Name: Núcleo/Shell impressão scaffolds para engenharia de tecidos de estruturas tubulares (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Aprenda a fabricar scaffolds tubulares ocos por bioprinting core/shell para engenharia de tecidos vasculares. Este método simplificado permite impressão 3D com células em uma única etapa.

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Os autores gostariam de reconhecer o apoio financeiro para este projeto recebido da Agência de pesquisa eslovena (números de subvenção: P3-0036, e i0-0029), e do Ministério da ciência, educação e desporto (número de subvenção: 5442-1/2018/59).

1. preparação de hidrogéis e soluções de ligação cruzada
<ol><li>Resumidamente, misturando vigorosamente, dissolva os pós ALG e CMC em água ultrapura para obter um total de 3 WT% ALG e 3 WT% CMC solução. Nota: neste trabalho, são utilizadas seringas de 5 mL para impressão; assim, a quantidade final de material é ajustada a esse volume. No entanto, para outros cartuchos de extrusão e tamanhos de amostra impressos, a quantidade de material preparado deve ser dimensionada de acordo.</li>
	<li>Adicione 1,5 WT% de nanofibras de celulose à mistura ALG-CMC para reforço mecânico adicional para atingir a viscosidade desejada, adequada para impressão.</li>
	<li>Agitar a suspensão do hidrogel até ser homogênea usando um misturador aéreo. Nota: não devem existir fibras ou bolhas no hidrogel.</li>
	<li>Prepare 10 mL de solução de cloreto de cálcio de 100 mM (CaCl2) em água ultraleve, que é utilizada como a solução de ligação cruzada primária para impressão.</li>
	<li>Prepare 10 mL da solução de 5 WT .% CaCl2 na água ultra-pura, que é usada como uma solução cross-linking secundária no borne-processamento dos scaffolds. Nota: geralmente, todas as formulações do hidrogel, que são apropriadas para o cross-linking químico imediato, permitem a fabricação de uma etapa de tubos ocos e podem ser usadas com este tipo de núcleo/escudo set-up. Os mecanismos de impressão e cross-linking precisam ser otimizados de acordo. A viscosidade do hidrogel variará dependendo da composição desejada; no entanto, pode ser ajustada com concentrações de polímero e a adição de agentes espessantes (por exemplo, nanofibras). A viscosidade ideal para a impressão 3D de estruturas estáveis é suficientemente alta para que o filamento extrudido conserve a sua forma e para que o andaime Mantenha o seu próprio peso antes da ligação cruzada.</li>
</ol>2. núcleo/Shell impressão de andaimes perfusable
<ol><li>Antes de imprimir, esterilizar o bioimpressora pulverizando 70% etanol completamente e expô-lo à luz UV para 1 h.</li>
	<li>Ligue a bioimpressora e execute o software de controle, que vem em um pacote com a impressora 3D.</li>
	<li>Realize o procedimento de homing pressionando o ícone Home .</li>
	<li>Usando o arquivo de comando da barra de ferramentas | Importe o G-Code, importe o g-código gerado do andaime.</li>
	<li>Transfira o hidrogel para uma seringa estéril de 5 mL e coloque-o em uma das montagens da extrusora da impressora 3D. Através do luer-fechamento e de um tubo curto, conecte-o à entrada lateral do luer do bocal do núcleo/escudo.</li>
	<li>Transfira a solução de ligação cruzada (100 mM CaCl2) para outra seringa estéril de 5 ml com uma agulha de extremidade sem corte G27 anexada e insira-a no suporte superior da agulha do bocal do núcleo/concha. A agulha interna deve sobressaliência ligeiramente (~ 1 milímetro) do bocal exterior do núcleo/escudo. Ajuste o alinhamento manualmente. Insira a segunda seringa no suporte de extrusão.</li>
	<li>Para inserir corretamente as seringas nas montagens (set-up mostrada na Figura 2), controle manualmente ambas as montagens de extrusão clicando nas setas a e B e para cima e para baixo .</li>
	<li>Antes que a impressão comece, extrusão separada o hidrogel e a solução cross-linking para cancelar todas as bolhas de ar excedentes no bocal do núcleo/escudo e para assegurar um fluxo contínuo do hidrogel.</li>
	<li>Usando as setas Z e para cima e para baixo , ajuste manualmente a distância entre o bocal e o substrato de impressão. Recomenda-se usar um substrato liso de impressão de vidro, que tem boa aderência. O bocal de extrusão não deve estar em contato com o substrato para permitir o fluxo ininterrupto do hidrogel. A distância óptima entre o bocal e a carcaça (altura da camada) é tipicamente a mesma que a largura do diâmetro exterior do bocal, mas é ajustada ao material usado e aos parâmetros individuais da impressão. Ajuste a altura de impressão inicial de acordo com as necessidades individuais.</li>
	<li>Pressione o botão Play para iniciar o processo de impressão. Nota: recomenda-se incluir a impressão de uma saia (Figura 3) que circunda o andaime para assegurar a colocação de um filamento oco homogêneo antes que a impressão do andaime real comece. Para obter um fluxo ideal de hidrogel com a intenção de imprimir scaffolds ideais, variar a composição da formulação, a composição da solução de cross-linking e os parâmetros de impressão (i.e., velocidade de impressão, pressão de extrusão, temperatura de impressão, distância entre o substrato e bocal de extrusão, etc.).</li>
	<li>Após a impressão, Retire cuidadosamente o substrato com o andaime impresso e despeje a solução de ligação cruzada secundária (5 WT .% CaCl2) sobre todo o andaime para garantir a ligação cruzada sobre todo o andaime. Incubar durante 1 min à temperatura ambiente (RT). Nota: Certifique-se de que todo o andaime está submerso na solução de ligação cruzada. Esta etapa é crucial para alcançar as propriedades desejadas da força do andaime mas variará dependendo do material e do método de reticulação usado.</li>
	<li>Usando um bisturi cortar manualmente o excesso de material de saia.</li>
	<li>Esterilizar os andaimes uma luz UV por 30 min. Vire cuidadosamente o andaime e repita o processo de esterilização.</li>
	<li>Retire cuidadosamente o andaime do substrato puxando-o suavemente para os lados. Se o andaime adere fortemente ao substrato, separe-o inserindo uma aresta afiada entre eles.</li>
	<li>Transfira o andaime para um meio de cultura de células incolor (DMEM suplementado com 5 WT .% FBS, 100 U/mL de penicilina e 1 mg/mL de estreptomicina), e incubar-os a 37 ° c em uma atmosfera contendo 5 WT .% CO2 para pelo menos 24 h.</li>
</ol>3. preparação de células endoteliais e solução de ensaio vivo/morto
<ol><li>Para cultivo de células, prepare o meio de cultura de células DMEM avançado com vermelho fenol adicionado e complemente-o com 5% de FBS e 2 mM de L-glutamina. Adicionar 100 U/mL de penicilina e 1 mg/mL de estreptomicina.</li>
	<li>Inicie a linhagem de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) e passe-as de acordo com os protocolos de cultivo HUVEC conforme descrito em47. Nota: recomenda-se a cultura das células na mídia de cultura celular com vermelho fenol adicionado para visualização simples durante a injeção das células em andaimes translúcidos brancos como descrito abaixo.</li>
	<li>Para contagem celular, Pipetar 100 μl de células suspensas em meios de cultura celular e manchá-los com 900 μL de 0,1 WT .% Tripan Blue Solution.</li>
	<li>Use um contador de células automatizado ou hemocitômetro manual para contar e obter o número estimado de células em suspensão.</li>
	<li>Para o ensaio ao vivo/morto, prepare uma solução de 4 mM de Calceina-AM e 2 mM de iodeto de propiídio em PBS estéril. Nota: a solução viva/inoperante deve ser preparada diretamente antes de conduzir o ensaio.</li>
</ol>4. transferência de células em andaimes
<ol><li>Remova os andaimes dos meios de cultura da pilha e transfira-os em um prato de Petri de vidro suficientemente grande.</li>
	<li>Imediatamente antes de injetar as células nos andaimes, dissociar os HUVECs dos frascos usando o tratamento por 0,25 WT .% Trypsin.<ol>
<li>Brevemente, descarte a mídia de cultura celular e incubar as células com 0,25 WT .% tripsina (~ 2 mL) por 5 min a 37 ° c.</li>
		<li>Após incubação adicionar ~ 3 ml de meios de cultura celular para as células tripsinizadas e transferir todas as células destacadas para um tubo de centrífuga.</li>
		<li>Centrifugue as células a 200 x g durante 5 min e elimine o sobrenadante.</li>
		<li>Ressuscite as células em meios de cultura de células frescas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Conte as células conforme descrito anteriormente. Ajuste a concentração total de células de acordo com as necessidades individuais. Neste trabalho, é utilizada uma concentração inicial de 340.000 células/mL.</li>
	<li>Ressuspender as células numa seringa estéril com uma agulha G27 com corte em anexo.</li>
	<li>Encontre um ponto de entrada e comece com cuidado injetando pilhas nos scaffolds. O fluxo de suspensão da célula através de um andaime translúcido deve ser visível. Certifique-se de que o andaime inteiro enche-se acima com suspensão da pilha.</li>
	<li>Mergulhe os andaimes em meios de cultura celular e incubar-os a 37 ° c em uma atmosfera contendo 5 WT .% CO2 por até 10 dias.</li>
	<li>Reabasteça a mídia de cultura celular de acordo com as necessidades experimentais.</li>
</ol>5. teste vivo/inoperante e imagem latente da pilha
<ol><li>Após a incubação, enxágüe os andaimes com PBS.</li>
	<li>Com uma agulha Blunt-end, injete cuidadosamente a solução viva/morta previamente preparada (4 mM de calceina-AM e 2 mM de iodeto de propiídio em PBS) nos andaimes e incubar-os em PBS por 30 min a 37 ° c. Certifique-se de que a solução flui através do comprimento do andaime inteiro.</li>
	<li>Enxágüe os andaimes com PBS.</li>
	<li>Transfira com cuidado os andaimes a uma corrediça de vidro.</li>
	<li>Observe as células tingidas diretamente nos andaimes um microscópio de fluorescência. Nota: células viáveis produzem fluorescência verde e células mortas emitem luz de fluorescência vermelha.</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Projeto do bocal Usando o núcleo desenvolvido/bocal do escudo, integrado em um sistema de vitaprint da dois-extrusora, os andaimes tubulares, tubular foram fabricados em um processo da único-etapa. Para conseguir uma espessura mesmo da parede do tubo com a maioria dos scaffolds preparados, a agulha precisa de ser posicionada centralmente no eixo do anel exterior da extrusão. As agulhas padrão do calibre exibem frequentemente uma excentricidade ligeira, contudo significativa fora da linha central. Assim, o corpo do bico foi projetado para segurar a agulha em dois lugares, uma vez na parte superior (fixação do cubo) e uma vez antes do núcleo final/câmara de casca (fixação da cânula em si), corrigindo o seu alinhamento axial. A precisão do alinhamento axial aumenta com a distância entre o ponto de fixação. Há, entretanto, um compensação entre o comprimento da agulha e o volume disponível da câmara do bocal. Para melhorar a funcionalidade da configuração mais adicional, determinadas modificações do bocal podem ser executadas: A) uma montagem do bocal com estabilidade melhorada, B) bocais adicionais para uma escala mais larga da compatibilidade da agulha, C) um mecanismo preciso do ajuste para a agulha a posicionamento do bocal, e D) integrando entradas adicionais e dispositivos microfluídicos para na preparação material da mosca.
Otimização de hidrogel Para determinar a relação ideal de ALG: CMC, várias iterações de material foram avaliadas. Geralmente, a impressão do núcleo/escudo com concentrações acima de 3 WT .% de ambos os componentes foi rendida impossível, porque não permitiu um fluxo contínuo do hidrogel ou conduziu ao entupimento do bocal. Especificamente, a concentração de ALG acima de 3 WT .% aumentou a viscosidade excessivamente e conduziu à obstrução do bocal, quando umas mais baixas concentrações de ALG e umas concentrações mais elevadas de CMC (> 3 WT .%) abrandaram épocas cross-linking e assim não fornecerem suficiente apoio estrutural do andaime. A impressão de núcleo/casca foi possível com formulações menos viscosas; no entanto, a viscosidade do gel extrudido deve ser suficiente para sustentar a fidelidade de forma a longo prazo. No final, uma proporção de 1:1 ALG: CMC foi comprovada como a escolha mais adequada, confirmando um estudo prévio de Maver et al.49. A adição de NFC melhorou significativamente a printabilidade e a rigidez estrutural de andaimes impressos de núcleo/casca, mas não teve efeito significativo nas propriedades de vinculação cruzada do material.
Aplicativos personalizados, otimizados para tipos específicos de células e set-ups experimentais exigirá materiais de andaime bem adaptados, que variarão em mecanismos de composição e cross-linking. O método descrito neste trabalho é baseado em uma solução de polímero misto de alginato-celulose, que é ligada ionicamente através de íons Ca2 + . Alginato em si é um polímero linear de blocos de (1,4)-ligado β-d-mannuronate (M) e α-l-guluronate (G) resíduos que podem ser reversivelmente ionicamente reticulado pela aplicação de CA2 + e outras cátions divalentes como Sr2 +, br2 +, mg 2 +. No entanto, o íon mais amplamente utilizado para cross-linking de alginato permanece CA2 + na forma de CAcl2. CA2 + também pode ser usado na forma de caso4 ou caco3; no entanto, a baixa solubilidade do CaSO4 em relação ao CAcl2 significa uma gelação mais lenta. O CaCO3 produz tempos de gelação ainda mais lentos, o que pode resultar em propriedades mecânicas fracas e inconsistentes.
Tempos de gelação mais longos normalmente produzem uma construção mais homogênea, no entanto, determinadas aplicações, como a impressão de núcleo/casca requer taxas de gelação rápida50. Mg2 + íons também induzir a geladura; no entanto, a sua eficiência de ligação cruzada é de cerca de 5x-10x menor, em comparação com CA2 +, com cross-linking vezes de 2-3 h. Além, os íons do magnésio são mais seletivos para unidades oligo, daqui o cross-linking depende mais da composição química do alg51. Neste caso, uma taxa rápida da gelação é essencial assegurar a formação oca contínua da canaleta antes que a estrutura oca possa desmoronar. O CaCl2 rende a taxa a mais rápida da Geladura, que é crucial para a deposição direta de filamentos ocos. 100 mM CaCl2 foi utilizado, que estabilizou adequadamente a formação contínua de um filamento oco sem causar a solidificação do gel dentro do bocal.
Impressão e pós-processamento de andaimes As seguintes etapas devem ser consideradas durante esta parte do processo, incluindo 1) assegurando-se de que todas as soluções e materiais que incluem o bioimpressora 3D estejam esterilizados corretamente antes de imprimir. 2) ao preparar o Hydrogel, a homogeneidade do material é crucial para a impressão contínua. A introdução de impurezas ou bolhas de ar deve ser evitada, pois eles podem entupir o bico e/ou interromper a extrusão. 3) as seringas devem ser conectadas corretamente ao bocal do núcleo/escudo através do mecanismo do luer-fechamento e introduzido corretamente nas montagens da extrusora como visto na Figura 2a, B. 4) antes de imprimir uma estrutura complexa, recomenda-se pre-extrude uma parcela pequena do gel e da solução cross-linking para cancelar as bolhas de ar excedentes no bocal do núcleo/escudo e para assegurar um fluxo contínuo do hidrogel. Isso pode ser incorporado diretamente no código g para melhorar a repetibilidade. 5) é útil adicionar uma saia que circunda o andaime para assegurar a colocação de um filamento oco homogêneo antes que a impressão do andaime próprio comece.
Além disso, 6) para melhorar a aderência entre o filamento de impressão e substrato, recomenda-se a utilização de uma superfície plana com boa aderência (ou seja, uma lâmina de vidro ou placa de Petri). 7) o bocal da extrusão não deve estar no contato direto com a carcaça para permitir o fluxo ininterrupto do Hydrogel. A distância inicial impactará fortemente a qualidade da cópia, mas a espessura do filamento expulso é uma boa aproximação do ajuste inicial. 8) a altura de impressão de partida no g-código deve ser ajustada de acordo com necessidades individuais. Depois que os parâmetros da impressão são otimizados, o g-código do andaime deve ser importado no software do CNC do planeta e no processo de impressão começado como descrito no protocolo. 9) para controlar e otimizar o fluxo de hidrogel com a intenção de imprimir os scaffolds ideais, tanto a composição da formulação como os parâmetros de impressão devem ser variados (i.e., velocidade de impressão, pressão de extrusão, temperatura de impressão, distância entre o substrato e bocal de extrusão, altura da camada, tamanho do andaime, etc.).
Em geral, maiores taxas de fluxo são necessárias para imprimir formulações com maior viscosidade. Como mencionado, todas as formulações do hidrogel, que são apropriadas para o cross-linking químico imediato, permitem a fabricação de uma etapa de tubos ocos e podem ser usadas com o núcleo descrito/conjunto-acima do escudo. Os mecanismos de impressão e cross-linking precisam ser otimizados de acordo. Após a impressão, todos os andaimes foram pós-processados por cross-linking secundário com 5 WT .% CaCl2 solução, que garantiu completa cross-linking do componente alg-CMC e esterilizado de ambos os lados uma luz UV por pelo menos 30 min. Deve ser assegurado para engolir completamente o andaime com a solução cross-linking e incubar por o tempo bastante para terminar o processo cross-linking. O pós-processamento será diferente com base no material e no mecanismo de cross-linking usado, que deve ser considerado de antemão. Após o pós-processamento, os andaimes devem ser removidos cuidadosamente do substrato, transferidos para meios de cultura celular e incubados em atmosfera controlada por pelo menos 24 h antes da semeadura da célula. Usar um meio incolor melhorará a visibilidade da suspensão da pilha durante a injeção nos scaffolds.
Ensaio ao vivo/morto A solução viva/inoperante deve ser preparada diretamente antes de conduzir o ensaio e ser mantida no escuro antes de conduzir o ensaio, porque contem as tinturas da fluorescência que são propensas ao branqueamento. Após o tempo de incubação desejado, os meios de cultura da pilha devem com cuidado ser descartados em torno dos andaimes e enxaguados com PBS. Idealmente, o mesmo ponto de entrada deve ser usado para a semeadura da pilha seguida pelo ensaio vivo/inoperante que está sendo injetado nos scaffolds.
Importância dos resultados Tanto a ALG como a CMC já foram utilizadas para promover a angiogênese in vitro. Com base em suas características ECM-mimmetic, cross-linking físico, e biocompatibility, alg foi empregado geralmente como um componente para a entrega e a liberação controlada de fatores de crescimento angiogênico (por exemplo, bFGF, HGF, VEGF164, e ang-1 * respectivamente)52 ,53,54. Além disso, em combinação com gelatina, a CMC também tem sido utilizada para encapsuar células endoteliais vasculares devido às suas capacidades de ligação cruzada rápida condições fisiológicas55. A NFC foi adicionada para aumentar ainda mais a estabilidade mecânica e a fidelidade da forma dos scaffolds. Ressalta-se que o objetivo não foi o de potencializar a vascularização, mas demonstrar a possibilidade de produzir andaimes ALG-CMC, estampados em forma de núcleo/concha, que também facilita o apego e a proliferação de HUVECs. A escolha do uso de uma mistura ALG-CMC foi baseada em achados de materiais de base comumente usados, de fácil acesso e biocompatíveis que poderiam permitir a impressão de núcleo/casca de canais ocos. Muitos outros materiais podem ser opções mais viáveis para melhorar a angiogênese; Entretanto, alguns não são apropriados para a impressão do núcleo/escudo, porque não facilitam a gelação rápida/cross-linking, que é crucial nesta aproximação.

Indiscutivelmente, o objetivo final da engenharia tecidual (te) é produzir tecidos ou órgãos funcionais in vitro, que podem ser usados para regenerar ou substituir partes feridas ou doentes do corpo humano1,2,3. A pesquisa atual em engenharia de tecidos (TE) está focada em aspectos individuais do campo (materiais de andaimes, procedimentos de fabricação, fontes de células, etc.) 4,5, bem como desenvolver modelos in vitro simples de tecidos e órgãos que imitam aspectos fundamentais de seus homólogos in vivo. Tais modelos já são úteis para muitas aplicações, tais como estudos de triagem de medicamentos etoxicidade, especialmentenos casos em que culturas de células 2Dconvencionais nãoimitam as respostas dinâmicas dos tecidos nativos6,7, 8,9. Os modelos in vitro tridimensionais são construídos geralmente combinando as pilhas10, as indicações physico-químicas 11, emoléculas biologicamente ativas12,13em andaimes, que são obtidos de tecidos decelularizados ou construídos de novo a partir de materiais biológicos ou biocompatíveis14,15,16,17,18.
É crucial que os andaimes recapitular a microarquitetura 3D complexa e a estrutura hierárquica dos tecidos nativos para permitir a funcionalidade dos tecidos projetados, representante de in vivo tecidos19. Apesar do avanço tecnológico significativo no TE, o desenvolvimento de construções de tecidos artificiais fisiologicamente relevantes continua sendo um desafio. Tecidos grossos (> 200 μm de espessura) são especialmente problemáticos, devido a limitações como oxigênio e difusão de nutrientes20. O progresso para construções maiores do tecido foi feito; Entretanto, a proximidade elevada exigida das pilhas aos vasos sanguíneos a fim transportar o oxigênio e os nutrientes e promover a remoção waste deve ser recapitulated. A vascularização dos tecidos (ou, alternativamente, a fabricação de redes vasculares 3D interconectadas dentro de construções teciduais) desempenha um papel crítico na manutenção da viabilidade celular e na promoção de funções de tecidos projetados in vitro, o que é mais difícil para modelos em experimentos prolongados21,22. Além disso, a resolução necessária, a integridade estrutural e a biocompatibilidade simultânea ainda não foram alcançadas23.
Várias abordagens de TE foram propostas na tentativa de construir estruturas semelhantes a vasos sanguíneos e facilitar a vascularização in vitro. Alguns exemplos incluem a semeadura de células endoteliais (também cocultivadas com outros tipos de células, como fibroblastos) que se montam para gerar redes microvasculares24, uso de células progenitoras vasculares e pericitos que promovem a célula endotelial crescimento21,25, a entrega de fatores de crescimento angiogênico que induzem a vascularização20,26, utilizando tecnologia de folha de células que permite o controle sobre a estratificação vascular20, e fabricação de estruturas altamente porosas do andaime que promovem a angiogênese27. As abordagens mencionadas incidem sobre a indução da angiogênese, que geralmente requer quantidades consideráveis de fatores de crescimento adicionais (por exemplo, VEGF) e tempo de forma. No entanto, as maiores desvantagens são sua reprodutibilidade limitada e controle espacial restrito sobre a padronização vascular, geralmente resultando em uma distribuição de vasculatura aleatória dentro da construção tecidual que não necessariamente facilita a perfusão.
A fabricação de aditivos (am, como a bioimpressão 3D) está cada vez mais envolvida na fabricação de construções 3D usando materiais biológicos ou biocompatíveis para criar andaimes adequados para te. Várias abordagens AM estão sendo usadas e desenvolvidas em paralelo (por exemplo, métodos baseados em jato de tinta e microextrusão, diferentes tipos de técnicas litográficas) para produzir andaimes que imitam tecidos nativos em sua arquitetura, bioquímica e funcionalidade . As técnicas individuais exibem certas vantagens e desvantagens28, razão pela qual várias modificações que estão sendo exploradas (por exemplo, micropadronização, angiogênese induzida, etc.) para aumentar a medida em que grande, complexa e estável vascular as redes podem ser fabricadas22,29,30.
Entre estes, a bioimpressão por extrusão é o método mais comumente usado, especialmente devido à ampla gama de materiais compatíveis (um processo geralmente amigável para células28,31,32), bem como versatilidade excepcional em termos de aplicações (por exemplo, impressão incorporada e sacrificial23,33, fabricação de estruturas ocas34,35, etc.). Os principais desafios que ocupam os estudos atuais incluem a transferência de estruturas 2D para 3D, a formação de uma densa rede de tubos ocos com alta resolução espacial, e a integridade mecânica geral e a fidelidade da forma durante o fluxo de fluido na cultura celular condições de30.
A aproximação a mais direta ao tecido perfusable é a fabricação de uma rede interconectada dos canais dentro do constructo. A criação de tais canais perfusable dentro de um andaime do tecido é esperada resolver muitos dos problemas acima mencionados, porque permite imediatamente a difusão do nutriente e do oxigênio ao remover produtos waste. Conseqüentemente, a formação potencial de regiões Necrotic dentro do constructo é evitada36. Esses canais podem adicionalmente ser semeados com células endoteliais (ECs) e servir como vasos sanguíneos artificiais em modelos de tecido 3D37. No sentido mais elementar, uma embarcação pode consistir em um canal oco, camada macia de ECs, e casca dura. Recentemente, a extrusão 3D de dois materiais diferentes em uma forma do núcleo/escudo que utiliza agulhas co-axiais para a extrusão ganhou muito interesse38,39,40,41, porque permite a fabricação de tubos ocos.
Similar à impressão 3D convencional da microextrusão, a impressão do núcleo/escudo é executada com um bocal co-axial (por exemplo, duas agulhas com diâmetros diferentes alinhados no mesmo eixo em uma maneira, de modo que a agulha mais larga encerque o mais estreito). Assim, dois materiais podem ser extrudados simultaneamente, com um como o filamento central ou núcleo "interno" e um segundo como o escudo "exterior"41. Até o momento, a bioimpressão co-axial tem sido utilizada para fabricar estruturas com sólidos42, Core/Shell43e fios ocos40,44; no entanto, os materiais utilizados não foram otimizados para a viabilidade celular ideal e robustez mecânica das construções impressas. Como mencionado, a técnica oferece a possibilidade de combinar biomateriais com diferentes propriedades mecânicas, nas quais o mais rígido suporta o mais macio. Mais importante, se o material do andaime (por exemplo, alginato, carboximetilo celulose) é expulso como o escudo, enquanto o núcleo composto do agente de ligação cruzada (por exemplo, cloreto de cálcio) é dispensado do capilar interno, em seguida, enxaguado para fora pós-impressão, é possível fabricar um tubo oco contínuo em uma única etapa45.
Com isto em mente, um método simples e repetível de uma etapa foi desenvolvido para construir andaimes bem definidos e perfusable para a engenharia de estruturas vasculares e outros tecidos tubulares. Para desenvolver uma tecnologia rentável, a fabricação deve idealmente ser um processo de passo único. Portanto, um núcleo/Shell set-up foi adaptado e integrado na bioprinter 3D. O projeto básico consiste em um bocal central feito do metal para evitar a deformação durante a injeção, em torno de que um segundo bocal de um diâmetro maior é coloc. Tal ajuste do bocal co-axial permite a coextrusão dos dois fluxos e o cross-linking imediato do canal expulso do hidrogel. Isto permite a fabricação direta de filamentos ocos multicamadas, quando o cross-linking subseqüente com umas concentrações mais elevadas de cloreto de cálcio (CaCl2) assegura uma estabilização mais permanente da parte externa.
Como tal, este método permite a impressão simultânea de andaimes e microcanais, em que os filamentos ocos do hidrogel servem como um andaime para suportar a integridade mecânica de construções 3D e atuam simultaneamente como microcanais incorporados para entregar nutrientes para o crescimento celular. Este protocolo fornece um procedimento detalhado da estratégia bioprinting do núcleo/escudo 3D baseado no uso de um bocal co-axial feito-à-medida em que as estruturas do hidrogel 3D com canaletas internas são fabricadas controlando o cross-linking para produzir filamentos ocos, que permanecem perfusable durante a cultura da pilha.
A configuração de impressão 3D usada neste trabalho é configurada como descrita anteriormente por Banović e Vihar46 e pode ser dividida em três componentes principais: a) uma configuração mecânica CNC de três eixos com precisão de posicionamento de 50 μm nas direções X, Y e Z; B) duas extrusoras, adaptadas para seringas descartáveis de 5 mL de Luer-Lock, com resolução de 1,2 μL de VOXEL; e C) controlando a eletrônica e o software.
Para facilitar a impressão do núcleo/escudo, um bocal apropriado foi desenvolvido que possa ser montado em uma das extrusoras (extrusora preliminar, imprimindo o núcleo) e é compatível com as agulhas Blunt-end G27. Igualmente tem a compatibilidade do luer-fechamento para conectar com a segunda extrusora (imprimindo o escudo). Os primeiros protótipos foram fabricados através da inserção de uma agulha G27 (diâmetro interno = 210 μm, diâmetro externo = 410 μm) em uma agulha G21 (diâmetro interno = 510 μm, diâmetro externo = 820 μm) ou ponta cônica do G20 (diâmetro interno = 600 μm), inserindo um n secundário Marjorie lateralmente para fornecer o material do escudo. No entanto, devido à ligeira dobra do eixo da agulha, não é possível produzir uma ponta de bico com alinhamento concêntrico das agulhas internas e exteriores.
Para resolver esta edição, um projeto novo do bocal foi elaborado que cumpriu os seguintes critérios: 1) pode ser manufacturado usando um moinho do CNC de 3 eixos, 2) pode ser feito dos vários materiais (plásticos do elevado desempenho, tais como o auge ou os metais), 3) tem a compatibilidade do luer-fechamento para aplicar o material da casca, e 4) é compatível para uma agulha Blunt-end G27 e prende-o no lugar em duas posições para alinhar a ponta com o eixo central. Um esquema do protótipo do bico é mostrado na Figura 1.

<table><tbody><tr><td>Sal de sódio de ácido algínico</td><td>Sigma-Aldrich (Alemanha)</td><td>180947</td><td>pó; Mw ~ 80.000</td></tr><tr><td>ATTC HUV-EC-C [HUVEC]</td> <td>LGC Standards (Reino Unido)</td> <td>ATCC-CRL-1730</td><td>Suplemento de Crescimento de Células Endoteliais (ECGS) e fatores não identificados de extratos de hipófise bovina, hipotálamo ou cérebro inteiro são mitogênicos para esta linha; as células têm uma expectativa de vida de 50 a 60 duplicações populacionais.</td></tr><tr><td>Microscópio óptico invertido Axiovert 40</td><td>Carl Zeiss Microscopy GmbH (Alemanha)</td><td></td> <td>três técnicas contrastantes em uma objetiva - por exemplo, campo claro, contraste de fase e PlasDIC</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Sigma-Aldrich (Alemanha)</td> <td>C1016</td><td>anidro; granular; &le; 7,0 mm; &ge; 93,0%</td></tr> <tr><td>Suspensão de nanofibrilas de celulose (NFC, 3% (p / v))O</td> <td>Centro de Desenvolvimento de Processos, Universidade do Maine (Maine, EUA)</td><td></td>largura <td>nominal da fibra de 50 nm; comprimentos de até várias centenas de mícrons Sistema de</td></tr><tr><td>purificação de água ELGA Purelab</td><td>Veolia Water Technologies (Reino Unido)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de imagem celular EVOS FL</td><td>ThermoFisher Scientific Inc. (Alemanha)</td><td>AMF4300</td><td>um sistema de imagem totalmente integrado, digital e invertido para aplicações de fluorescência de quatro cores e luz transmitida</td></tr><tr><td>Gibco Advanced Dulbecco' s Águia modificada' s medium (Advance DMEM)</td><td>ThermoFisher Scientific Inc. (Alemanha)</td><td>12491015</td><td>glicose elevada; sem glutamina; vermelho de fenol</td></tr><tr><td>Gibco Dulbecco» s Águia modificada' s meio (DMEM)</td><td>ThermoFisher Scientific Inc. (Alemanha)</td><td>21063029</td><td>glicose alta; L-glutamina; HEPES; </td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino Gibco (FBS) sem</td> vermelho de fenol, qualificado <td>ThermoFisher Scientific Inc. (Alemanha</td><td>)10270106</td><td>Origem FBS: Brasil; 5% (p/v)</td></tr><tr><td>Agulha Esterílica Hipodérmica</td><td>FBS B. Braun Melsungen AG (Alemanha</td><td>)9180117</td><td>0,40 x 25mm, 27G x 1''</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Sigma-Aldrich (Alemanha)</td><td>G3126</td><td>ReagentPlus&reg; , &ge; 99% (HPLC)</td></tr> <tr><td>Kit de coloração dupla de células vivas/mortas</td><td>Sigma-Aldrich (Alemanha)</td><td>4511</td><td>contém soluções de calceína-AM e iodeto de propídio (PI); adequado para frascos de</td></tr><tr><td>cultura de células Nunc EasYFlask de fluorescência</td><td>ThermoFisher Scientific Inc. (Alemanha)</td><td>156367</td><td>Nunclon Delta certificado para formação de monocamada, eficiência de clonagem, não citotóxico, não pirogênico e esterilidade; tampas de filtro; área de cultura de 25 cm2</td></tr><tr><td>Seringa Omnifix</td><td>B. Braun Melsungen AG (Alemanha)</td> <td>4617053V</td><td>5 mL Luer Lock</td></tr><tr><td>Penicilina G sal de sódio</td><td>Sigma-Aldrich (Alemanha)</td> <td>P3032</td><td>em pó; BioReagente; adequado para cultura de células</td></tr><tr><td>Tampão fosfato solução salina</td><td>Sigma-Aldrich (Alemanha)</td> <td>P4417</td><td>comprimido; um comprimido dissolvido em 200 mL de água deionizada produz 0,01 M de tampão fosfato, 0,0027 M de cloreto de potássio e 0,137 M de cloreto de sódio, pH 7,4, a 25 &deg; C</td></tr><tr><td>Carboximetilcelulose de sódio</td><td>Sigma-Aldrich (Alemanha)</td><td>419338</td><td>pó; Mw médio ~ 700.000</td></tr><tr><td>Sal de sulfato de estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich (Alemanha)</td> <td>S9137</td><td>em pó; BioReagente; adequado para cultura de células</td></tr><tr>Água<td>ultrapura</td><td>Veolia Water Technologies (UK)</td><td></td><td>18,2 m? cm a 25? C</td></tr><tr><td>VitaPrint Impressora 3D bio-impressora</td><td>IRNAS (Eslovénia)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

núcleo/shell impressão scaffolds para engenharia de tecidos de estruturas tubulares

Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures

A impressão tridimensional (3D) de filamentos do núcleo/escudo permite a fabricação direta de estruturas de canaleta com um escudo estável que seja Cross-linked na relação com um núcleo líquido. Este último é removido após a impressão, deixando atrás de um tubo oco. Integrando uma técnica de manufatura aditiva (como a descrita aqui com tintas medida [bio], que imitam estruturalmente e bioquimicamente a matriz extracelular nativa [ECM]) é um passo importante para a engenharia avançada de tecidos. No entanto, a fabricação precisa de estruturas bem definidas requer estratégias de fabricação personalizadas otimizadas para o material em uso. Portanto, é sensato começar com uma set-up que é personalizável, simples de usar e compatível com um amplo espectro de materiais e aplicações. Este trabalho apresenta um bocal do núcleo/escudo da fácil-à-manufatura com Luer-compatibilidade para explorar a impressão do núcleo/escudo de estruturas do lenha, testado com uma formulação bem definida, alginato-baseada do material do andaime.

O objetivo deste trabalho foi desenvolver um bocal de núcleo/concha de fácil fabricação com compatibilidade Luer para impressão de núcleo/casca de estruturas de estacas de madeira. Além disso, um protocolo de impressão de uma etapa simples e repetível foi descrito, o que é simples de modificar e acomoda uma ampla gama de materiais e diferentes mecanismos de cross-linking químico para construir andaimes bem definidos e perfusable para Engenharia de estruturas vasculares e outras do tecido tubular.
Bocal do núcleo/escudo O bocal é compor de uma agulha Blunt-end de G27 (para imprimir o filamento axial interno) e o corpo do bocal, que prende a agulha no lugar e cria um bocal exterior para o filamento do escudo com uma porta da conexão para a entrada material. Um esquema é mostrado na Figura 1. Duas seringas de 5 mL, que são colocadas nas extrusoras individuais e fornecem os materiais do núcleo e do escudo. A tubulação conecta o corpo do bocal com a seringa, fornecendo o material da casca.
O conjunto completo do bocal do núcleo/escudo e da montagem da seringa é mostrado na Figura 2. O primeiro protótipo funcional do corpo do bico foi fabricado por fresamento CNC um bloco de polioximetileno (POM). A compatibilidade e a selagem entre o elemento, uma agulha G27 e a tubulação foram testadas instalando em Vitaprint. Nenhum escapamento do material da casca foi observado no bocal, no conector do luer-fechamento, ou entre o corpo e a agulha. O corpo do bocal cabe firmemente com o cubo da agulha (conector do luer), assegurando o movimento sincronizado do bocal inteiro com o extrusor.
Edifício do andaime A aproximação a mais direta a fabricar andaimes é depositando a camada dos materiais pela camada onde a direção da impressão é mudada cada camada consecutiva, tipicamente em um ângulo de 90 °. Devido às propriedades visco-elásticas e higroscópicas dos hidrogéis, manter a fidelidade da forma das estruturas impressas permanece desafiadora. O objetivo principal desta seção de protocolo é a impressão 3D de andaimes de núcleo/casca perfusable usando dois polímeros, que mostraram anteriormente resultados promissores para construção de andaime (alg e CMC) com a adição de nanofibras de celulose (NFC) para aumento estabilidade mecânica. Ambos os ALG e CMC são carregados negativamente, copolímeros lineares solúveis em água48 e ambos contêm grupos carboxilo, que podem ser reticulados com a adição de cátions divalentes. CA2 + partículas formam ligações iônicas com dois grupos funcionais simultaneamente, formando conexões entre cadeias poliméricas, aumentando a rigidez do gel.
Impressão de andaimes perfusable O objetivo deste processo é a 3D-Print simples lenha estruturas de andaime, que abrangem várias camadas e manter a sua forma de fidelidade, bem como a perfusabilidade até se tornar totalmente Cross-linked. Isto exige mesmo coextrusão do núcleo e do escudo sem movimentos do cruzamento ou da retração, que podem interromper o fluxo. Portanto, os métodos típicos de modelagem e fatiamento de CAD são menos adequados. Neste trabalho, um g-Code manualmente projetado é usado, e um gerador de g-Code Python-based foi desenvolvido para a preparação rápida do g-código.
Os andaimes foram estruturados em uma forma da grade do lenha e construídos em uma superfície de vidro Lisa. A fabricação foi realizada camada por camada, depositando as linhas de cruzamento de cada camada sucedendo em um ângulo de 90 ° para o anterior. Além disso, cada camada subseqüente foi 2% mais estreita nas direções X e Y, garantindo o suporte contínuo de filamento por camadas anteriores. A distância entre os filamentos (tamanho do macropore) pode precisamente ser projetada no g-Code tendo em consideração o diâmetro exterior do filamento expulso (0,8 milímetros) e a distância entre linhas de grade (3 milímetros).
Os scaffolds eram exigidos cumprir critérios chaves da inclusão para uma consideração mais adicional. Em primeiro lugar, foram necessários andaimes com pelo menos 4 camadas de altura para manter a sua integridade estrutural e geometria (por exemplo, tamanho de macroporos) durante a impressão, para ser elegível para um maior desenvolvimento. Em segundo lugar, os andaimes precisavam permanecer perfusáveis (microcanais estáveis) mesmo após serem incubados por 7 dias em meios de cultura celular a 37 ° c. Em intervalos de tempo apropriados (1, 2, 5, e 7 dias) os andaimes foram retirados dos meios de cultura e testados para ver se eram ainda perfusable. Na figura 4a, a seção transversal de um andaime recém-impresso e pós-processado exibe um canal oco claramente visível dentro do filamento. Na Figura 4B, é evidente que mesmo após 72 h de incubação em meios de cultura celular a 37 ° c, o filamento retém a estrutura oca através de todo o comprimento do andaime.
Diversas formulações foram imprimíveis, permaneceram estruturalmente estáveis, preservaram a geometria impressa e permaneceram perfundidos; no entanto, um único foi escolhido para mais testes (ou seja, 3 WT .% ALG + 3 WT .% CMC + 1,5 WT .% NFC), que permitiu a impressão de andaimes perfusable com até 10 camadas. O processo de impressão com o bocal personalizado é mostrado na Figura 5a. A impressão de núcleo/casca foi possível com formulações menos viscosas; Entretanto, os géis com concentrações mais elevadas não permitiram o fluxo contínuo através do bocal. Para o cross-linking preliminar (material do núcleo, entregado durante a impressão) 100 milímetro CaCl2 foi utilizado, que estabilizou adequadamente a formação contínua de um filamento oco, sem causar a solidificação do gel dentro do bocal. Post-printing, os andaimes foram embebidos em uma solução de 5 WT .% CAcl2 para cruzar completamente o hidrogel para a fidelidade a longo prazo da forma. Uma amostra de andaime acabada é retratada na Figura 5b. Durante a otimização, utilizou-se o processo de formulação de corante artificial na solução do núcleo, para permitir a avaliação visual e examinar a qualidade do filamento extrudido. A tintura não foi usada para a fabricação dos scaffolds finais, que foram preparados para a semeadura e o cultivo da pilha.
Ensaio ao vivo/morto Após a incubação, foi utilizado um ensaio vivo/morto para visualizar os ECs e distinguir entre as células vivas (verde) e mortas (vermelhas) dentro do andaime incubado. Isto serviu a duas finalidades principais: a) para determinar se os andaimes fornecem um ambiente biocompatível para promover o crescimento e a adesão sem expor efeitos prejudiciais na pilha, e B) para visualizar a integridade estrutural de estruturas tubulares e seus sistema de canal interno em mais detalhes.
Os resultados do ensaio vivo/morto são mostrados na Figura 6. Na presença de esterases intracelulares, a membrana plasmática permeável Calcein-AM é convertida em Calceina, emitindo luz de fluorescência verde em células ao vivo. Por outro lado, as células apoptóticas são visualizadas pelo iodeto de propiídio impermeável à membrana, que fluoresce em vermelho quando intercalados na dupla hélice de DNA. Imagens vivas/mortas e imagens de campo brilhante de andaimes foram combinadas para ajudar a visualizar as células dentro dos canais ocos. A solução de coloração foi injetada, e o ensaio foi realizado diretamente nos andaimes impressos em 3D após incubação de células de andaime para 48 h.
Deve-se notar que uma densidade de semeadura relativamente pequena de ECs foi usada (340.000 Cells/mL), porque este estudo serviu somente como uma prova--conceito para a impressão do núcleo/escudo de scaffolds perfusable. A conclusão mais significativa do ensaio vivo/morto é que mesmo após 48 h, não foram observadas células mortas (vermelhas), provando que nem o próprio material de andaime, nem seus produtos de degradação exibiram efeitos tóxicos. Além disso, os ECS fizeram de facto aderiram e permanecem Unidos dentro dos andaimes e pareceram formar aglomerados uniformente distribuídos quando crescidos dentro dos canais. Isso sugere que o método de fabricação descrito e a formulação de andaime fornecem uma estrutura adequada para a construção de morfologias de tecidos tubulares in vivo, relevantes. Além de imitar interações Cell-ECM e uma comunicação de células-células apertadas em todas as três dimensões espaciais, a engenharia complexa de tecidos também requer exposição celular constante ao meio fresco para sustentar sua viabilidade. Isto por sua vez pode ser conseguido por uma rede densa do canal a perfusão contínua, que justifica uma investigação mais adicional no trabalho futuro, e exigirá aperfeiçoar parâmetros do material e do crescimento para facilitar a engenharia a longo prazo do tecido do vasculature.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59951/59951fig1.jpg"> Figura 1: protótipo do bocal Core/Shell. (A) o projeto geral e os componentes principais do protótipo do corpo do bocal são mostrados. O bocal é terminado introduzindo uma agulha Blunt-end G27 através da parte superior. Os suportes superiores e inferiores da agulha imobilizam e realinhar a agulha com o eixo do bocal, assegurando-se de que a ponta se estende do bocal através do centro.  Para conectar o bocal com o material do "escudo" expulso da seringa secundária, a tubulação com um conector do luer-fechamento é unida à entrada lateral. A partir daqui, o material é encaminhado para o bocal através de um canal estreito. A fabricação do canal mencionado requer perfuração em duas posições, produzindo furos que precisam ser tampados após a fabricação). (B) mostrado é um close-up do bocal com uma agulha G27 inserida, estendendo para fora do bocal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59951/59951fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59951/59951fig2.jpg"> Figura 2: set-up final do núcleo/escudo. (A) mostrado é o bocal completo do núcleo/escudo com as seringas corretamente Unidas que contêm o hidrogel (direito), construindo o "escudo" e a solução cross-linking (à esquerda) expulsou como o "núcleo". (B) mostrado é o núcleo/Shell set-up instalado no sistema Vitaprint com duas extrusoras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59951/59951fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59951/59951fig3.jpg"> Figura 3: G-código do andaime tubular. Aqui é mostrada uma captura de tela do software da impressora, especificamente a visualização do caminho (a) e o código g RAW da primeira camada (B). O código g é um conjunto de instruções com coordenadas de destino em direções espaciais absolutas (X, Y, Z), bem como extrusão (A, B) em direções relativas. O comando G determina o tipo de instrução, enquanto que o G1 representa o movimento linear para as coordenadas de destino e G92 determina a posição inicial. Além disso, a taxa de avanço dos seguintes comandos é determinada com a instrução F em mm/min. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59951/59951fig3large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59951/59951fig4.jpg"> Figura 4: seção transversal de uma vertente do andaime com um interior oco. (A) mostrada é a fatia de seção transversal do andaime recém-impresso e pós-processado. (B) mostrado é a fatia transversal do andaime depois de ser incubada em meios de cultura celular para 72 h. Enquanto a forma do bico define a extrusão de um tubo com uma seção transversal redonda, o filamento parece ser um pouco achatado na deposição. O canal interno, no entanto, permanece intacto e mantém a sua forma durante a incubação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59951/59951fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59951/59951fig5.jpg"> Figura 5: impressão de núcleo/casca de andaimes. Aqui, a fabricação (a) de um andaime de três camadas de tubo oco e sua forma final (B) são mostradas. Para uma melhor visualização, a solução de cross-linking no núcleo foi manchada com um corante vermelho. A formulação apresenta estabilidade mecânica suficiente para reter a estabilidade do andaime, mesmo que estruturas mais grossas (até 10 camadas, dados não mostrados) sejam fabricadas. As dimensões exteriores da estrutura final foram de aproximadamente 27 mm x 27 mm x 3,5 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59951/59951fig5large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59951/59951fig6.jpg"> Figura 6: ensaio ao vivo/morto realizado diretamente nos scaffolds. Uma suspensão de HUVECs foi injetada no canal interno do andaime, incubadas para 48 h, e tratada com o corante vivo/inoperante. HUVECs viáveis emitem a luz verde da fluorescência, que é representada nos pontos brilhantes da imagem. As células mortas emitem luz de fluorescência verde; no entanto, nenhum é visível no andaime observado. A distribuição das células também significa a forma e as capacidades de perfusão retidas dos canais. A uma extensão menor, a solução viva/inoperante do ensaio igualmente manchou o material do andaime, produzindo a fluorescência clara o microscópio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59951/59951fig6large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Apresentado aqui é um simples de usar, Core/Shell, tridimensional bioprinting set-up para uma etapa de fabricação de andaimes ocas, adequado para a engenharia de tecidos vasculares e outras estruturas tubulares.

Núcleo/Shell impressão scaffolds para engenharia de tecidos de estruturas tubulares

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the ...

A fabricação de estruturas tubulares é uma abordagem promissora para a engenharia tecidual de redes vasculares, que continua sendo um dos grandes desafios no cultivo de tecidos grossos in vitro. A principal vantagem da técnica núcleo/concha é a simples produção de andaimes de filamento oco em um único passo, reduzindo o tempo de fabricação e potencialmente permitindo impressão direta com células. Preparar uma formulação de hidrogel com as propriedades viscoelásticas apropriadas e manter um fluxo contínuo e equilibrado dos materiais do núcleo/concha é crucial para a impressão 3D de andaimes estáveis.Para começar, encha a seringa estéril de 5 mL com hidrogel recém-preparado. Encha uma segunda seringa de 5 mL, equipada com uma agulha de ponta sem corte de 27 calibres, com solução de crosslinking recém-preparada. Monte o bocal do núcleo/concha.Insira uma agulha de extremidade sem corte G27 como componente do núcleo e aperte a agulha usando o parafuso. A agulha interna deve se projetar cerca de 1 mm do bocal da casca do núcleo externo. Conecte a seringa com a solução de crosslinking à agulha G27 no bocal e carregue a seringa em uma das montagens extrusoras de uma impressora 3D esterilizada por etanol.Monte a seringa com hidrogel na segunda extrusora e conecte-a ao bocal. Use uma trava Luer para conectar um tubo curto à entrada luer lateral do bocal do núcleo/concha. Ajuste cuidadosamente o alinhamento até que o bocal toque a superfície antes de retrair o bocal a uma distância igual ao diâmetro do bocal externo.Importe o código g gerado e pressione Play para iniciar o processo de impressão. Após a impressão, remova cuidadosamente o substrato com o andaime impresso e despeje a solução secundária de crosslinking sobre todo o andaime. Incubar o andaime por um minuto em temperatura ambiente.Para separar o andaime do substrato, puxe suavemente o andaime para os lados. Se o andaime aderir fortemente ao substrato, insira uma borda afiada entre ambos os materiais para separá-los. Transfira o andaime para um recipiente fresco.UV esterilizar ambos os lados do andaime por 30 minutos por lado. Em seguida, coloque o andaime em um meio de cultura celular incolor e incubar o andaime a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por pelo menos 24 horas. No dia seguinte, colherá huvex de uma cultura in vitro com 0,25% de trippsina por cinco minutos a 37 graus Celsius.Quando as células se separarem, pare a reação enzimática com 3 mL de meio de cultura celular fresca e colete as células por centrifugação. Suspenda a pelota em meio de cultura fresca contendo fenol vermelho, e dilua as células a 3,4 vezes 10 às quintas células endoteliais por concentração mililitro. Carregue as células em uma seringa estéril de 5 mL equipada com uma agulha calibre 27 e localize um ponto de entrada no andaime.Alinhando a agulha com a seção reta do filamento do andaime, puna cuidadosamente o andaime em um ângulo baixo. Confirme se a agulha está dentro do filamento oco do canal e pressione suavemente o êmbolo para injetar aproximadamente 1-2 mL de suspensão celular no andaime. O fluxo da suspensão deve ser visível através do andaime translúcido.Quando todo o andaime estiver cheio de suspensão celular, submergir o andaime em meio de cultura celular fresca e devolver o andaime à incubadora de cultura celular por até 10 dias. Para imagens vivas/mortas no final da incubação, enxágue o andaime com PBS e use uma agulha de ponta sem corte para injetar cuidadosamente solução viva/morta no andaime. Confirme se a solução encheu todo o andaime e coloque o andaime a 37 graus Celsius por 30 minutos.No final da incubação, enxágue o andaime com PBS e transfira cuidadosamente o andaime para um escorregador de vidro. As células tingidas podem então ser observadas nos andaimes sob um microscópio de fluorescência. Nesta seção transversal de um andaime recém-impresso e pós-processado, um canal oco claramente visível pode ser observado dentro do filamento.Mesmo após 72 horas de incubação em meio de cultura celular a 37 graus Celsius, como demonstrado, o filamento mantém a estrutura oca durante todo o comprimento do andaime. Aqui, um ensaio representativo ao vivo/morto de células endoteliais após 48 horas de cultura dentro de um andaime é mostrado. As células vivas podem ser identificadas pelo seu sinal fluorescente verde brilhante.Esta técnica é a base para a fabricação de um passo de andaimes tubulares ocos e pode ser atualizada pela impressão direta usando células incorporadas à bioindadeira.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

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