipo menos diferenciado, incluindo células T ingênuas e Tcm exibem enxerto superior e habilidades proliferativas após transferência de células adotivas13,14,15,16,17, 18. A composição das células T coletadas no produto pré-fabricado pode variar entre os pacientes e se correlaciona com o potencial terapêutico das células T CAR. A proporção de células T com um imunofenótipo ingênuo no produto de áherese inicial está altamente correlacionada com o enxerto e a resposta clínica19.
A duração da cultura é um parâmetro importante que influencia a diferenciação nas células T car preparadas para transferência adotiva. Recentemente desenvolvemos uma abordagem para gerar células T CAR de qualidade superior usando um paradigma de cultura abreviado20. Usando nossa abordagem, mostramos que a cultura limitada dá origem a células T CAR com função efetiva superior e persistência após transferência adotiva em modelos de xenoenxerto de leucemia. Aqui, apresentamos as abordagens para gerar de forma confiável as células CART19 (células T autólogas projetadas para expressar scFv anti-CD19 anexadas ao CD3 e os domínios de sinalização 4-1BB) e incluímos uma descrição detalhada dos ensaios que fornecem informações sobre a bioatividade e eficácia do CAR T antes da transferência adotada.

<table><tbody><tr><td>Anti dynabeads CD3/CD28</td><td>Thermo Fisher</td><td>40203D</td><td></td></tr><tr><td>APC Mouse Anti-Human CD8</td><td>BD Biosciences</td><td>555369</td><td>RRID:AB_398595</td></tr><tr><td>APC-H7 Mouse anti-Human CD8 Antibody BD</td><td>Biosciences</td><td>560179</td><td>RRID:AB_1645481</td></tr><tr><td>BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate</td><td>BD Biosciences</td><td>349202</td><td></td></tr><tr><td>BD Trucount Absolute Counting Tubes</td><td>BD Biosciences</td><td>340334</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 510 anti-human CD4 Antibody</td><td>BioLegend</td><td>317444</td><td>RRID:AB_2561866</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody BioLegend</td><td></td><td>317322</td><td>RRID:AB_2561911</td></tr><tr><td>CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit</td><td>Life Technolohgies</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>CountBright Absolute Counting Beads,Invitrogen</td><td></td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-humano CD197 (CCR7) Anticorpo</td><td>BD Pharmingen</td><td>561271</td><td>RRID: AB_10561679</td></tr><tr><td>FITC Mouse Anti-Human CD4</td><td>BD Biosciences</td><td>555346</td><td>RRID: AB_395751</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Soro AB humano</td><td>Valley Biomedical</td><td>HP1022</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-2 IS, grau premium</td><td>Miltenyi</td><td>130-097-744</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>28030-081</td><td></td></tr><tr><td>Contador de cintilação líquida, MicroBeta trilux</td><td>Sondas Moleculares Violetas Fixáveis Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD</td><td></td><td>L34964</td><td></td></tr><tr><td>Contador de relha Multisizer</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na251CrO4</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEZ030S001MC</td><td></td></tr><tr><td>Pacific Anticorpo anti-CD14 humano azul</td><td>BioLegend</td><td>325616</td><td>RRID: AB_830689</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CD19 humano azul do Pacífico</td><td>BioLegend</td><td>302223</td><td></td></tr><tr><td>PE anti-humano CD45RO Anticorpo</td><td>BD Biosciences</td><td>555493</td><td>RRID: AB_395884</td></tr><tr><td>PE / Cy5 anti-humano CD95 (Fas) Anticorpo</td><td>BioLegend</td><td>305610</td><td>RRID: AB_493652</td></tr><tr><td>PE / Cy7 anti-humano CD27</td><td>Anticorpo Beckman Coulter</td><td>A54823</td><td></td></tr><tr><td>Meio sem vermelho de fenol</td><td>Gibco</td><td>10373-017</td><td></td></tr><tr><td>Solução SDS UltraPure, 10%</td> <td>Invitrogen</td><td>15553027</td><td></td></tr><tr><td>Via-Probe</td><td>BD Biosciences</td><td>555815</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15</td><td>Gibco</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>XenoLight D-Luciferina - Sal K+</td><td>Perkin Elmer</td><td>122799</td><td></td></tr></tbody></table>

fabricação de células t do receptor de antígeno quimérico (car) para imunoterapia adotiva

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

A imunoterapia adotiva é promissora para o tratamento do câncer e das doenças infecciosas. Descrevemos uma abordagem simples para transduzir as células T humanas primárias com receptor de antígeno quimérico (CAR) e expandir sua progênie ex vivo. Incluímos ensaios para medir a expressão do CAR, bem como diferenciação, capacidade proliferativa e atividade citolítica. Descrevemos ensaios para medir a produção de citocina efetoee e secreção inflamatória de citocina em células T CAR. Nossa abordagem fornece um método confiável e abrangente para a cultura das células T CAR para modelos pré-clínicos de imunoterapia adotiva.

Usando os métodos descritos acima, estimulamos e expandimos as células T por 3 ou 9 dias(Figura 1A,B). Também analisamos seu perfil de diferenciação, como indicado pela estratégia de gating delineada na Figura1C,medindo a abundância de glicoproteínas distintas expressas na superfície celular. Mostramos uma mudança progressiva para a diferenciação efetíbula ao longo do tempo durante a cultura ex vivo (Figura ...

Descrevemos uma abordagem para gerar de forma confiável células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) e testar sua diferenciação e função in vitro e in vivo.

Fabricação de células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) para imunoterapia adotiva

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

De-lib-er-ating um produto CAR T Cell com competência funcional que engrafe, prolifera e tem atividade cit-el-úrica após a infusão é um componente-chave de uma imunoterapia adotiva eficaz. Por exemplo, em tumores sólidos, as células CAR T podem penetrar tumores sólidos e recebem estimulação ideal de antígeno;no entanto, seu enxerto geral e proliferação é impedido nas pessoas. O principal benefício dessa abordagem é que ela pode manter a qualidade das células CAR T ou o estado de diferenciação das células CAR T sem gerar células T terminais diferenciadas ou esgotadas, o que teria diminuído a capacidade proliferativa ou a má função efetiva após a infusão.Essa técnica pode ser difícil porque as células T são muito sensíveis à concentração celular ou à superfície dos vasos em que sua cultura se forma. Assim como suas necessidades metabólicas. Essencialmente, as células T precisam ser mantidas felizes durante todo o processo, caso contrário elas não crescerão.Para começar este procedimento, estabeleça pratos de cultura de 6 poços. Ative células T humanas primárias frescas ou crio-preservadas misturando-as com contas magnéticas anti-CD3 CD28, a uma proporção de três contas por célula T nos poços dos pratos da cultura. Cultura as células T em X-Vivo 15 médio suplementado com soro AB humano normal, L-glutamina, ele-xixi e IL2.Ative as células T a uma concentração de um milhão de células T por mililitro durante a expansão. E cultuá-los a 37 graus Celsius com 20% de oxigênio, 5% de dióxido de carbono e 95% de umidade. Após a estimulação durante a noite, os supernacantes lentivirais às células T ativadas.Calcule o volume de supernacantes necessários para alcançar uma multiplicidade de infecção entre três e cinco. Continue a cultura das células usando as mesmas condições. No terceiro dia, recolham uma alíquota representativa das células de criopreservação.Antes da criopreservação, remova as contas magnéticas por tubulação suave e separação magnética. Prepare o meio de congelamento, que contém PBS com 0,5%DMSO. E armazená-lo a quatro graus Celsius até estar pronto para usar.Em seguida, centrifugar as células T a 300 vezes G por cinco minutos. Descarte o supernatante e adicione cinco mililitros de PBS. Centrifugar as células novamente a 300 vezes G por cinco minutos e descartar o PBS.Suspendemos o pellant em um mililitro de meio criopreservador frio. Congele as células T em um recipiente de congelamento refrigerado. E armazene a menos 80 graus Celsius por 48 horas.Depois disso, transfira as células congeladas para nitrogênio líquido. Lave o resto das células T uma vez em cinco mililitros de PBS para eliminar qualquer vetor residual. Centrifugar a 300 vezes G por cinco minutos.Em seguida, decante o PBS e suspenda novamente o pellant celular em meio de cultura celular T a uma concentração de 500.000 células por mililitro. Divida as células T em duas culturas projetadas 45 e 9. Conte as células T por citometria de fluxo usando contas de contagem e anticorpos monoclonais para CD4 humano e CD8.Bem como um corante de viabilidade. Realirem as culturas dia sim, dia não para mantê-las em uma concentração de 500.000 células por mililitro. No quinto dia, conte e crio-preserve o dia cinco culturas como descrito anteriormente.No sétimo dia, lave 500 mil células na PBS. E suspendê-los em 100 microliters de fluorescência ativado tampão de classificação celular. Em seguida, detecte a expressão da proteína da superfície do CAR por imuno-coloração com um anti-CAR 19 conjugado fluorescente por citometria de fluxo.No nono dia, conte e crio-preserve o dia nove culturas como descrito anteriormente. Neste estudo são medidas a função e a eficácia das células CAR T que são colhidas em intervalos variados ao longo da cultura X-Vivo. Usando os métodos descritos neste vídeo, as células T são estimuladas e expandidas por três ou nove dias.O perfil de diferenciação das células, conforme indicado pela estratégia de gating aqui mostrada, é analisado medindo a abundância de glicoproteínas distintas expressas na superfície celular. Uma mudança progressiva para a diferenciação de efeitos é vista ao longo do tempo durante a cultura X-Vivo. A função efetivadora e a capacidade proliferativa das células CAR T em resposta ao antígeno são então avaliadas.As células que são expandidas menos são funcionalmente superiores às extensivamente cultivadas ao longo de uma duração mais longa. Em um modelo de rato xenógrafo humano de ALL a potência das células CAR T colhidas em diferentes períodos de tempo é comparada. As células de nove dias mostram uma resposta anti-mormica dependente de dose com uma resposta completa no valor de uma alta dose de três milhões; e uma perda de eficácia para a baixa dose de 500.000.No entanto, no dia três células apresentaram controle persistente do tumor em doses altas e baixas. Esta resposta está associada à contagem absoluta de CAR-T 19 no sangue periférico de camundongos. No geral, esses resultados fornecem evidências de que as células CAR T colhidas anteriormente, superam as colhidas posteriormente.Após este procedimento, ensaios adicionais de função, como ensaio de cavalos-marinhos, podem ser realizados para medir suas propriedades metabólicas, como consumo de oxigênio ou capacidade de espia-lo. Várias rodadas de re-estimulação também podem ser realizadas para fornecer insights sobre sua diferenciação e persistência das células CAR T. Usando esse trabalho como base, nós e outros pesquisadores estamos envolvidos em estudos para abreviar ainda mais o processo cultural.Também pode ser estendido em abordagens centrais para outros antígenos de câncer. Cuidados sempre devem ser tomados quando você trabalha com lentivírus. Mas mesmo quando o lentivírus é projetado para ser replicado incompetente.

manufacturing-chimeric-antigen-receptor-car-t-cells-for-adoptive

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Este vídeo demonstra uma técnica para fabricar células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) ex vivo. As células T humanas são incubadas com esferas magnéticas revestidas com anticorpos anti-CD3 e anti-CD28, juntamente com um meio suplementado com interleucina-2 (IL-2), levando à ativação e proliferação de células T. Vetores lentivirais transgênicos são introduzidos, permitindo que o RNA transgênico se integre ao genoma do hospedeiro e expresse o transgene. Isso resulta nas células T...

Uma técnica ex vivo para fabricar células T receptoras de antígeno quimérico

Este vídeo demonstra uma técnica para a geração ex vivo de células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) específico do antígeno tumoral. Vetores retrovirais portadores de RNA transgênico são misturados com células do baço em um meio suplementado com interleucina-2 para promover a sobrevivência e proliferação de células T. A mistura é então transferida para uma placa revestida com fragmentos de fibronectina humana recombinante e centrifugada para facilitar a fusão do vírus com a célula,...

Uma técnica ex vivo para gerar células T receptoras de antígeno quimérico específicas para tumores

Descrevemos um sistema quantitativo de ensaio de citolíse in vitro em tempo real para avaliar a potência das células T do receptor de antígeno quimérico que visam células tumorais líquidas e sólidas. Este protocolo pode ser estendido para avaliar outras células efetores imunes, bem como tratamentos combinados.

Um ensaio de potência em tempo real para células T do receptor de antígeno quimérico visando células cancerosas sólidas e hematológicas

Aqui, apresentamos um protocolo para edição de genes em células T humanas primárias usando a tecnologia CRISPR Cas para modificar células CAR-T.

Produção de células CAR-T projetadas por CRISPR humanas

Este artigo detalha o processo de fabricação de células T do receptor de antígeno quimérico para uso clínico, especificamente usando um processador de células automatizado capaz de realizar transdução viral e cultivo de células T. Fornecemos recomendações e descrevemos armadilhas que devem ser consideradas durante o processo de desenvolvimento e implementação de um ensaio clínico de fase inicial.

Fabricação de células T do receptor de antígeno quimérico em um processador de células automatizado

Esse protocolo agiliza a produção de vetores retrovirais e a transdução de células T murinas, facilitando a geração eficiente de células CAR-T em camundongos.

Geração Eficiente de Células T do Receptor de Antígeno Quimérico Murino (CAR)-T

Este protocolo fornece um fluxo de trabalho simplificado para gerar e testar células T reguladoras do receptor de antígeno quimérico humano (CAR Tregs).

Geração de células T reguladoras do receptor de antígeno quimérico humano

Este protocolo descreve um procedimento detalhado para gerar células T do receptor de antígeno quimérico transitório (CAR) usando mRNA não integrante para imunoterapia contra o câncer e fornece métodos confiáveis para avaliar as células CAR-T e sua função citotóxica.

Uma abordagem não viral para gerar células T receptoras de antígeno quimérico transitório usando mRNA para imunoterapia contra o câncer

Aqui, descrevemos um método para criar gotículas de emulsão dupla encapsulando uma célula T e uma célula-alvo cancerígena para examinar a morte celular no nível de uma única célula. Este método permite a quantificação dupla de moléculas citotóxicas e apoptose de células-alvo em uma grande população de células T.

Ensaio de citotoxicidade baseado em gotículas para avaliar células T receptoras de antígeno quimérico no nível de célula única

Este protocolo descreve as etapas essenciais para o cultivo das células T primárias, incluindo seu isolamento, ativação, expansão e transfecção transitória por eletroporação de mRNA. Além disso, é proposto um fluxo de trabalho e um painel de anticorpos para análise citométrica de fluxo do fenótipo, marcadores de ativação, viabilidade e expressão do receptor de antígeno quimérico (CAR).

Isolamento, cultivo e transfecção transitória de células T humanas primárias para gerar células T do Receptor de Antígeno Quimérico (CAR)

Aprenda a fabricar células T CAR com competência funcional preservada para imunoterapia adotiva. Este método mantém a qualidade celular durante a cultura, evitando diferenciação terminal e exaustão.

Fabricação de células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) para imunoterapia adotiva

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