Name: Rotulagem metabólica extremamente rápida e específica do RNA in vivo com 4-Thiouracil (Ers4tU) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 s
Description: Aprenda a rotulagem metabólica ultrarrápida de RNA in vivo com 4-tiouracil em Saccharomyces cerevisiae. Este método permite purificar RNA recém-sintetizado com baixo ruído de fundo para experimentos de pulso-perseguição.

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Este trabalho foi apoiado por Wellcome financiamento para JB [104648]. O trabalho no centro Wellcome para a biologia de pilha é apoiado pelo financiamento do núcleo de Wellcome [092076]. Os autores reconhecem os membros do laboratório por sua ajuda: Bella Maudlin, Emanuela Sani, Susanna de Lucas-Arias e shiney George. Os autores também gostariam de agradecer a Patrick Cramer pelo plasmídeo YEpEBI31111.

<ol><li>Duffy, E. E., Schofield, J. A., Simon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gaining+insight+into+transcriptome-wide+RNA+population+dynamics+through+the+chemistry+of+4-thiouridine%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+RNA%22%5BJournal%5D)">Gaining insight into transcriptome-wide RNA population dynamics through the chemistry of 4-thiouridine.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 10 (1), e1513(2018).</li>
<li>Windhager, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrashort+and+progressive+4sU-tagging+reveals+key+characteristics+of+RNA+processing+at+nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Ultrashort and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution.</a> Genome Research. 22, 2031-2042 (2012).</li>
<li>Baptista, T., Devys, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccharomyces+cerevisiae+Metabolic+Labeling+with+4-thiouracil+and+the+Quantification+of+Newly+Synthesized+mRNA+As+a+Proxy+for+RNA+Polymerase+II+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e57982(2018).</li>
<li>Barrass, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+RNA+processing+kinetics+revealed+using+extremely+short+4tU+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide RNA processing kinetics revealed using extremely short 4tU labeling.</a> Genome Biology. 16, 282(2015).</li>
<li>Burger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-thiouridine+inhibits+rRNA+synthesis+and+causes+a+nucleolar+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">4-thiouridine inhibits rRNA synthesis and causes a nucleolar stress response.</a> RNA Biology. 10, 1623-1630 (2013).</li>
<li>Mendoza-Ochoa, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast+and+tuneable+auxin-inducible+degron+for+depletion+of+target+proteins+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast+%28Chichester+England%29%22%5BJournal%5D)">A fast and tuneable auxin-inducible degron for depletion of target proteins in budding yeast.</a> Yeast (Chichester England). 36 (1), 75-81 (2018).</li>
<li>Barrass, J. D., Mendoza-Ochoa, G. I., Maudlin, I. E., Sani, E., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+degradation+to+achieve+specific+and+efficient+protein+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Tuning degradation to achieve specific and efficient protein depletion.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li>
<li>Hobro, A. J., Smith, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+fixation+methods%3A+Spatial+and+compositional+cellular+changes+observed+by+Raman+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Vibrational+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging.</a> Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).</li>
<li>Gustilo, E. M., Vendeix, F. A. P., Agris, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tRNA%27s+Modifications+Bring+Order+to+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">tRNA's Modifications Bring Order to Gene Expression.</a> Current Opinion in Microbiology. 11, 134-140 (2008).</li>
<li>Dolken, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+gene+expression+profiling+for+simultaneous+kinetic+parameter+analysis+of+RNA+synthesis+and+decay%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay.</a> RNA. 14, 1959-1972 (2008).</li>
<li>Miller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+transcriptome+analysis+measures+rates+of+mRNA+synthesis+and+decay+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast.</a> Molecular Systems Biology. 7, 458(2011).</li>
<li>Schmitt, M. E., Brown, T. A., Trumpower, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+simple+method+for+preparation+of+RNA+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 18, 3091-3092 (1990).</li>
<li>Rädle, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Labeling+of+Newly+Transcribed+RNA+for+High+Resolution+Gene+Expression+Profiling+of+RNA+Synthesis%2C+Processing+and+Decay+in+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), e50195(2013).</li>
<li>Herzog, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-linked+alkylation+of+RNA+to+assess+expression+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Thiol-linked alkylation of RNA to assess expression dynamics.</a> Nature Methods. 14, 1198-1204 (2017).</li>
<li>Ohrt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+dissection+of+step+2+catalysis+of+yeast+pre-mRNA+splicing+investigated+in+a+purified+system%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Molecular dissection of step 2 catalysis of yeast pre-mRNA splicing investigated in a purified system.</a> RNA. 19, 902-915 (2013).</li>
<li>Alexander, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RiboSys%2C+a+high-resolution%2C+quantitative+approach+to+measure+the+in+vivo+kinetics+of+pre-mRNA+splicing+and+3%E2%80%B2-end+processing+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">RiboSys, a high-resolution, quantitative approach to measure the in vivo kinetics of pre-mRNA splicing and 3′-end processing in Saccharomyces cerevisiae.</a> RNA. 16, 2570-2580 (2010).</li>
<li>Wallace, E. W. J., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extremely+fast+and+incredibly+close%3A+cotranscriptional+splicing+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Extremely fast and incredibly close: cotranscriptional splicing in budding yeast.</a> RNA. 23, 601-610 (2017).</li>
<li>Adelman, K., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter-proximal+pausing+of+RNA+polymerase+II%3A+emerging+roles+in+metazoans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans.</a> Nature Reviews Genetics. 13, 720-731 (2012).</li>
<li>Preker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Exosome+Depletion+Reveals+Transcription+Upstream+of+Active+Human+Promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA Exosome Depletion Reveals Transcription Upstream of Active Human Promoters.</a> Science. 322, 1851-1854 (2008).</li>
<li>Aslanzadeh, V., Huang, Y., Sanguinetti, G., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+rate+strongly+affects+splicing+fidelity+and+cotranscriptionality+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Transcription rate strongly affects splicing fidelity and cotranscriptionality in budding yeast.</a> Genome Research. 28, 203-213 (2018).</li>
<li>Schofield, J. A., Duffy, E. E., Kiefer, L., Sullivan, M. C., Simon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TimeLapse-seq%3A+adding+a+temporal+dimension+to+RNA+sequencing+through+nucleoside+recoding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">TimeLapse-seq: adding a temporal dimension to RNA sequencing through nucleoside recoding.</a> Nature Methods. 15, 221-225 (2018).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este artigo apresenta um protocolo para a rotulagem 4tu extremamente rápida e específica, para a recuperação do RNA nascent, recentemente sintetizado de s. cerevisiae após tão pouco quanto 15 S da rotulagem, com contaminação muito baixa pelo RNA sem rótulo.
O usuário deve sempre tomar o cuidado para manter a integridade do RNA pelo uso de temperaturas frias e de reagentes DEPC-tratados. A purificação do grânulo de streptavidin é geralmente de confiança; no entanto, o buffer de talão é difícil de manusear; Ele deve ser feito recentemente, com seus componentes adicionados na ordem certa, e não refrigerados ou esterilizados. As falhas comuns incluem o RNA que está sendo dissolvido incompleta após as etapas da precipitação, e assim que sendo não biotinylated ou perdido de outra maneira durante as etapas de processamento. Há uma extensa ajuda de solução de problemas no material complementar.
Há algumas limitações a estar cientes em ers4tU. Um já mencionado é que 4tU retarda o crescimento do fermento (Figura 1a). Para além das RNAs9endogenamente tioladas, apenas as RNAs transcritas durante o período de rotulagem podem ser purificadas por este método. Polimerases pausadas em genes durante todo o tempo de de não produzirá transcritos swcnts que podem ser purificados, embora os transcritos que são rotulados parcialmente devido às polimerases que entram ou que saem de um estado pausado durante o de possam ser recuperados. Cepas que transproduzem mal, seja por causa da mutação ou condições de crescimento, produzir nsRNA pouco, embora as técnicas utilizadas aqui, no entanto, melhorar a recuperação de nsRNA em comparação com outros métodos. Os tempos mais longos e os volumes de cultura aumentados podem ser necessários nestas tensões e circunstâncias. Note-se que o uracil é uma boa fonte de nitrogênio e assim este método deve ser trialed antes de ser utilizado para estudos envolvendo a fome de nitrogênio.
O protocolo ers4tU é particularmente útil para análise de RNAs de curta duração, muitos dos quais são tão rapidamente degradados que não podem ser identificados sem prejudicar a maquinaria de degradação. Exemplos incluem transcrições crípticas instáveis (cortes)4, e transcrições curtas produzidas por terminação prematura ou promotor proximal pausando18 e transcrição antisense "upstream" de um promotor (PROMPTs)19. Os intermediários produzidos durante o processamento de espécies estáveis de RNA também são transitórios, mas podem ser enriquecidos usando ers4tU transcrição4. O protocolo ers4tU é conseqüentemente excepcional em permitir que as espécies altamente transientes do RNA sejam analisadas e capturadas circunstâncias physiological próximas, que é uma vantagem enorme sobre outros métodos. Esta técnica tem sido usada para estudar a transcrição e a cinética de processamento de RNA a jusante em mutantes de RNA polimerase que alongam mais rápido ou mais lento que o normal20.
A tiolação também é compatível com RNA-Seq e SLAM-Seq21, permitindo que todos os RNA produzidos dentro de uma janela de tempo muito curto para ser caracterizado em detalhes requintados.

O RNA tem uma natureza dinâmica; logo após ele é produzido muito RNA é rapidamente processado e degradado. Atualmente, a maioria de estudos do metabolismo do RNA analisam o RNA celular total, que é processado na maior parte inteiramente e no nível do estado estacionário. Este nível depende do equilíbrio entre as taxas de transcrição, maturação pós-transcricional e degradação. A análise dos processos que levam ao equilíbrio do estado estacionário requer técnicas especializadas para captar espécies de RNA de vida muito curta.
A rotulagem metabólica de RNA com análogos de nucleotídeo, como 4-thiouracil (4tU) ou 4-tiouridina (4sU) (ver Duffy et al.1 para uma excelente revisão), oferece a capacidade de isolar os RNAs nascentes rotulados por Thio e seus intermediários de processamento. No entanto, os protocolos publicados envolvem tempos de rotulagem de vários minutos2,3, queé lento em relação à taxa de produção de muitas transcrições. Toma na ordem de um minuto para transduir o gene médio do fermento, assim que etiquetar o RNA do fermento para menos de um minuto pode ser considerado extremamente curto. O protocolo de 4 tiouracila extremamente rápido e específico (ers4tU) maximiza a relação sinal/ruído maximizando a incorporação de 4tu e minimizando a recuperação de RNA não rotulado, pré-existente, tornando os tempos de rotulagem muito curtos possíveis4.
A base Thio-modificada deve ser importada nas pilhas ràpida e na quantidade suficiente para etiquetar eficientemente o RNA recentemente sintetizado (nsRNA). Para promovê-lo, as células são cultivadas em meio livre de uracilo e a expressão de uma Permease adequada ajuda a impulsionar a captação de 4tU ou 4sU (ver tabela 1 para uma lista de plasmíos que carregam genes de Permease adequados e complementar Figura 1). a solubilidade do 4o em hidróxido de sódio evita a necessidade de solventes orgânicos tóxicos exigidos por outros análogos de nucleotídeo. Infelizmente, culturas crescentes por longos períodos com nucleosídeos Thio-modificados em concentrações superiores a 50 μM têm sido observadas para interromper os ribossomas5. No entanto, a concentração (10 μM) utilizada aqui, e os tempos de rotulagem extremamente curtos, minimizam os efeitos deletérios5 (Figura 1a), enquanto ainda produzindo RNA suficiente para análise.
Esta técnica pode ser combinada com a depleção rápida e específica de uma proteína alvo, mediada por auxina6,7( Figura 2), referida como o protocolo "β-est Aid 4U", no qual o β-estradiol regulou a expressão da auxina o sistema induzível degron (Aid) é combinado com a rotulagem 4tu. Com a abordagem β-est AID 4U, uma proteína alvo pode ser esgotada e o efeito sobre o metabolismo do RNA é monitorado de perto (Figura 2). O timing é crítico; é aconselhável ver o vídeo que acompanha e prestar muita atenção à Figura 2 e sua forma animada (ver Figura complementar 2).
O processamento e a degradação do RNA devem ser parados extremamente ràpida para a definição exata do tempo. Isto é conseguido usando metanol em baixa temperatura, que corrige o conteúdo da célula muito rapidamente e degrada a membrana celular, preservando o teor de ácido nucleico8. A extração do RNA deve ser eficiente e não danificar o RNA. O lysis mecânico é eficaz na ausência de agentes agente (frequentemente estes contêm grupos do Thio, assim que deve ser evitado). A precipitação do cloreto de lítio do RNA é preferida, porque os tRNAs são precipitados menos eficientemente. tRNAs são transcritas rapidamente e naturalmente swcnts9, assim que removendo tRNAs reduz a competição para o reagente do biotinilação. Se os RNAs pequenos, altamente estruturados são do interesse, os métodos álcool-baseados da precipitação do RNA são recomendados.
Para recuperar o RNA swcnts, a biotina é unida covalentemente através dos grupos do Thio incorporados no RNA com 4tu. O uso de biotina modificada, que atribui através de uma ligação dissulfeto ligante (por exemplo, hpdp-biotina (N-[6-(biotinamido)hexyl]-3 ́-(2 ́-pyridyldithio)propionamide,) ou MTS-biotina (metano thiosulfonate)) recomenda-se como permite a liberação do RNA pela adição de um agente de diminuição. O RNA biotinylated é afinidade purified no estreptavidina acoplado aos grânulos magnéticos. Este protocolo é semelhante a outros listados anteriormente10 , mas foi intensivamente otimizado para reduzir o fundo.
Existem dois tipos de experimento de rotulagem de tiol que podem ser realizados, rotulagem contínua e descontínua. Cada um tem suas próprias vantagens. Na rotulagem contínua o 4tU é adicionado à cultura e amostras colhidas em intervalos regulares. Este tipo de experimento mostra como o RNA é processado e como os níveis mudam ao longo do tempo. Exemplos incluem comparação de mutantes com experimentos de tipo selvagem e um experimento de perseguição por impulsos. Os experimentos mostrados na Figura 3B, c são desse tipo. Para a rotulagem descontínua uma mudança é induzida no sistema e no RNA monitorado. Uma vez que a mudança foi induzida a cultura deve ser dividida em várias subculturas, e em momentos específicos, cada um é então Thio-rotulado por um breve período. Um exemplo é β-est AID 4U mostrado na Figura 27. Este tipo de experimento é particularmente útil para monitorar o efeito de uma alteração metabólica no processamento do RNA (ver Figura 3D).
Uma representação gráfica de um experimento de rotulagem de Thio é apresentada na Figura 4 e na Figura 5, e uma planilha que simplifica muito o desempenho do protocolo está disponível (consulte modelo de experimento 4tu. xlsx). Assim como este a informação suplementar contem um guia de Troubleshooting extensivo. Para o protocolo β-est AID 4U que integra a rotulagem 4tU com o protocolo de depleção de auxina, ver Figura 2 e Figura complementar 2. Ver Barrass et al.7 para o protocolo detalhado de DEPLEÇÃO de auxílios.

<table><tbody><tr><td>O &beta;-mercaptoetanol (&beta; ME)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td>CUIDADO tóxico. As soluções-mãe são de aproximadamente 14 M, fazer a 1/20 diluição para uso</td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25668</td><td>CUIDADO</td></tr><tr><td>pirocarbonato de dietila tóxico (DEPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>adicionar 1/1000 volume a uma solução, deixar em temperatura ambiente por 24 h, em seguida, autoclave</td></tr><tr><td>DMF (N,N-dimetilformamida)</td><td>&nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>227056</td><td>CUIDADO EDTA tóxico</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3609</td><td>Faça 0,5 M e pH para 8,0 com hidróxido de sódio</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>29221</td><td></td></tr><tr><td>EZ-link HPDP Biotina</td><td>Thermo scientific</td><td>21341</td><td>Armazene protegido da luz. Dissolver todo o conteúdo do frasco para injetáveis em 22,7 ml de DMF (para fazer uma solução de reserva de 4 mM). Armazene longe da água, no escuro e a -20 °C. Verifique a solução antes de usar, pois alguns lotes de HPDP precipitam no armazenamento; calor a 42 & C para ressuspender.</td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>G/0500/60</td><td></td></tr><tr><td>Glicogênio [20 mg/mL]</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10901393001</td><td>Armazenar a -20 &graus; C</td></tr><tr><td>Gel redutor de dissulfeto TCEP imobilizado</td><td>Thermo Scientific</td><td>77712</td><td>LiCl opcional</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793620</td><td>Solução de 10 M. CUIDADO: isso fica muito quente à medida que se dissolve e pode até ferver a mais de 100 oC, adicione os cristais de LiCl à água lentamente.</td></tr><tr><td>Solução de cloreto de magnésio (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63033</td><td>1 M. CUIDADO: isso fica muito quente à medida que se dissolve e pode até ferver a mais de 100 oC, adicione os cristais de MgCl2 à água lentamente.</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>M/4000/PC17</td><td>CUIDADO NaH</td></tr><tr><td>2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3139</td><td>Faça soluções de 1 M de cada um e misture em quantidade igual para obter uma solução com o pH apropriado</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-M</td><td>solução 5 M Fenol</td></tr><tr><td>, pH baixo.&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4682</td><td>Armazene no escuro a 4 graus Celsius. CUIDADO tóxico</td></tr><tr><td>Fenol Clorofórmio 5:1 (125:24:1) pH baixo.&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1944</td><td>Armazene no escuro a 4 graus C. CUIDADO tóxico</td></tr><tr><td>Perfurar Colunas de Rotação</td><td>Thermo Scientific</td><td>69702</td><td>Opcional</td></tr><tr><td>SCSM único drop-out - ura</td><td>Formedium&nbsp;</td><td></td><td></td>DSCS101</tr><tr><td>Acetato de Sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32318-M</td><td>Faça uma solução de 3 M e pH para 5.3 com ácido acético</td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795429</td><td>CUIDADO corrosivo</td></tr><tr><td>SDS (Dodecil sulfato de sódio)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>436143</td><td>CUIDADO irritante, não inale</td></tr><tr><td>Streptavidin Magnetic beads</td><td>NEB</td><td>1420S</td><td>Armazene em 4&deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>SUPERase-In, inibidor de RNase</td><td>Tecnologias de vida&nbsp;</td><td>AM2696</td><td>Loja a -20&deg; C</td></tr><tr><td>Tiolado Schizosaccharomyces pombe para espigão</td><td></td><td></td><td>Consulte a seção 1.7 do protocolo</td></tr><tr><td>4-tiouracil (4tU)&nbsp;</td><td>ACROS ORGANICS</td><td>359930010</td><td>Armazene no escuro. Faça estoque de 100 mM em 1M NaOH, armazene soluções a -20 graus C.&nbsp;</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93362</td><td>1 M soluções em vários</td></tr><tr><td>pH tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10109541001</td><td>5mg/ml, armazenar a -20&deg; C</td></tr><tr><td>Uridina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3750</td><td>Faça a solução 1 M em H2O. Divida em alíquotas de 2 mL e armazene a -20 C.</td></tr><tr><td>Base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos&nbsp; com sulfato de amônio</td><td>Para Colunas</td><td>de Médio CYN0410</td><td></td></tr><tr><td>Zeba 0.5ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>89882</td><td>Armazene a 4 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Contas de zircônia</td><td>Thistle Scientific</td><td>110791052</td><td></td></tr><tr><td>Equipamentos e consumíveis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beadbeater</td><td>Biospec</td><td>112011EUR</td><td>Outros homogeneizadores podem ser usados; as condições corretas para cada homogeneizador e cepa devem ser estabelecidas.</td></tr><tr><td>Bioanalisador (Agilent) ou similar para avaliar a qualidade do RNA. Se isso não for importante, um espectrofotômetro é útil para quantificar o RNA.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga: capaz de girar culturas a 4 &graus; C e pelo menos 3000 g. Pré-resfrie, se possível.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga: capaz de girar tubos de até 2 mL em velocidades variáveis de até 13.000 g e até 1000 g&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rack magnético para separar as contas da amostra. O usado no papel é impresso em 3D, disponível no Thingiverse (coisa:3562952). Existem racks disponíveis comercialmente&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Máquina de PCR com tampa aquecida que permitirá a incubação no escuro.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roda giratória para girar tubos de 1,5 mL de ponta a ponta&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Recomenda-se agitar o bloco de aquecimento (como o Eppendorf Thermomixer)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos, centrífuga, Baixa retenção, Livre de RNase 0.5mL</td><td>Eppendorf</td><td>H179467N</td><td></td></tr><tr><td>Tubos, centrífuga, Baixa retenção, Livre de RNase 1.5mL</td> Tubos <td>de AM12350</td><td></td><td>Ambion</td></tr><tr><td>, centrífuga, 50 mL&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.004</td><td>Outros tubos de centrífuga não são à prova de gás, permitindo que CO2 se dissolvam no metanol, isso sai da solução vigorosamente ao adicionar cultura quente, levando à perda de amostra</td></tr><tr><td>Tubos, centrífuga, 15 mL&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.001</td><td></td></tr><tr><td>Tubos, 2 mL, tampa de rosca</td><td>Tubos Greiner</td><td>723361</td><td></td></tr><tr><td>0.2 mL tira de 8 com tampas integrais</td><td>Marca</td><td>781332</td><td></td></tr></tbody></table>

rotulagem metabólica extremamente rápida e específica do rna in vivo com 4-thiouracil (ers4tu)

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU)

O análogo do nucleotide, 4-thiouracil (4tU), é tomado prontamente pelas pilhas e incorporado no RNA porque é transcrito in vivo, permitindo o isolamento do RNA produzido durante um breve período de rotulagem. Isto é feito anexando um metade do biotina ao grupo incorporado do Thio e à afinidade que purifying, usando grânulos revestidos estreptavidina. Conseguir um bom rendimento do RNA puro, recentemente sintetizado que é livre do RNA pre-existing faz uns tempos mais curtos da rotulagem possível e permite a definição temporal aumentada em estudos cinéticos. Este é um protocolo para a purificação muito específica, elevada do rendimento do RNA recentemente sintetizado. O protocolo aqui apresentado descreve como o RNA é extraído da levedura Saccharomyces cerevisiae. Entretanto, o protocolo para a purificação do RNA swcnts do RNA total deve ser eficaz usando o RNA de todo o organismo uma vez que estêve extraído das pilhas. O RNA purificado é adequado para análise por muitas técnicas amplamente utilizadas, tais como transcriptase reversa-qPCR, RNA-Seq e SLAM-Seq. A especificidade, a sensibilidade e a flexibilidade desta técnica permitem introspecções inigualáveis no metabolismo do RNA.

Os rendimentos típicos para o nsRNA recuperado usando este protocolo ers4tU são indicados na Figura 1b, este foi produzido por um Bioanalyzer e o traço mostra a produção do RNA contra o tamanho (nucleotides [NT]). Note, no traço do Bioanalyzer e no gráfico do Inset, que a recuperação do RNA do ponto de tempo 0 é uma parcela muito pequena daquela recuperada dos pontos mais longos do tempo-aproximadamente 0,3 μg do RNA recuperado de aproximadamente 109 pilhas comparado com o excesso duas vezes tanto apenas 30 s de rotulagem (0,8 μg de nsRNA) do mesmo número de células. A recuperação do RNA em 15 s é mais variável porque as diferenças pequenas em executar a amostragem têm um efeito proporcionalmente maior na recuperação do RNA. No traço do Bioanalyzer, os precursores do rRNA podem ser vistos como um pico perto de 1000 NT e um Doublet dos picos em 1700 − 1800 NT. A abundância desses intermediários aumenta à medida que a tiolação continua.
A rotulagem de Thio foi utilizada para quantificar a emenda do transcrito Act1 (Figura 3). A tiolação foi realizada e as amostras colhidas em intervalos de 15 s desde o início da rotulagem e o processamento do RNA Act1 monitorado (Figura 3a, b). Como pode ser visto, o pré-mRNA é gerado (por transcrição), e lariats (pelo primeiro passo de splicing de pré-mRNA), mesmo depois de apenas 15 s de rotulagem. Após aproximadamente 45 s a 1 minuto, as quantidades de lariats e pre-mRNA alcangam o equilíbrio com tanto quanto destas espécies do RNA que estão sendo criadas pela transcrição como são processadas afastado pela emenda.
Para produzir os dados mostrados na Figura 3C a cepa foi pulsada com 4tu para 25 s e, em seguida, perseguido com uridina. A geração de pré-mRNA e lariats atinge um máximo de 1 minuto. Isso se compara bem com a Figura 3B; o máximo que está sendo conseguido após 45 s para alcangar o equilíbrio mais os 25 s da rotulagem. Após o pico, os níveis de declínio como o Thio-rotulados RNAs são perseguidos através do processo de emenda.
A Figura 3D mostra a depleção de um fator de splicing protéico e seu efeito sobre o metabolismo do RNA, utilizando o sistema β-est Aid 4U6,7. Aqui, o Prp16p é reduzido de níveis fisiológicos próximos para 5% deste nível após 25 min de depleção. Prp16p é um fator de emenda essencial para a segunda etapa de emenda15. Os lariats são removidos durante a segunda etapa da emenda (Figura 3a), mas aqui aumentam acima do nível de pre-mRNA como Prp16 torna-se limitando. Em tempos de depleção posteriores, outros fatores tornam-se limitantes devido a efeitos secundários, de modo que os níveis de Lariat diminuem, e os níveis de pré-mRNA aumentam. O nível de mRNA emendados declina.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig1.jpg"> Figura 1: crescimento na recuperação de 4tU e RNA. (a) 4-tiouracil afecta o crescimento. O aumento da concentração de 4tU no meio de crescimento drop-out de YMM sem uracil aumenta o tempo de duplicação de S. cerevisiae (BY4741) carregando o plasmídeo p4FuiΔPEST. O crescimento de quatro culturas replicadas foi monitorado a 30 ° c em um Tecan Infinite pro 200. Todas as culturas estavam em fase de log por toda parte, com OD600 entre 0,1 e 0,6. Mock é uma cultura de controle com uma quantidade equivalente de NaOH adicionado, que não muda por si só a taxa de crescimento. Este gráfico demonstra que a rotulagem é um compromisso entre a rotulagem rápida e os danos à célula. As barras de erro são erro padrão de 4 repetições. b) a produção de nsrna aumenta linearmente de cerca de 15 s de rotulagem. A figura principal mostra os traços do bioanalisador de purificados, nsRNA de 0 (não tiolated) a 2 minutos após a adição de 4tU em intervalos de 15 s. Observe que a amostra de 15 s não é mostrada, pois era indistinguível da amostra não rotulada. Os dois grandes picos correspondem a RNAs ribossômicas (rRNAs). Os precursores e intermediários do rRNA são visíveis como vários picos em maior peso molecular do que rRNAs maduros. A recuperação desses precursores e intermediários aumenta com o tempo. Os resultados de um experimento representativo são mostrados. O gráfico Inset mostra a recuperação de nsRNA com o aumento da incubação com 4tU. O rendimento de nsRNA aumenta com o aumento do tempo de crescimento com 4tU. A recuperação é notavelmente linear (R2 = 0,934) ao longo da escala temporal deste experimento e mostra um ligeiro aumento sobre o fundo, mesmo a 15 s rotulagem com 4tu, embora não distinguível da amostra não rotulada por olho do bioanalisador Rastreamento. As barras de erro mostram erro padrão para três replicações biológicas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig2.jpg"> Figura 2: β-est Aid 4U β-est Aid 4U protocolo gráfico. Um resumo gráfico do protocolo do protocolo β-est AID 4U. β-estradiol (β-est) promove a expressão do sistema de auxina induzível degron (Aid) que por sua vez esgota um auxílio * Tagged proteína alvo, referem-se a Barrass et al.7 para um protocolo detalhado. Neste caso, a expressão do sistema degron é iniciada 25 min antes do início da degradação da proteína e a tiolação em cada ponto de tempo é de 1 min. as amostras são tomadas antes da indução e a cada 2 minutos durante a depleção. Uma versão animada aparece na Figura complementar 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig3v2.jpg"> Figura 3: precursores e intermediários de Act1 RNA splicing. A emenda de Act1 transcritos do pre-mRNA foi monitorada pela transcrição reversa quantitativa PCR16. Os níveis do precursor Act1 (pre-mRNA), o Lariat-exon2 intermediário (Lariat) e o produto Emenido (mRNA) são mostrados normalizados de encontro ao nível de Act1 exon2 e de níveis de estado estáveis destes RNAs. (a) localização de produtos qPCR na transcrição Act1. Esquemático dos locais dos produtos qPCR utilizados para o ensaio dos níveis de precursores, intermediários e produtos da reação de emenda das transcrições do Act1 16. Os exons são representados por caixas, Intron como uma linha e os produtos de qPCR como linhas com diamantes em uma ou outra extremidade, a cor combina aqueles usados nos gráficos. O pre-mRNA PCR é específico para pre-mRNA e não todos os intermediários da emenda porque este produto cruza o ponto do ramo que é interrompido após a primeira etapa do splicing. O PCR de Lariat detectará o produto da primeira etapa da emenda e do Lariat extirpado produzido após o segundo. O PCR de mRNA é específico para o produto da emenda, mRNA. Os resultados do PCR do exon (presente em todos os precursores, intermediários e produtos, exceto o Lariat extirpado) não são mostrados nos gráficos porque este foi usado para normalizar os dados e é conseqüentemente sempre igual a 1. (b) tiolabelling contínuo. A quantidade de pré-mRNA aumenta com o tempo como 4tU é incorporado pela transcrição e, após um curto atraso, splicing converte-lo para Lariat-exon2 produtos intermediários e emendados. Os níveis destas espécies de pré-mRNA e de Lariat são detectáveis acima do fundo após tão pouco quanto 15 s do crescimento com 4tu e alcangam um máximo após aproximadamente 45 s da rotulagem contínua com 4tu, em que ponto sua produção é balançada pela conversão ao emendados mRNA e/ou degradação. Os valores são normalizados para o seu estado estacionário (ponto mais à esquerda do gráfico), e exon 2 níveis para mostrar a sua aparência e processamento em comparação com a transcrição do exon 2. Como a emenda do RNA de Act1 é pela maior parte co-transcriptional4,17 o mRNA emendados torna-se ràpida a espécie a mais abundante, seu nível é similar àquele do exon 2. Erro padrão de três repetições biológicas, cada uma ensaiada em triplicado. (c) Pulse/Chase. Pulso de tiolação de 25 segundos seguido de perseguição com uridina. Comparado aos níveis de estado estacionário destas RNAs (esquerda-mais ponto), são inicialmente muito abundantes no pool recentemente sintetizado. Os níveis diminuem gradualmente à medida que são processados em mRNA (ou degradados), aproximando-se de níveis muito semelhantes aos níveis de estado estacionário por 5 min. erro padrão de três repetições biológicas, cada um analisado em triplicado. (d) nsrna e depleção de proteínas. A emenda de transcrições do pre-mRNA de Act1 monitorou pelo PCR quantitativo da transcrição reversa como no painel (a) em cima do esgotamento da proteína Prp16 usando o sistema do degron do auxina como descrito em Figura 2. Os níveis de proteína Prp16 também são exibidos no gráfico plotado contra o segundo eixo Y como porcentagem de níveis antes da depleção de auxina. Prp16 é um componente vital do spliceosome, particularmente importante para a segunda etapa da emenda mostrada no painel (a), depois do qual os lariats são degradados. Quando esta etapa se torna limitar lariats acumular inicialmente. Em pontos de tempo posteriores splicing falha completamente, lariats já não são produzidos e níveis de pré-mRNA subir. As barras de erro são erro padrão de três repetições biológicas, cada uma ensaiada em triplicado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig4.jpg"> Figura 4: Resumo gráfico das secções de protocolo 1 a 3. As células são tioladas com 4tU e podem crescer para incorporar o nucleotídeo modificado no RNA. Um pico de S. pombe swcnts pode ser adicionado para permitir a normalização através dos pontos e dos experimentos do tempo. O pulso de 4tU pode ser perseguido usando o uridine un-thiolated. A rotulagem pode ser executada continuamente da adição 4tU ou de uma mudança às condições de crescimento, a separação da cultura e 4tU adicionados às culturas em épocas crescentes da mudança da condição de crescimento, mas cada rotulagem somente por um tempo breve. As células são coletadas, e RNA preparados a partir das células, de preferência usando um homogeneizador e métodos baseados em fenol. O RNA é biotinylated e então o RNA biotinylated purificado da biotina região usando uma coluna da exclusão do tamanho. O nsRNA está agora pronto para a purificação com grânulos de estreptavidina (seção 4, Figura 5). Os números em vermelho correspondem aos números de etapa no protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59952/59952fig5.jpg"> Figura 5: Resumo gráfico da seção de protocolo 4. Na sequência das secções 1 a 3 (Figura 4), os grânulos de estreptavidina são bloqueados e a amostra de RNA biotinilado adicionada aos grânulos preparados. O RNA biotinylated liga-se aos grânulos do estreptavidina e ao RNA un-biotinylated removido e lavado. O RNA biotinylated é eluída dos grânulos usando βme e precipitado pronto para uma pesquisa mais adicional. Os números em vermelho correspondem aos números de etapa no protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/59952fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Figura complementar 1: melhoria da recuperação de nsRNA a partir de células de levedura com e sem cópias adicionais do importador a 1 e 3 minutos de rotulagem de Thio. Note que Fui1 é o próprio promotor do fermento expresso a partir de um plasmídeo de 2 μm. A cópia genomic deste gene está atual em ambas estas tensões. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/Figure_S1.ai">Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura complementar 2: versão animada do protocolo gráfico de ajuda 4U β-est Aid 4U de β-est. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/Figure_S2_Best-AID_4U.mp4">Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo complementar 1:4tU_experiment_template. xltx. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59952/4tU_experiment_template.xltx">Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.</a> 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Nome plasmídeo</td>
			<td>Importador/Permease</td>
			<td>Marcador</td>
			<td>Comentário</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>p4Fui</td>
			<td>
S. cerevisiae Fui1</td>
			<td>URA3</td>
			<td rowspan="2">Fui1 importações uracil e uridine, tornando-o ideal para pulso/perseguição experimentos.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>pAT2</td>
			<td>
S. cerevisiae Fui1</td>
			<td>LEU2</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>p4Fui-ΔPEST</td>
			<td>
S. cerevisiae Fui1</td>
			<td>URA3</td>
			<td>O motivo PEST de Fui1 foi desativado, de modo que a Permease não é degradada quando há uracil intracelular suficiente para as necessidades da célula. Funciona bem em experimentos de rotulagem e melhora o desempenho de pulso/perseguição.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>p4Fur</td>
			<td>
S. cerevisiae Fur4</td>
			<td>URA3</td>
			<td>Permease de uracil</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">YEpEBI311</td>
			<td>H. sapiens ENT1</td>
			<td rowspan="2">LEU2</td>
			<td rowspan="2">Miller et al.11. Igualmente contem um gene da quinase do timidina de HSV.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>(transportador de nucleosídeo equilibrativo)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Todos os plasmímids são 2 μm baseados. Todos os plasmíos e pAT P4 baseiam-se na série pRS16 de plasmís. FUI1 e FUR4 são expressos a partir de seus próprios promotores endógenos.</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Plasmís utilizados com este protocolo.

O uso do uracil swcnts a purificar sensitivamente e especificamente o RNA recentemente transcrito do fermento Saccharomyces cerevisiae.

Rotulagem metabólica extremamente rápida e específica do RNA in vivo com 4-Thiouracil (Ers4tU)

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of ...

Este método é significativo porque nenhum outro protocolo permite que o RNA recém-sintetizado seja analisado em uma escala de tempo tão curta, e permita experimentos de perseguição de pulso com um pulso tão curto. Este protocolo funciona bem com o esgotamento da proteína, como o protocolo Best AID 4U. A principal vantagem é que o fundo é baixo.Isso permite os curtos tempos de rotulagem, removendo quase todos os RNA não-tiolatados. O protocolo escrito também detalha muitos tipos diferentes de experimentos que poderiam ser realizados e como integrá-los a essa técnica. Para iniciar este procedimento, cresça levedura em médio YMM para um OD 600 entre 0,6 e 0,8.Em um capô de fumaça, adicione um metanol equivalente a 30 a 50% do volume amostral pretendido a um tubo de 50 mililitros. Feche os tubos firmemente, rotule-os e coloque-os em gelo seco para esfriar. Em seguida, rotule dois tubos mililitros para armazenamento a longo prazo das amostras e coloque no gelo para esfriar.Adicione contas de zircônia aos dois tubos mililitros. Esfrie pelo menos um mililitro de água por amostra no gelo. Se um pico de S.pombe for adicionado à cultura, coloque uma alíquota de células de S.pombe no gelo para descongelar.Vórtice o aliquot descongelado e adicioná-lo à cultura. Em seguida, adicione 4tU à cultura a uma concentração de 10 micromolares e misture vigorosamente. Rótulo de tio por um período de tempo entre 15 segundos e cinco minutos.Pegue amostras da cultura em intervalos regulares até o final do curso de tempo. Adicione cada amostra a um dos tubos de centrífuga preparados contendo metanol. Sele cada tubo, agite para misturar bem e coloque em gelo seco.Uma vez que todas as amostras tenham sido colhidas, coloque-as todas no gelo. Certifique-se de que nenhuma das amostras tenha congelado. Se algum tiver congelado, aqueça-os suavemente na mão enquanto inverte constantemente.Centrifugar as células a 3.000 vezes g e a quatro graus Celsius por dois minutos para pelotar as células. Despeje o líquido e resuspense a pelota em pelo menos um mililitro de água gelada, esbobinando vigorosamente para cima e para baixo. Transfira a suspensão para o tubo de tampa do parafuso preparado e coloque o tubo no gelo.Centrifugar as amostras brevemente a uma velocidade superior a 13.000 vezes g para re-pellet as células. Em seguida, colocá-los de volta no gelo, e remover o líquido. Primeiro, adicione 400 microliters de tampão AE, 40 microliters de SDS e 800 microliters de fenol a um pH baixo.Resuspend por vórtice por 10 segundos. Em seguida, lise as células em um homogeneizador por três dois minutos rajadas no ajuste de potência mais baixo. Deixe as amostras no gelo por dois minutos entre pulsos de homogeneização.Coloque as células lístidas em gelo seco por cinco minutos até solidificar. Em seguida, use um microcentrifuge para girar as células a uma velocidade superior a 13.000 vezes g por cinco minutos em temperatura ambiente. Após isso, realize extração de clorofórmio fenol e extração de clorofórmio conforme descrito no protocolo de texto.Adicione entre 1/3 a 1/2 do volume de 10 cloreto de lítio molar e misture para precipitar o RNA. Centrifugar a uma velocidade superior a 13.000 vezes por cinco minutos. Remova o fluido e gire brevemente a amostra para remover a escória.Em seguida, lave a pelota com 300 a 500 microliters de 70% de etanol. Centrifugar a pelota lavada brevemente, e remover qualquer etanol restante. Ressusurrea a pelota de RNA em 90 microlitadores de TE a um pH 7.0 aquecendo a 65 graus Celsius enquanto treme.Depois de verificar se há solubilização completa do RNA, transfira a suspensão para um tubo de 0,2 mililitro. Para começar, biotinilação adicionando 10 microlitadores de solução HPDP-biotina ao RNA e misture completamente. Incubar no escuro a 65 graus Celsius por 15 a 30 minutos.Em seguida, prepare uma pequena coluna de exclusão de volume de resina para excluir a biotina não incorporada. Remova a etiqueta inferior da coluna, solte a tampa e coloque a coluna em um tubo centrífuga de dois mililitros. Centrifugar a 1.500 vezes g por um minuto para limpar o buffer e descartar o fluxo..Em seguida, adicione suavemente 0,3 mililitros de TE na parte superior da coluna e gire novamente usando as mesmas condições. Transfira a coluna lavada para um tubo fresco de 1,5 mililitro. Quando a incubação da amostra estiver completa, adicione a amostra à parte superior da coluna.Centrifugar a 1.500 vezes g por dois minutos, deixando a amostra de RNA biotinilada na parte inferior do tubo. Descarte a coluna. E adicione 1/3 a 1/2 volume de 10 cloreto de lítio molar ao tubo que contém a amostra.Misture para re-precipitar o RNA. Primeiro, re-dissolver o RNA em 200 microliters de água tratada com DEPC. Meça a concentração de RNA e calcule os volumes de cada amostra que dará quantidades iguais de RNA para todas as amostras.Adicione essa quantidade de RNA a um tubo fresco e adicione água tratada com DEPC de volta a um volume total de 200 microliters. Quando uma amostra estiver em temperatura ambiente, adicione 25 microliters de 10 x tampão NaTM, 25 microliters de um fosfato de sódio molar e 2,5 microliters de 10% SDS. Misture bem e centrífugue suavemente a aproximadamente 100 vezes g por menos de 30 segundos.Prepare dois mililitros de tampão de contas para cada amostra com um tampão X NaTM, fosfato de sódio molar de 0,1 e SDS de 0,1%. Adicione 50 microliters de contas streptavidin a um tubo de baixa retenção de 1,5 mililitro. Coloque o tubo no rack magnético e espere as contas se instalarem.Em seguida, remova o fluido por aspiração. Para lavar as contas, adicione 200 mililitros de tampão de contas e vórtice até que a pelota de contas esteja totalmente resuspendida. Centrifugar o tubo a aproximadamente 100 vezes g por um máximo de cinco segundos.Coloque o tubo no rack magnético para permitir que as contas sejam capturadas pelo ímã. Remova o fluido por aspiração se houver um pequeno número de amostras. Despeje o fluido e depois aspire se houver muitas amostras.Bloco com 200 microliters de tampão de contas, 10 microliters de glicogênio e 2,5 microliters de tRNA. Incubar em temperatura ambiente por 20 minutos enquanto gira a ponta ao final a velocidade moderada. Depois disso, remova o fluido e lave novamente, conforme descrito no protocolo de texto.Resuspenda as contas da amostra e incubar à temperatura ambiente por 30 minutos durante a rotação. Durante esta incubação, prepare um tubo fresco de 1,5 mililitro para cada amostra. Adicione 1/10 de volume de três acetato de sódio molar no pH 5.3 e 20 microgramas de glicogênio.Centrifugar a aproximadamente 100 vezes g por três segundos. Remova o RNA desvinculado das contas e lave-os conforme descrito no protocolo de texto. Para elutar o RNA, adicione 50 microliters de 0,7 molar beta mercaptoetanol aos contas.Após o vórtice e a centrifugação, coloque o chorume no rack magnético. Pipeta a solução contendo RNA nos tubos de centrífuga preparado de 1,5 mililitro. Elute mais uma vez como descrito anteriormente.Em seguida, coloque a amostra de volta no rack magnético para remover contas residuais do RNA elucido e transfira o fluido para um tubo de centrífuga fresco e de baixa ligação de 0,5 mililitro. Misture a amostra. E então adicionar 2,5 volumes de etanol para precipitar nsRNA.Após a mistura e incubação, centrífuga a uma velocidade de pelo menos 13.000 vezes g e a quatro graus Celsius por 20 minutos. Os rendimentos típicos de snRNA recuperados usando este protocolo são mostrados aqui. Observe que a recuperação do RNA no ponto zero é uma parcela muito pequena daquela recuperada de pontos de tempo mais longos, com apenas 0,3 microgramas de RNA sendo recuperados de aproximadamente 30 bilhões de células.Após apenas 30 segundos de rotulagem, no entanto, mais do dobro do RNA é coletado do mesmo número de células. No traço bioanalílise, nossos precursores de RNA podem ser vistos como um pico perto de 1.000 nucleotídeos e um duplo de picos em 1.700 a 1.800 nucleotídeos. A abundância desses intermediários aumenta à medida que a tiaolação continua.A thiolação é então realizada com amostras sendo colhidas em intervalos de 15 segundos desde o início da rotulagem de thio e o processamento da transcrição RNA ACT1 é monitorado. Como pode ser visto, pré-mRNA e lariats são gerados mesmo após apenas 15 segundos de rotulagem. Após cerca de 45 segundos a um minuto, a quantidade de lariats e pré-mRNA atinge o equilíbrio com o máximo dessas espécies de RNA sendo criadas por transcrição como são processadas por emenda.Os passos mais difíceis são aqueles que envolvem as contas, lavando e bloqueando. Tenha cuidado para não perder as contas, ou deixá-las secar. Uma vez que você tenha purificado o RNA recém-sintetizado, você pode usar qualquer procedimento tradicional de análise de RNA.Recomenda-se que você execute o RNA em um bioanalzer ou similar. Depois disso, normalmente usamos QPCR e RNA-Seq para analisar o RNA. Este método mostrou-se ideal para analisar a cinética do processamento de RNA.Os passos mais perigosos são aqueles que usam fenol e clorofórmio na extração de RNA. Toda vez que você usar esses produtos químicos em um recipiente não selado, faça isso em um capuz de fumaça, e use roupas de proteção apropriadas, um jaleco e luvas. Tome cuidado especial para que não haja contas de zircônia na rosca do tubo da tampa do parafuso, pois isso levará a um vazamento.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Transcrições RNA estão sujeitos à regulamentação posttranscriptional extensa que é mediada por uma multidão de proteínas RNA-binding trans-acting (RBPs). Aqui apresentamos um método generalizado para identificar com precisão e em escala transcriptoma-wide os sites ligação do RNA RBPs.

PAR-Clip - um método para identificar em toda a Transcriptoma Sítios de Ligação de Proteínas RNA Binding

RNA celular total fornece um modelo pobre para estudar mudanças de curto prazo na síntese de RNA e decadência, bem como a cinética de processamento de RNA. Aqui, descrevemos a marcação metabólica de RNA recentemente transcrito com 4-tiouridina seguido por biotinilação específica do tiol e a purificação do ARN recém transcritos que permitam ultrapassar estas limitações.

Marcação metabólica de RNA recém-transcrita para alta resolução Gene Expression Profiling de síntese de RNA, Processamento e Decay em cultura de células

Este protocolo descreve a utilização combinatória de ChIP-seq, seq-4sU, RNA total-seq e Ribossoma profiling para linhas de células e as células primárias. Permite rastreamento de alterações em fator de transcrição vinculativas, novo de transcrição, processamento de RNA, volume de negócios e tradução ao longo do tempo e exibindo o curso geral dos acontecimentos nas células ativadas e/ou rápida mudança.

Análise em tempo real do fator de transcrição, ligação, transcrição, tradução e volume de negócios para exibir eventos globais durante a ativação celular

Nós descrevemos uma plataforma de análise de RNA de transferência original chamada SPOt (plataforma simplificada para observar o tRNA). Local simultaneamente mede níveis celulares de todos os tRNAs em amostras biológicas, em apenas três passos e em menos de 24 horas.

Etiquetando metabólica e caracterização das RNAs de transferência usando Macroarrays

Esse método pode ser usado para medir a síntese do RNA. 5-Bromouridine é adicionado às células e incorporado na RNA sintetizado. Síntese de RNA é medido pela extração do RNA imediatamente depois da rotulagem, seguido de 5-Bromouridine-alvo da imunoprecipitação de rotulados RNA e análise por transcrição reversa e reação em cadeia da polimerase quantitativa.

Investigação da síntese do RNA usando 5-Bromouridine rotulagem e imunoprecipitação

O protocolo descrito aqui baseia-se a quantificação de todo o genoma de mRNA recentemente sintetizadas purificada de células de levedura rotuladas com 4-thiouracil. Este método permite medir a síntese de mRNA desacoplada do decaimento do mRNA e, portanto, fornece uma medição precisa da transcrição do RNA polimerase II.

Saccharomyces cerevisiae Metabólica de rotulagem com 4-thiouracil e a quantificação dos recém sintetizado mRNA como um Proxy para a RNA polimerase II atividade

Este artigo descreve a marcação de duas cores de RNAs longos em posições de terminais e sua imobilização de superfície via encapsulamento em vesículas fosfolipídicas para aplicações de microscopia FRET TIRF de molécula única. A combinação dessas técnicas permite a visualização e análise precisas da dinâmica do RNA no nível de uma única molécula.

Marcação final fluorescente e encapsulamento de RNAs longos para microscopia FRET-TIRF de molécula única

Este protocolo descreve a quantificação rápida e altamente sensível dos dados do sensor Förster transferência de energia de ressonância (FRET), usando um analisador de FRET portáteis feitos sob medida. O dispositivo foi utilizado para detectar a maltose dentro de uma gama de temperatura crítica que maximiza a sensibilidade de detecção, permitindo a avaliação prática e eficiente do teor de açúcar.

Altamente sensível e rápido de detecção de fluorescência com um portátil FRET Analyzer

A adsorção de peptídeos em plásticos durante diluições seriais tradicionais baseadas em ponteiras pode afetar significativamente a determinação da potência e confundir a compreensão das relações estrutura-atividade usadas para identificação de chumbo e fases de otimização de chumbo da descoberta de medicamentos. Aqui são descritos métodos para diluição serial acústica automatizada sem contato de amostras de peptídeos.

Automated acústico de distribuição para a diluição de série do Peptide agonistas em potência Determinação Ensaios

Descreveremos um protocolo para identificar proteínas RNA-obrigatórias e mapear suas regiões de ligação de RNA em células vivas, usando photocrosslinking UV-mediada e espectrometria de massa.

Preparação da amostra para identificação de espectrometria de massa-baseada das regiões de ligação de RNA

Aprenda a rotulagem metabólica ultrarrápida de RNA in vivo com 4-tiouracil em Saccharomyces cerevisiae. Este método permite purificar RNA recém-sintetizado com baixo ruído de fundo para experimentos de pulso-perseguição.

Rotulagem metabólica extremamente rápida e específica do RNA in vivo com 4-Thiouracil (Ers4tU)

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