Um ensaio robusto baseado em reação em cadeia da polimerase para quantificar repetições de trinucleotídeo de citosina-guanina-guanina em X frágil retardo mental-1 gene

Este método econômico pode encontrar amplas aplicações no diagnóstico molecular e triagem de fxs e distúrbios frágeis relacionados ao X. É rápido em tempo de reviravolta e menos investimento em equipamentos. Nosso ensaio baseado em PCR pode facilitar a classificação de espectro completo dos transtornos associados ao FXS e frágeis x, incluindo intermediário, premutação e mutação completa com robustez e tempo de relatório rápido.

O procedimento será demonstrado por Weng Chua da PerkinElmer Singapura. Comece removendo a mistura de tampão PCR, diluente de amostra e amostras de DNA do congelador Celsius de 20 graus, e deixando-as em temperatura ambiente por 20 a 30 minutos para descongelar. Antes de usar os reagentes, vórtice e rapidamente gire-os para baixo.

Meça a concentração da amostra de DNA com um espectotômetro e, se necessário, dilua-a a 25 nanogramas por microlitera com diluente amostral. Rotule os poços de uma placa PCR para identificar amostras de DNA de referência e testadas e calcular o número de reações necessárias para as amostras de teste, referência e controle negativo. Prepare o mix mestre pcr combinando 15 microliters de mistura tampão PCR a 0,6 microliters de diluentes de amostra e 0,4 microliters de polimerase para cada reação.

Vórtice a mistura e girar para baixo. Em seguida, distribua 18 microliters da mistura em cada poço. Em seguida, pipeta dois microliters de cada DNA no poço apropriado.

Misture os reagentes por pipetting para cima e para baixo cinco vezes, em seguida, selar a placa. Coloque a placa no termociclador e execute o PCR de acordo com as instruções do manuscrito. Pré-aqueça o agitador da incubadora a 65 graus Celsius e adicione 80 microliters de tampão 1X TE a cada produto PCR.

Use uma pipeta multicanal para transferir as amostras para uma placa de limpeza PCR e coloque a placa no agitador. Incuba-o a 65 graus Celsius enquanto treme a 1200 RPM por 10 minutos. Após a incubação, esfrie o agitador da incubadora até 25 graus Celsius, defina o instrumento de vácuo em 250 milibares e aspire a solução através do filtro.

Após 15 minutos, os poços não devem ter líquido restante. Desligue o vácuo e adicione 50 microliters de tampão 1X TE a cada poço. Aspire a solução por 10 minutos usando as configurações de vácuo anteriores.

Seque a parte inferior da placa do filtro pressionando-a firmemente sobre uma pilha de toalhas de papel e, em seguida, adicione 20 microliters de tampão 1X TE ao centro inferior de cada poço. Coloque a placa no shaker e incubar a 25 graus Celsius enquanto treme a 1200 RPM por cinco minutos. Após a incubação, transfira pelo menos 15 microliters do produto PCR purificado para uma placa PCR fresca de 96 poços.

Antes de começar, traga o concentrado de corante de DNA, matriz de gel de DNA, marcador de DNA, escada de DNA e amostras de DNA purificadas à temperatura ambiente. Configure a estação de escoramento substituindo a seringa e ajustando a placa base, em seguida, solte a alavanca do clipe da seringa e deslize-a para a posição superior. Inicie o software de dimensionamento e prepare a mistura de corante de gel.

Vórtice o concentrado de corante por 10 segundos, em seguida, gire-o para baixo. Em seguida, adicione 25 microliters do corante a um frasco de matriz de gel e vórtice a solução a misturar. Transfira a mistura de corante de gel para um filtro de giro, coloque-a na centrífuga e gire-a por 10 minutos a 1500 vezes g.

Quando estiver pronto para carregar a mistura de corante de gel, insira um novo chip de DNA na estação de escoramento e adicione nove microliters da mistura de corante de gel no poço que está marcado com G.Feche a estação de escoramento e certifique-se de que o êmbolo esteja posicionado na marca de um mililitro. Pressione o êmbolo da seringa para baixo até que seja segurado pelo clipe. Aguarde exatamente 30 segundos e solte o clipe.

Espere mais cinco segundos e, em seguida, puxe lentamente o êmbolo de volta para a posição de um mililitro. Abra a estação de escoramento e adicione nove microliters de corante de gel nos poços marcados com G.Adicione cinco microliters de marcador no poço marcado com um símbolo de escada e cada um dos 12 poços de amostra. Adicione um microliter da escada ao poço com o símbolo da escada e um microliter do produto PCR ou água aos poços de amostra.

Vórtice o chip por um minuto a 2400 RPM. Insira-o no bioanalzer e execute o chip dentro de cinco minutos. Quando a execução estiver concluída, exporte os dados de pico como arquivos de tabela csv.

Uma amostra feminina de pré-mutação e uma amostra feminina de mutação completa são usadas como amostras de referência. Um pico de marcador superior e inferior está incluído no perfil de tamanho do fragmento, e geralmente há um pico complexo de primer em cerca de 95 pares de base. Estas amostras de referência são usadas para construir uma curva padrão de regressão.

A curva padrão de regressão linear é então usada para calcular tamanhos repetidos de amostras desconhecidas. Amostras clínicas normais, intermediárias, de pré-mutação, de mutação completa e de mutação completa de mosaico podem ser corretamente classificadas com este método. Em alguns casos, apenas um pico é exibido nos resultados de eletroforese microfluida, o que é provavelmente devido à presença de alelos homozigos normais.

Um tipo de resultado subótimo é o viés de linha de base, que pode ser ambíguo ou desinterpretável, e é suspeito de ser causado por mau funcionamento do instrumento. Ao tentar este procedimento, é importante garantir a quantidade adequada de DNA e qualidade antes de iniciar o protocolo. O sequenciamento genético FMR1 pode ser realizado para identificar o padrão de interrupção AGG.

E a enzima de restrição sensível à metilação ou o ensaio de modificação de bisulfeto podem ser usados para monitorar o estado de metilação. Esta é uma técnica rápida, robusta e econômica. Ajudará outros pesquisadores na realização de um estudo de base populacional sobre o status portador de TRANSTORNOS ASSOCIADOS ao FXS e Frágeis X.