Name: Isolamento, Transfecção e Cultura dos Monócitos Humanos Primários (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Aprenda a isolar, cultivar e transfectar monócitos humanos primários para estudar funções imunes em indivíduos infectados pelo HIV. Este protocolo otimizado permite investigar mecanismos moleculares de disfunção imunológica.

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Os autores gostariam de agradecer ao Núcleo biorepositório clínico/tumoral do HIV por fornecer amostras de pacientes e o Núcleo de Metabolismo de Imunologia Celular por fornecer análise de citometria de fluxo. Este projeto foi financiado pelo NIH P20GM121288e e P30GM114732.

Todos os métodos descritos abaixo foram aprovados pelo Louisiana State University Health Sciences Center New Orleans Institutional Review Board. Todo o sangue foi coletado após a obtenção de consentimento informado.
NOTA: Todo o procedimento é realizado em condições estéreis em uma instalação de nível 2 de biossegurança (BSL2) para que o cuidado seja usado para lidar com materiais biológicos. Em particular, cada etapa é realizada usando técnicas estéreis um armário de biossegurança. Após cada etapa envolvendo sangue, produtos sanguíneos, células ou tubulação de produtos celulares, é importante enxaguar todo o material plástico (ou seja, pipetas sorológicas, pontas de pipetas e tubos) com 10% de lixívia de um recipiente de resíduos dentro do capô antes do descarte adequado.
1. Isolamento de monócitos humanos primários por seleção negativa imunomagnética
<ol><li>Colete 40 mL de sangue integral humano fresco (de um HIV+ paciente ou controle saudável) em quatro tubos de vácuo etilediaminatetraáticos (EDTA) de 10 mL( 10 mL de sangue por tubo). Usando técnicas estéreis um armário de biossegurança, transfira todos os 40 mL do sangue em um tubo cônico do propileno de 50 mL.</li>
	<li>Seguindo o protocolo do fabricante para o kit de isolamento monócito humano selecionado(Mesa de Materiais),adicione 2 mL de coquetel de isolamento monócito, fornecido no kit, ao tubo de sangue. Vortex contas magnéticas, também fornecido no kit, para 30 s, e adicionar 2 mL para o tubo de sangue.<ol>
<li>Se menos de 40 mL de sangue estiver disponível, reduza os reagentes adicionados. Para misturar a solução, pipeta para cima e para baixo com uma pipeta sorológica de plástico 25 mL e incubar por 5 min à temperatura ambiente (RT).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Separe a mistura de sangue igualmente em quatro tubos de 50 mL e adicione 30 mL de soline estéril tampão de fosfato (PBS) contendo 1 mM EDTA para cada tubo. Misture por pipetting cima e para baixo com uma pipeta sorológica de plástico 25 mL.</li>
	<li>Coloque os tubos em suportes de ímã por 10 min para remover as contas magnéticas conjugadas com anticorpos. Use quatro suportes do ímã simultaneamente, um para cada tubo, para permitir tempos consistentes da incubação e da isolação para cada amostra de sangue.</li>
	<li>Elabore o conteúdo do centro de cada tubo, usando uma pipeta, enquanto eles ainda estão nos suportes do ímã. Tenha cuidado para não elaborar glóbulos vermelhos (não mais do que 10% do volume inicial de 10 mL), e coloque o conteúdo em um dos quatro novos tubos de 50 mL.</li>
	<li>Adicione 500 μL de contas magnéticas vórticeas a cada tubo de 50 mL. Pipeta para cima e para baixo com uma pipeta de 25 mL e incubar em RT para 5 min. Em seguida, coloque os tubos em suportes de ímã por 5 min.</li>
	<li>Transfira cuidadosamente o conteúdo do centro de cada tubo enquanto ainda está em suportes de ímã para um dos quatro novos tubos de 50 mL. Coloque diretamente cada novo tubo de 50 mL nos suportes de ímã por 5 min.</li>
	<li>Transfira cuidadosamente o conteúdo do centro de cada tubo para um dos quatro novos tubos de 50 mL. Gire todos os novos tubos de 50 mL a 300 x g por 5 minutos. Aspirar o supernatant e resuspender todas as quatro pelotas celulares em um total de 10 mL de PBS estéril.</li>
	<li>Conte as células por exclusão azul trypan usando um hemocytometer. NOTA: 8-20 x 106 células são geralmente obtidas a partir de 40 mL de sangue inteiro.</li>
</ol>2. Culturing de monócitos humanos primários
<ol><li>Usando um banho de água 37 °C, a mídia RPMI 1640 sem soro quente complementada com 1% penicilina-estreptomicina (caneta/estreptococo), e (continuando a usar técnicas estéreis um armário de biossegurança) resuspende os monócitos isolados nesta mídia a uma concentração de 1 x 106 células/mL.</li>
	<li>Adicione 1 mL de células resuspensas a cada poço de uma placa de 6 poços ou em um prato de 35 mm (o número final de células deve ser 1 x 106 células/placa), e coloque em uma incubadora de 37 °C com 5% de CO2. Espere 0,5-1,0 h para as células a aderir.</li>
	<li>Usando um banho de água 37 °C, calor quente inativado (HI) soro fetal bovino (FBS). Adicione 100 μL (10% de concentração final) da FBS a cada placa. Adicionar fatores de crescimento para as células para promover a diferenciação de macrófagos.<ol>
<li>Macrófagos prime para um fenótipo m1-like, adicionando 25 ng /mL de granulocito-macrófago colônia de estímulo fator (GM-CSF) para a mídia. Macrófagos prime para um fenótipo m2-like, adicionando 50 ng /mL de macrófago colônia de estímulo fator (M-CSF) para a mídia28. NOTA: Tanto gm-CSF e M-CSF permitir diferenciação monócito para um fenótipo de macrófago geral (M0), enquanto as células priming para M1 ou M2, respectivamente7,28,30.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Transfecting monocytes humanos preliminares na cultura
<ol><li>Monócitos transfect com miRNA imita ou inibidores ou siRNA usando um kit contendo um reagente de transfecção à base de polímero(Mesa de Materiais).<ol>
<li>Seguindo o protocolo do fabricante para o kit de transfecção (e continuando o uso de técnicas estéreis um armário de biossegurança), diluir pela primeira vez os imitadores/inibidores de miRNA selecionados ou siRNAs no buffer para uma concentração final de 1,83 μM. Prepare 10 μL de mi-inibidor diluído por transfecção de 1 x 106 células.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare o reagente de transfecção adicionando 1 μL do polímero fornecido a um tubo de microcentrífuga fresco de 1,5 mL, seguido imediatamente adicionando 90 μL de buffer fornecido (para um total de 91 μL de reagente por transfecção). Vórtice por 3-5 s.</li>
	<li>Pipette 90 μL de solução de transfecção no tubo contendo 10 μL de miRNA diluído mimic/inibidor ou siRNA. Misture por pipetting suave e incubar por 15 min em RT.</li>
	<li>Adicione 100 μL de complexo de transfecção a um poço (ou prato) de 1 x 106 monócitos banhados. As células incubadas por 4 h a 37 °C, em seguida, substituir o meio com 3 mL de mídia completa (RPMI 1640 complementado com 1% penicilina-estreptomicina e 10% fbs inativado de calor) contendo GM-CSF ou M-CSF.</li>
</ol>4. M1/M2 diferenciação e ativação
<ol><li>Os monócitos começam imediatamente a diferenciar-se aos macrófagos M0 largos em cima do revestimento na cultura. No terceiro dia após o revestimento, continue usando técnicas estéreis um armário de biossegurança e substitua a mídia por 3 mL de novos meios de comunicação RMPI 1640 (complementado com 1% de penicilina-estreptomicina, 10% FBS inativado pelo calor e 25 ng/mL GM-CSF para promover a polarização semelhante à M1 ou 50 ng/mL M-CSF para promover a polarização semelhante à M2). Cultura as células nestas condições para um total de 6 dias a partir de revestimento inicial em uma incubadora em 37 °C, 5% CO2.</li>
	<li>Para avançar a polarização das células preparadas para o fenótipo de macrófago M1-macrófago, ativar as células no dia 6 de incubação, substituindo a mídia celular por novas mídias contendo FBS inativada pelo calor de 5%, 1% caneta/estreptococo, 100 ng/mL E. coli-lipopolissaccharide derivado (LPS) e 20 gamma interferon ng/mL (IFN-γ).</li>
	<li>Para avançar a polarização das células preparadas para o fenótipo de m2-macrófago, ativar as células no dia 6 de incubação, substituindo a mídia celular por novas mídias contendo FBS 5% inativada pelo calor, 1% caneta/estreptococo, 10 ng/mL M-CSF e 20 ng/mL interleucina 4 (IL-4).</li>
	<li>Após 24 h, colher as células para análises de RNA, proteína ou citometria de fluxo.<ol>
<li>Quando as células estão prontas para coleta, lave as células no prato 2x com PBS (em RT para extração de RNA ou refrigerados no gelo para extração de proteínas). Como os macrófagos diferenciados estão agora firmemente ligados às placas, lyse as células em placas diretamente para obter material para análises de RNA e proteínas.</li>
		<li>Para a coleta de material para citometria de fluxo, adicione PBS contendo 2 mM EDTA para o prato, incubar as células por 10 min em 37 °C, raspar suavemente as células do prato, e recolher o conteúdo em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL antes de prosseguir com protocolos padrão.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Citometria flow
<ol><li>Lave as células em PBS para remover o meio de cultivo. Desça 100.000 células (por cada condição de citometria de fluxo) e resuspenda a pelota em 100 μL de PBS contendo 2 μL de inibidor de ligação HuFcR. Incubar em RT por 15 min.</li>
	<li>Adicione 50 μL de buffer de coloração e os anticorpos desejados (aqui, CD80, CD83, CD163 e CD209 foram usados) nas quantidades recomendadas.</li>
	<li>Misture suavemente e incubar a 4 °C no escuro por 30 min.</li>
	<li>Lave 2x com PBS e resuspenda as células manchadas em 150 μL de PBS antes de executar a amostra em um citofluorímetro.</li>
</ol>

<ol><li>Slim, J., Saling, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Review+of+Management+of+Inflammation+in+the+HIV+Population%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Research+International%22%5BJournal%5D)">A Review of Management of Inflammation in the HIV Population.</a> Biomedical Research International. 2016, 3420638(2016).</li>
<li>Herskovitz, J., Gendelman, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+and+the+Macrophage%3A+From+Cell+Reservoirs+to+Drug+Delivery+to+Viral+Eradication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmune+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">HIV and the Macrophage: From Cell Reservoirs to Drug Delivery to Viral Eradication.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 52-67 (2019).</li>
<li>Machado Andrade, V., Stevenson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+and+Viral+Factors+Influencing+Interplay+between+the+Macrophage+and+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmune+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Host and Viral Factors Influencing Interplay between the Macrophage and HIV-1.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 33-43 (2019).</li>
<li>Merino, K. M., Allers, C., Didier, E. S., Kuroda, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Monocyte%2FMacrophages+during+HIV%2FSIV+Infection+in+Adult+and+Pediatric+Acquired+Immune+Deficiency+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Role of Monocyte/Macrophages during HIV/SIV Infection in Adult and Pediatric Acquired Immune Deficiency Syndrome.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1693(2017).</li>
<li>Wacleche, V. S., Tremblay, C. L., Routy, J. P., Ancuta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Biology+of+Monocytes+and+Dendritic+Cells%3A+Contribution+to+HIV+Pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">The Biology of Monocytes and Dendritic Cells: Contribution to HIV Pathogenesis.</a> Viruses. 10 (2), (2018).</li>
<li>Davis, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+M1%2FM2+polarization+dynamically+adapts+to+changes+in+cytokine+microenvironments+in+Cryptococcus+neoformans+infection%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Macrophage M1/M2 polarization dynamically adapts to changes in cytokine microenvironments in Cryptococcus neoformans infection.</a> MBio. 4 (3), e00264(2013).</li>
<li>Raggi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Human+Macrophage+M1-M2+Polarization+Balance+by+Hypoxia+and+the+Triggering+Receptor+Expressed+on+Myeloid+Cells-1%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation of Human Macrophage M1-M2 Polarization Balance by Hypoxia and the Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells-1.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1097(2017).</li>
<li>Van Overmeire, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M-CSF+and+GM-CSF+Receptor+Signaling+Differentially+Regulate+Monocyte+Maturation+and+Macrophage+Polarization+in+the+Tumor+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">M-CSF and GM-CSF Receptor Signaling Differentially Regulate Monocyte Maturation and Macrophage Polarization in the Tumor Microenvironment.</a> Cancer Research. 76 (1), 35-42 (2016).</li>
<li>Vogel, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+macrophage+polarization+in+vitro%3A+maturation+and+activation+methods+compared%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Human macrophage polarization in vitro: maturation and activation methods compared.</a> Immunobiology. 219 (9), 695-703 (2014).</li>
<li>Almeida, M., Cordero, M., Almeida, J., Orfao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+subsets+of+peripheral+blood+dendritic+cells+show+distinct+phenotypic+and+functional+abnormalities+in+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Different subsets of peripheral blood dendritic cells show distinct phenotypic and functional abnormalities in HIV-1 infection.</a> AIDS. 19 (3), 261-271 (2005).</li>
<li>Ciesek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+TRAIL-dependent+cytotoxicity+of+CD1c-positive+dendritic+cells+in+chronic+hepatitis+C+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Viral+Hepatitis%22%5BJournal%5D)">Impaired TRAIL-dependent cytotoxicity of CD1c-positive dendritic cells in chronic hepatitis C virus infection.</a> Journal of Viral Hepatitis. 15 (3), 200-211 (2008).</li>
<li>Granelli-Piperno, A., Golebiowska, A., Trumpfheller, C., Siegal, F. P., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1-infected+monocyte-derived+dendritic+cells+do+not+undergo+maturation+but+can+elicit+IL-10+production+and+T+cell+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">HIV-1-infected monocyte-derived dendritic cells do not undergo maturation but can elicit IL-10 production and T cell regulation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7669-7674 (2004).</li>
<li>Hearps, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+infection+induces+age-related+changes+to+monocytes+and+innate+immune+activation+in+young+men+that+persist+despite+combination+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">HIV infection induces age-related changes to monocytes and innate immune activation in young men that persist despite combination antiretroviral therapy.</a> AIDS. 26 (7), 843-853 (2012).</li>
<li>Heggelund, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+toll-like+receptor+2+in+mononuclear+cells+from+HIV-infected+patients+induces+chemokine+responses%3A+possible+pathogenic+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Stimulation of toll-like receptor 2 in mononuclear cells from HIV-infected patients induces chemokine responses: possible pathogenic consequences.</a> Clinical and Experimental Immunology. 138 (1), 116-121 (2004).</li>
<li>Hernandez, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+TLR2+and+TLR4+in+dendritic+cells+in+response+to+HIV+type+1+and+coinfection+with+opportunistic+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Research+and+Human+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of TLR2 and TLR4 in dendritic cells in response to HIV type 1 and coinfection with opportunistic pathogens.</a> AIDS Research and Human Retroviruses. 27 (10), 1099-1109 (2011).</li>
<li>Hernandez, J. C., Latz, E., Urcuqui-Inchima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+induces+the+first+signal+to+activate+the+NLRP3+inflammasome+in+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Intervirology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 induces the first signal to activate the NLRP3 inflammasome in monocyte-derived macrophages.</a> Intervirology. 57 (1), 36-42 (2014).</li>
<li>Low, H. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR8+regulation+of+LILRA3+in+monocytes+is+abrogated+in+human+immunodeficiency+virus+infection+and+correlates+to+CD4+counts+and+virus+loads%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">TLR8 regulation of LILRA3 in monocytes is abrogated in human immunodeficiency virus infection and correlates to CD4 counts and virus loads.</a> Retrovirology. 13, 15(2016).</li>
<li>Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Impairment+of+Myeloid+Dendritic+Cells+during+Advanced+Stage+of+HIV-1+Infection%3A+Role+of+Factors+Regulating+Cytokine+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Functional Impairment of Myeloid Dendritic Cells during Advanced Stage of HIV-1 Infection: Role of Factors Regulating Cytokine Signaling.</a> PLoS ONE. 10 (10), e0140852(2015).</li>
<li>Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+negative+regulators+of+cytokine+signaling+during+chronic+HIV+disease+cause+functionally+exhausted+state+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Increased expression of negative regulators of cytokine signaling during chronic HIV disease cause functionally exhausted state of dendritic cells.</a> Cytokine. 91, 118-123 (2017).</li>
<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+genomics%2C+biogenesis%2C+mechanism%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116 (2), 281-297 (2004).</li>
<li>Li, H., Jiang, T., Li, M. Q., Zheng, X. L., Zhao, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Regulation+of+Macrophages+Polarization+by+MicroRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Regulation of Macrophages Polarization by MicroRNAs.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1175(2018).</li>
<li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Analyses+of+MicroRNA+Profiling+in+Interleukin-27+Treated+Monocyte-Derived+Human+Dendritic+Cells+Using+Deep+Sequencing%3A+A+Pilot+Study%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Analyses of MicroRNA Profiling in Interleukin-27 Treated Monocyte-Derived Human Dendritic Cells Using Deep Sequencing: A Pilot Study.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (5), (2017).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+miR-126-5p+Enhances+the+Inflammatory+Responses+of+Monocytes+to+Lipopolysaccharide+Stimulation+by+Suppressing+Cylindromatosis+in+Chronic+HIV-1+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">MicroRNA miR-126-5p Enhances the Inflammatory Responses of Monocytes to Lipopolysaccharide Stimulation by Suppressing Cylindromatosis in Chronic HIV-1 Infection.</a> Journal of Virology. 91 (10), (2017).</li>
<li>Lodge, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+MicroRNAs-221+and+-222+Inhibit+HIV-1+Entry+in+Macrophages+by+Targeting+the+CD4+Viral+Receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Host MicroRNAs-221 and -222 Inhibit HIV-1 Entry in Macrophages by Targeting the CD4 Viral Receptor.</a> Cell Reports. 21 (1), 141-153 (2017).</li>
<li>Ma, L., Shen, C. J., Cohen, E. A., Xiong, S. D., Wang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNA-1236+inhibits+HIV-1+infection+of+monocytes+by+repressing+translation+of+cellular+factor+VprBP%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">miRNA-1236 inhibits HIV-1 infection of monocytes by repressing translation of cellular factor VprBP.</a> PLoS ONE. 9 (6), e99535(2014).</li>
<li>Riess, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferons+Induce+Expression+of+SAMHD1+in+Monocytes+through+Down-regulation+of+miR-181a+and+miR-30a%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Interferons Induce Expression of SAMHD1 in Monocytes through Down-regulation of miR-181a and miR-30a.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 264-277 (2017).</li>
<li>Buchacher, T., Ohradanova-Repic, A., Stockinger, H., Fischer, M. B., Weber, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M2+Polarization+of+Human+Macrophages+Favors+Survival+of+the+Intracellular+Pathogen+Chlamydia+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">M2 Polarization of Human Macrophages Favors Survival of the Intracellular Pathogen Chlamydia pneumoniae.</a> PLoS ONE. 10 (11), e0143593(2015).</li>
<li>Jaguin, M., Houlbert, N., Fardel, O., Lecureur, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+profiles+of+human+M-CSF-generated+macrophages+and+comparison+of+M1-markers+in+classically+activated+macrophages+from+GM-CSF+and+M-CSF+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Polarization profiles of human M-CSF-generated macrophages and comparison of M1-markers in classically activated macrophages from GM-CSF and M-CSF origin.</a> Cellular Immunology. 281 (1), 51-61 (2013).</li>
<li>Lacey, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+GM-CSF-+and+macrophage-CSF-dependent+macrophage+responses+by+in+vitro+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models.</a> Journal of Immunology. 188 (11), 5752-5765 (2012).</li>
<li>Tarique, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic%2C+functional%2C+and+plasticity+features+of+classical+and+alternatively+activated+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Phenotypic, functional, and plasticity features of classical and alternatively activated human macrophages.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 53 (5), 676-688 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O protocolo apresentado demonstra o uso de células primárias de indivíduos infectados pelo HIV como modelo para o estudo de monócitos e macrófagos. HIV+ pacientes submetidos a cART vivem com infecção por vários anos e também podem ter outras co-infecções relacionadas a um sistema imunológico comprometido. Para estudar a imunomodulação na presença de infecção crônica do HIV, as células foram colhidas diretamente dos pacientes. Como miRNAs têm demonstrado desempenhar papéis importantes no desenvolvimento celular...

A infecção pelo vírus da imunodeficiência humana-1 (HIV-1) causa disfunção imunológica grave, o que pode levar a infecções oportunistas e à síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS). Embora os pacientes infectados pelo HIV submetidos a CART sejam caracterizados por baixas cargas virais e contagens normais de células T CD4+ T, o funcionamento do sistema imunológico pode ser comprometido nesses indivíduos, levando a uma resposta imune disfuncional que tem sido associada a um risco aumentado de desenvolver câncer1. Os mecanismos de disfunção imunológica em pacientes com HIV em cART permanecem em grande parte desconhecidos. Portanto, caracterizar as células imunes derivadas do paciente e investigar sua biologia e função é um componente crítico da pesquisa atual sobre HIV.
Monócitos e macrófagos são reguladores-chave das respostas imunes e desempenham papéis fundamentais na infecção pelo HIV2,3,4,5. Heterogêneo e plástico na natureza, macrófagos podem ser amplamente classificados em ativado classicamente (M1) ou ativado alternativamente (M2). Embora essa classificação geral seja necessária na criação de condições experimentais, o status de polarização dos macrófagos pode ser revertido por uma variedade de citocinas6,7,8,9. Embora vários estudos tenham investigado os efeitos da infecção pelo HIV em monócitos e células dendríticas, detalhes moleculares de respostas mediadas por monócito são em grande parte desconhecidos6,7,10,12,12,14,15,16,17,18,19. Entre os fatores envolvidos na regulação e função das células imunes, microRNAs (miRNAs), RNAs curtos não codificadores que regulam a expressão gênica pós-transcritoria, têm demonstrado desempenhar um papel importante no contexto das principais vias celulares (ou seja, crescimento, diferenciação, desenvolvimento e apoptose)20. Estas moléculas têm sido descritas como importantes reguladores de fatores de transcrição essenciais para ditar a polarização funcional dos macrófagos21. O papel potencial dos miRNAs em monócitos de indivíduos infectados pelo HIV submetidos a cART tem sido investigado, mas o progresso no campo requer muito mais trabalho22,23,24,25,26. Este artigo discute um método otimizado para transfect miRNAs e siRNAs em monócitos humanos primários de pacientes infectados pelo HIV e controles.
Este protocolo baseia-se em reagentes e kits comercialmente disponíveis, uma vez que a continuidade no procedimento técnico ajuda a eliminar variáveis experimentais desnecessárias ao trabalhar com amostras clínicas. No entanto, o método fornece dicas importantes (ou seja, o número de células banhadas ou breve incubação com mídia livre de soro para promover a adesão das células à placa). Além disso, as condições de polarização utilizadas neste protocolo são derivadas do trabalho publicado27,28,29.

<table><tbody><tr><td>0.5M EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer Tubos de coleta de sangue de plástico com K2EDTA</td><td>BD Biosciences</td><td>366643</td><td></td></tr><tr><td>Brilhante Buffer de Mancha</td><td>BD Horizonte BD</td><td>563794</td><td>Citometria de fluxo</td></tr><tr><td>CD14 PerCP Invitrogen</td><td></td><td>46-0149-42</td><td>Anticorpo conjugado por citometria de fluxo</td></tr><tr><td>CD163 BV711</td><td>BD Horizon</td><td>563889</td><td>Anticorpo conjugado por citometria de fluxo</td></tr><tr><td>CD209 BV421</td><td>BD Horizon</td><td>564127</td><td>Anticorpo conjugado por citometria de fluxo</td></tr><tr><td>CD80 FITC</td><td>BD Horizon</td><td>557226</td><td>Anticorpo conjugado por citometria de fluxo</td></tr><tr><td>CD83 APC</td><td>BD Horizon</td><td>551073</td><td>Anticorpo conjugado por citometria de fluxo</td></tr><tr><td>Easy 50 EasySep Magnet</td><td>StemCell Technologies</td><td>18002</td><td></td></tr><tr><td>Kit de isolamento direto de monócitos humanos Easy Sep</td><td>StemCell Technologies</td><td>19669</td><td></td></tr><tr><td>EIF4EBP1 mAb</td><td>Cell Signaling</td><td>9644</td><td>Anticorpo monoclonal para Western blot</td></tr><tr><td>EIF4EBP1 siRNA</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-29594</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovin Serum Defined Heat Inactivated</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03HI</td><td></td></tr><tr><td>Gallios Flow Cytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td>B43618</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH mAb</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-47724</td><td>Anticorpo monoclonal para Western blot</td></tr><tr><td>HuFcR Inibidor de ligação</td><td>eBiosciences</td><td>14-9161-73</td><td>Tampão de bloqueio de citometria de fluxo</td></tr><tr><td>Kaluza Software de análise</td><td>Beckman Coulter</td><td>B16406</td><td>Software para analisar dados de citometria de fluxo</td></tr><tr><td>Lipopolissacarídeos de Escherichia coli O55:B5</td><td>Sigma</td><td>L4524</td><td></td></tr><tr><td>miRCURY LNA microRNA Mimic has-miR-146a-5p</td><td>Qiagen</td><td>YM00472124</td><td></td></tr><tr><td>MISSÃO miRNA Controle Negativo</td><td>Sigma</td><td>HMC0002</td><td>MiRNA embaralhado conjugado com um corante infravermelho próximo</td></tr><tr><td>Nunc 35mm Placa de Cultura</td><td>de Células Thermo Scientific</td><td>150318</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012027</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>humano recombinante GM-CSF</td><td>R& D Systems</td><td>215-GM-050</td><td></td></tr><tr><td>IFN humano recombinante-&gama;</td><td>R& D Systems</td><td>285-IF-100</td><td></td></tr><tr><td>IL-4 Humano Recombinante</td><td>R& D Systems</td><td>204-IL-010</td><td></td></tr><tr><td>M-CSF humano recombinante</td><td>R& D Systems</td><td>216-MC-025</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 com L-Glutamina</td><td>Corning</td><td>10040CVMP</td><td></td></tr><tr><td>SiRNA de controle embaralhado</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-37007</td><td></td></tr><tr><td>Kit de reagente de transfecção azul de virômero</td><td>Lipocálice</td><td>VB-01LB-01</td><td></td></tr><tr><td>WST-1 Reagente de proliferação celular</td><td>Roche</td><td>5015944001</td><td>Ensaio colorimétrico para avaliar a viabilidade celular</td></tr></tbody></table>

isolamento, transfecção e cultura dos monócitos humanos primários

Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes

O vírus da imunodeficiência humana (HIV) continua a ser um grande problema de saúde, apesar da introdução da terapia antirretroviral combinada (cART) em meados da década de 1990. Embora a terapia antirretroviral reduza eficientemente a carga viral sistêmica e restaure a contagem normal de células T CD4+ T, ela não reconstitui um sistema imunológico completamente funcional. Um sistema imunológico disfuncional em indivíduos infectados pelo HIV submetidos a cART pode ser caracterizado por ativação imunológica, envelhecimento precoce de células imunes ou inflamação persistente. Essas condições, juntamente com fatores comórbidos associados à infecção pelo HIV, adicionam complexidade à doença, que não pode ser facilmente reproduzida em modelos celulares e animais. Para investigar os eventos moleculares subjacentes à disfunção imunológica nesses pacientes, um sistema para cultura e manipular monócitos primários humanos in vitro é apresentado aqui. Especificamente, o protocolo permite a cultura e transfecção do CD14 primário+ monócitos obtidos a partir de indivíduos infectados pelo HIV submetidos a cART, bem como de controles HIV-negativos. O método envolve isolamento, cultura e transfecção de monócitos e macrófagos derivados de monócitos. Embora kits e reagentes comercialmente disponíveis estejam empregados, o protocolo fornece dicas importantes e condições otimizadas para aadesão bem-sucedida e transfecção de monócitos com miRNA imitadores e inibidores, bem como com siRNAs.

Usando o procedimento descrito, os monócitos humanos preliminares dos indivíduos HIV-contaminados e os doadores saudáveis foram isolados. Todos os dados aqui apresentados foram obtidos a partir de HIV+ sujeitos submetidos a cART com baixa (&lt;20 cópias/mL) ou cargas virais indetectáveis e contagens normais de células T CD4+ T. Imediatamente após o isolamento, as células foram manchadas, e citometria de fluxo foi realizada para confirmar a pureza das populações celul...

Apresentado aqui é um protocolo otimizado para isolar, cultivar, transfeccionar e diferenciar monócitos primários humanos de indivíduos infectados pelo HIV e controles saudáveis.

Isolamento, Transfecção e Cultura dos Monócitos Humanos Primários

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...

A infecção pelo HIV causa disfunção imunológica mesmo em indivíduos submetidos à terapia antirretroviral sem vírus detectável. Este método permite o estudo da função monócito que são os principais reguladores da resposta imune. Otimizamos essa técnica para o isolamento, cultura e transfecção de monócitos primários humanos.Usamos este método para entender os mecanismos moleculares de disfunção imunológica em indivíduos infectados pelo HIV, mas pode ser aplicado a quaisquer outros estudos imunológicos envolvendo monócitos. Se esta é a primeira vez que trabalha com sangue humano, lembre-se de seguir os protocolos adequados de biossegurança e tratar todas as amostras como material possivelmente infeccioso. Depois de coletar 40 mililitros de sangue inteiro humano fresco em quatro tubos de vácuo EDTA mililitros, use técnica estéril para transferir todo o sangue para um único tubo de propileno cônico de 50 mililitros em um armário de biossegurança.Seguindo as instruções do fabricante a partir de um kit de isolamento de monócitos humanos selecionados, adicione dois mililitros de coquetel de isolamento de monócitos do kit ao tubo de sangue e vórtice as contas magnéticas do kit por 30 segund

isolation-transfection-and-culture-of-primary-human-monocytes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Neste vídeo, demonstramos o isolamento de monócitos do sangue humano total por separação imunomagnética negativa. Os monócitos isolados podem ser usados para análises posteriores a jusante.

Isolamento de Monócitos de Sangue Total por Seleção Imunomagnética Negativa

Este vídeo demonstra o priming de monócitos primários em macrófagos. Os monócitos humanos primários podem ser isolados e diferenciados para um fenótipo pró-inflamatório semelhante ao M1 usando o fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF) ou para um fenótipo anti-inflamatório semelhante ao M2 usando o fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF).

Cultura in vitro e diferenciação de monócitos primários em macrófagos

Macrófagos derivados de monócitos são importantes células do sistema imune inato. Aqui, descrevemos um fácil de...

Um<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudar a heterogeneidade de diferenciação de macrófagos humanos e Polarização

Análise da interação de nanopartículas com subpopulações definidas de células do sistema imunológico, por citometria de fluxo.

Detecção de nanopartículas fluorescentes Interações com Primário imunitário subpopulações de células por citometria de fluxo

Apresenta-se um protocolo simples e eficiente para a geração de macrófagos humanos. Casacos de Buffy são processados ​​por dupla centrifugação em gradiente de densidade e monócitos isolados são então diferenciado para macrófagos em revestidos de teflon de cultura de células de sacas. Isso maximiza o rendimento de macrófagos e facilita a colheita de células para experiências posteriores.

Isolamento de monócitos humanos por duas vezes centrifugação em gradiente e sua diferenciação de macrófagos em revestidos de teflon Cultura de Células Bags

Aqui apresentamos um protocolo que gera grandes quantidades de monócitos murinos a partir de medula óssea heterogênea para aplicações translacionais. Em comparação com outros, esse novo método ajuda a reduzir o número de animais sacrificados e reduz os custos, evitando métodos caros, como a separação de células magnéticas de alto gradiente (MACS).

Isolamento e injecção intravenosa de Murino de Medula Óssea Derivado monócitos

Um protocolo é apresentado para cultura de células de macrófagos derivados de monócitos humanos diferenciados pelo fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF). O protocolo utiliza a criopreservação de monócitos juntamente com sua diferenciação em massa em macrófagos. Em seguida, os macrófagos colhidos podem ser semeados em poços de cultura nas densidades celulares necessárias para a realização de experimentos.

Cultura de macrófagos macrófagos Colony estimulante fator diferenciado Humano monócitos derivados

Este estudo compara dois métodos diferentes de isolamento de monócitos humanos para obtenção de células dendríticas (DCs) in vitro. Os monócitos são selecionados por aderência ou enriquecidos negativamente por separação magnética. O rendimento e a viabilidade de monócitos, juntamente com a viabilidade, proliferação e expressão de marcadores de superfície CD11c/CD14 do MDDC, serão comparados entre os dois métodos.

Caracterização de derivados de monócitos células dendríticas humanas por imagem Citometria de Fluxo: Uma Comparação entre dois protocolos de isolamento de monócitos

Este protocolo descreve o fluxo de trabalho para obter macrófagos derivados de monócitos (MDM) a partir de amostras de sangue humano, um método simples para introduzir eficientemente os repórteres de complementação de fluorescência bimolecular inflamatória (BiFC) em MDM humano sem comprometer a viabilidade e o comportamento celular, e uma abordagem baseada em imagens para medir a ativação inflamatória de caspase em células vivas.

Visualização de Caspases Inflamatórias Induzidas proximidade em macrófagos derivados de monócitos humanos

Este estudo delineia uma nova abordagem para o estabelecimento de células semelhantes à micróglia derivadas de monócitos humanos (iMG) que permitem a avaliação indireta da inflamação cerebral. Isso apresenta um modelo celular que pode ser benéfico para pesquisas com foco na inflamação potencial do cérebro e distúrbios neuropsiquiátricos associados.

Engenharia de células semelhantes à microglia induzidas por sangue humano para pesquisa cerebral de tradução reversa

Descrevemos um procedimento para avaliar a capacidade de agentes farmacológicos gerarem células dendríticas tolerogênicas a partir de células dendríticas derivadas de monócitos virgens in vitro e validar sua potência por geração autóloga de células T reguladoras.

Um método simples e eficiente para testar agentes imunomoduladores para geração de células dendríticas tolerogênicas a partir de monócitos CD14+ humanos

Aprenda a isolar, cultivar e transfectar monócitos humanos primários para estudar funções imunes em indivíduos infectados pelo HIV. Este protocolo otimizado permite investigar mecanismos moleculares de disfunção imunológica.

Isolamento, Transfecção e Cultura dos Monócitos Humanos Primários

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