Extração de cortisol de matrizes de Sturgeon Fin e Jawbone
10 de setembro de 2019
Neste estudo, apresentamos um protocolo de extração de cortisol da barbatana e mandíbula de espécies de esturjão. Os níveis do cortisol da aleta e do Jawbone foram examinados mais adicional comparando dois solventes de lavagem seguidos por ensaios de ELISA. Este estudo pilotou a viabilidade do cortisol do Jawbone como um indicador novo do esforço.
Nosso método introduz um novo indicador alternativo de estresse que pode ser uma plataforma para inúmeros estudos futuros para medir o cortisol em novas matrizes não parcelas e cabelos. As vantagens dessa técnica são sua simplicidade e sua capacidade de ser usado para avaliar os níveis de estresse mesmo em animais abatidos. Estabelecer uma relação entre altos níveis de cortisol e animais saudáveis ou humanos usando essa técnica pode ajudar no diagnóstico de algumas doenças.
Este método também pode ser usado para estudar amostras biológicas centenários, como esses fósseis antigos, para avaliar os níveis de estresse dentro da vida útil da amostra. Para extração de cortisol, pese 300 mais ou menos 10 miligramas de cada amostra em uma escala analítica digital com uma precisão de 0,0001 antes de colocar as amostras em tubos cônicos individuais de 15 mililitros. Adicione três mililitros de isopropanol a cada tubo de amostra e gire os tubos a 80 rotações por minuto durante 2,5 minutos para lavar o cortisol e remover qualquer contaminação externa potencial.
Após a última lavagem, o ar seque as amostras à temperatura ambiente por sete dias antes de lavar as amostras mais três vezes, como demonstrado usando água ultra pura fresca para cada lavagem. Pese 75 mais ou menos cinco miligramas de barbatana seca ou amostra de mandíbula e use um batedor de contas para finalmente moer a amostra a 50 hertz por 32 minutos. Em seguida, entregue 1,5 mililitros de metanol em cada tubo de barbatana em pó ou mandíbula e coloque as amostras em um rotador de tubo a 40 rotações por minuto durante 18 horas em temperatura ambiente.
Após a extração de cortisol, sedimente os tecidos amostrais por centrifugação. E transfira o mililitro superior do cortisol orgânico amarelado contendo camada de cada amostra em tubos microcentrífugas individuais de 1,5 mililitro. Seque as amostras de cortisol a 38 graus Celsius em um capô de fumaça durante a noite para evaporar o metanol.
Na manhã seguinte, adicione 400 microliters de PBS a cada tubo e vórtice e centrífugue as amostras para coletar o cortisol. Para análise ELISA, carregue 25 microlitadores de cada amostra padrão de cortisol extraído e controle em duplicação nos poços apropriados de uma placa ELISA de 96 poços. Carregue 25 microlitres de ensaio diluído em dois poços para servir como zero e em cada poço de ligação não específico.
Misture 15 microlitadores de enzima conjugados com 24 mililitros de diluente assay e adicione 200 microliters de conjugado a cada poço. Misture a placa em um rotador por cinco minutos a 500 rotações por minuto. Seguido de uma incubação de uma hora em temperatura ambiente.
No final da incubação, lave a placa quatro vezes com 300 microliters de 1x Wash Buffer por poço. Invertendo rapidamente a placa sobre a pia após cada lavagem para descartar o tampão e manchando a placa em uma pilha de toalhas de papel. Após a última lavagem, adicione 200 microliters de solução de substrato TMB a cada poço e coloque a placa no rotador por cinco minutos a 500 rotações por minuto.
Após a mistura, incubar a placa por 25 minutos à temperatura ambiente protegida da luz. No final da incubação, adicione 50 microliters de solução stop a cada poço. E misture o conteúdo da placa no rotador por três minutos a 500 rotações por minuto ou até que todos os poços tenham virado de verde para amarelo.
Em seguida, leia a densidade óptica das amostras e use o software de microplacão para converter os níveis de cortisol em cada amostra em picogramas por miligrama. Nesta análise representativa, os níveis de cortisol tendem a ser mais elevados em amostras de barbatana lavadas com isopropanol do que nas lavadas com água, mas não foram observadas diferenças significativas nos níveis de cortisol na barbatana entre as espécies de esturjão. Não houve interação significativa entre solventes de lavagem e espécies de esturjão.
O exame de cortisol das mandíbulas de H.Huso para determinar se as mandíbulas de esturjão poderiam ser usadas como uma matriz alternativa às barbatanas revelou que o solvente de lavagem não teve nenhum efeito significativo no nível de cortisol medido no esturjão de H.Huso. Além disso, os dados revelaram uma alta semelhança entre as barbatanas de três espécies de esturjão testadas e em mandíbulas H.Huso. É importante usar o batedor de contas para moer as amostras em pó fino e usar um kit comercial de ensaio elisa adequado para uma medição bem sucedida de cortisol.
Este método também pode ser usado para detectar cortisol em dentes e outras matrizes duras, pois as medidas de nível de cortisol fornecem informações importantes sobre como o ambiente afeta a biologia animal. O método poderia ser usado como uma nova abordagem para avaliar os níveis de cortisol nos dentes de leite de crianças humanas e em endocrinologia pediátrica, psico biologia, estudos comportamentais, arqueológicos e forenses.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo para extração de cortisol da nadadeira e do osso da mandíbula de espécies de esturjão, examinando a eficácia de dois solventes de lavagem seguidos por ensaios de ELISA. A pesquisa destaca o potencial do cortisol do osso da mandíbula como um novo indicador de estresse.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia
Contexto
- O cortisol é um hormônio esteroide essencial relacionado ao estresse.
- Métodos tradicionais de medição do cortisol podem ser invasivos.
- Explorar matrizes alternativas para a medição do cortisol é fundamental.
- O cortisol presente no osso da mandíbula não foi amplamente estudado como indicador de estresse.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo para extração de cortisol de nadadeira e mandíbula de esturjão.
- Avaliar a viabilidade do cortisol da mandíbula como indicador de estresse.
- Comparar a eficácia de diferentes solventes de lavagem na extração de cortisol.
Métodos Utilizados
- Foram coletadas amostras de nadadeira e mandíbula de espécies de esturjão.
- A extração de cortisol envolveu o pesamento das amostras e o uso de isopropanol como solvente de lavagem.
- Ensaios de ELISA foram realizados para medir os níveis de cortisol.
- Foi realizada uma análise comparativa dos solventes de lavagem.
Resultados Principais
- Os níveis de cortisol em ossos da mandíbula foram extraídos e medidos com sucesso.
- Diferentes solventes de lavagem apresentaram eficácia variável na extração de cortisol.
- O estudo reforça o potencial do cortisol do osso da mandíbula como indicador de estresse.
- Este método poderá facilitar pesquisas futuras sobre estresse em diversas amostras biológicas.
Conclusões
- O protocolo desenvolvido é um método simples e eficaz para extração de cortisol.
- O cortisol do osso da mandíbula pode servir como um indicador confiável de estresse na pesquisa.
- Essa técnica abre caminhos para o estudo do estresse em amostras biológicas contemporâneas e antigas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este estudo estabelece um protocolo não invasivo de extração de cortisol a partir de matrizes de nadadeira e osso maxilar de esturjão, oferecendo um novo indicador de estresse para pesquisas pré-clínicas e translacionais. O método permite a avaliação de biomarcadores de estresse em amostras arquivadas e de animais abatidos, apoiando estudos longitudinais e entre espécies. Sua simplicidade e adaptabilidade a tecidos duros conferem valor estratégico para a redução de riscos na validação de alvos em pipelines de descoberta neuroendócrina e comportamental.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de vias de resposta ao estresse por meio do cortisol como biomarcador funcional em modelos de vertebrados.
- Valor Operacional: Fornece um fluxo de trabalho reprodutível de extração para tecidos de nadadeira e osso da mandíbula utilizando lavagens com solventes padronizados e homogeneização baseada em esferas.
- Valor Preditivo: Apoia a redução de riscos em alvos ao correlacionar níveis de cortisol com estados fenotípicos de estresse em modelos pré-clínicos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera resultados quantitativos de cortisol por meio de ELISA, compatíveis com triagem em alta escala de moduladores ambientais ou genéticos.
- Valor Operacional: Demonstra baixa variabilidade intra- e interensaio (CV de 14,15% e 7,70%), garantindo confiabilidade do ensaio em campanhas de triagem de compostos.
- Escalabilidade: Utiliza massa mínima de amostra (300 ± 10 mg) e equipamentos de laboratório padrão, permitindo adaptação a formatos de múltiplas poças.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: O cortisol presente no osso maxilar mostra potencial como biomarcador cruzado entre matrizes, permitindo a correlação entre respostas ao estresse em tecidos da nadadeira e tecidos esqueléticos.
- Relevância para Modelos Pré-clínicos: Aplicável a modelos de peixe-zebra, roedores e outros vertebrados nos quais matrizes da nadadeira ou do osso craniano sejam acessíveis.
- Utilidade em Amostras Arquivadas: Permite a análise de biomarcadores de estresse em amostras históricas ou fossilizadas, apoiando estudos de toxicologia evolutiva e do desenvolvimento.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere na continuidade de descoberta a pré-clínica ao fornecer uma leitura de biomarcador de estresse que informa o engajamento do alvo e os resultados de triagem fenotípica.
- Biologia da Descoberta: Facilita a verificação de hipóteses sobre alvos neuroendócrinos mediante a quantificação do cortisol como efeito downstream da modulação do eixo HPA.
- Triagem: Fornece medições de cortisol compatíveis com ELISA, permitindo análise de resposta à dose em bibliotecas de compostos.
- Análises: Fornece concentrações de cortisol (pg/mg) adequadas para comparação estatística entre grupos experimentais usando modelos lineares generalizados (GLM) ou modelos semelhantes.
- Pesquisa Translacional: Apoia a continuidade do biomarcador desde espécimes de descoberta até tecidos pré-clínicos por meio de validação cruzada em matriz de nadadeira e mandíbula.
- Reutilização Corporativa: O protocolo exige poucos reagentes e equipamentos, permitindo padronização entre diferentes locais para programas de biomarcadores envolvendo múltiplos estudos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos relacionados ao estresse ao fornecer medição direta de hormônios.
- Valor Operacional: Utiliza solventes acessíveis (água, isopropanol, metanol) e equipamentos laboratoriais padrão (centrífuga, agitador rotativo, leitor de ELISA).
- Valor Estratégico: Permite decisões mais precoces de avançar ou interromper o desenvolvimento, identificando fenótipos de estresse ligados ao alvo antes dos ensaios funcionais.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de alvos com modulação comprovada da resposta ao cortisol in vivo.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em homogeneização de tecidos, extração com solventes e execução de ensaio ELISA.
- Depende do acesso a centrífuga, rotador de tubos, batedor de esferas e leitor de microplacas com controle de temperatura.
- Necessita padronização da escolha do solvente de lavagem e da duração da secagem entre laboratórios para comparabilidade entre estudos.
- A adaptação a outras espécies ou tecidos pode exigir otimização da massa da amostra e do tempo de extração.
- Limitado pela especificidade do anticorpo ELISA e pelos possíveis efeitos de matriz em amostras altamente mineralizadas, como o osso da mandíbula.
