Name: Medição específica do ciclo celular de γH2AX e apoptose após estresse genotóxico por citometria de fluxo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Aprenda a medir quebras de dupla fita no DNA, distribuição do ciclo celular e apoptose por citometria de fluxo. Este método avalia respostas específicas ao ciclo celular após estresse genotóxico em oncologia clínica.

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Agradecemos a equipe de facilidade de citometria de fluxo no centro de pesquisa de câncer da Alemanha (DKFZ) por seu apoio.

<ol><li>Jensen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+non-small+cell+lung+cancer+with+intensity-modulated+radiation+therapy+in+combination+with+cetuximab%3A+the+NEAR+protocol+%28NCT00115518%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Treatment of non-small cell lung cancer with intensity-modulated radiation therapy in combination with cetuximab: the NEAR protocol (NCT00115518).</a> BMC Cancer. 6, 122(2006).</li>
<li>Oertel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Glioblastoma+and+Carcinoma+Xenograft+Tumors+Treated+by+Combined+Radiation+and+Imatinib+%28Gleevec%29%5BTitle%5D)+AND+%22Strahlentherapie+und+Onkologie%22%5BJournal%5D)">Human Glioblastoma and Carcinoma Xenograft Tumors Treated by Combined Radiation and Imatinib (Gleevec).</a> Strahlentherapie und Onkologie. 182 (7), 400-407 (2006).</li>
<li>Timke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Receptor%2FPlatelet-Derived+Growth+Factor+Receptor+Inhibition+Markedly+Improves+Radiation+Tumor+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Combination of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor/Platelet-Derived Growth Factor Receptor Inhibition Markedly Improves Radiation Tumor Therapy.</a> Clinical Cancer Research. 14 (7), 2210-2219 (2008).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimodal+glioblastoma+treatment+consisting+of+concurrent+radiotherapy%2C+temozolomide%2C+and+the+novel+TGF-%CE%B2+receptor+I+kinase+inhibitor+LY2109761%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Trimodal glioblastoma treatment consisting of concurrent radiotherapy, temozolomide, and the novel TGF-β receptor I kinase inhibitor LY2109761.</a> Neoplasia. 13 (6), 537-549 (2011).</li>
<li>Blattmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suberoylanilide+hydroxamic+acid+affects+expression+in+osteosarcoma%2C+atypical+teratoid+rhabdoid+tumor+and+normal+tissue+cell+lines+after+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Strahlentherapie+und+Onkologie%22%5BJournal%5D)">Suberoylanilide hydroxamic acid affects expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation.</a> Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).</li>
<li>Hoeijmakers, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Damage%2C+Aging%2C+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">DNA Damage, Aging, and Cancer.</a> New England Journal of Medicine. 361 (15), 1475-1485 (2015).</li>
<li>Rodgers, K., McVey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Error-Prone+Repair+of+DNA+Double-Strand+Breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Error-Prone Repair of DNA Double-Strand Breaks.</a> Journal of Cellular Physiology. 231 (1), 15-24 (2016).</li>
<li>Ciccia, A., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+Damage+Response%3A+Making+It+Safe+to+Play+with+Knives%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The DNA Damage Response: Making It Safe to Play with Knives.</a> Molecular Cell. 40 (2), 179-204 (2010).</li>
<li>Rothkamm, K., Krüger, I., Thompson, L. H., Löbrich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+of+DNA+double-strand+break+repair+during+the+mammalian+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Pathways of DNA double-strand break repair during the mammalian cell cycle.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (16), 5706-5715 (2003).</li>
<li>Escribano-Díaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cell+Cycle-Dependent+Regulatory+Circuit+Composed+of+53BP1-RIF1+and+BRCA1-CtIP+Controls+DNA+Repair+Pathway+Choice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">A Cell Cycle-Dependent Regulatory Circuit Composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP Controls DNA Repair Pathway Choice.</a> Molecular Cell. 49 (5), 872-883 (2013).</li>
<li>Bakr, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+crosstalk+between+DNA+damage+response+proteins+53BP1+and+BRCA1+regulates+double+strand+break+repair+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Radiotherapy+and+Oncology%22%5BJournal%5D)">Functional crosstalk between DNA damage response proteins 53BP1 and BRCA1 regulates double strand break repair choice.</a> Radiotherapy and Oncology. 119 (2), 276-281 (2015).</li>
<li>Mladenov, E., Magin, S., Soni, A., Iliakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-strand-break+repair+in+higher+eukaryotes+and+its+role+in+genomic+instability+and+cancer%3A+Cell+cycle+and+proliferation-dependent+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA double-strand-break repair in higher eukaryotes and its role in genomic instability and cancer: Cell cycle and proliferation-dependent regulation.</a> Seminars in Cancer Biology. 37-38, 51-64 (2016).</li>
<li>Lopez Perez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+response+of+clinical+carbon+ion+versus+photon+radiation+in+human+glioblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Radiotherapy+and+Oncology%22%5BJournal%5D)">DNA damage response of clinical carbon ion versus photon radiation in human glioblastoma cells.</a> Radiotherapy and Oncology. 133, 77-86 (2019).</li>
<li>Oertel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+suberoylanilide+hydroxamic+acid+with+heavy+ion+therapy+shows+promising+effects+in+infantile+sarcoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+oncology%22%5BJournal%5D)">Combination of suberoylanilide hydroxamic acid with heavy ion therapy shows promising effects in infantile sarcoma cell lines.</a> Radiation oncology. 6 (1), 119(2011).</li>
<li>Blattmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suberoylanilide+hydroxamic+acid+affects+%CE%B3H2AX+expression+in+osteosarcoma%2C+atypical+teratoid+rhabdoid+tumor+and+normal+tissue+cell+lines+after+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Strahlentherapie+und+Onkologie%22%5BJournal%5D)">Suberoylanilide hydroxamic acid affects γH2AX expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation.</a> Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).</li>
<li>Thiemann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+efficacy+of+the+histone+deacetylase+inhibitor+suberoylanilide+hydroxamic+acid+in+combination+with+radiotherapy+in+a+malignant+rhabdoid+tumor+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Oncology%22%5BJournal%5D)">In vivo efficacy of the histone deacetylase inhibitor suberoylanilide hydroxamic acid in combination with radiotherapy in a malignant rhabdoid tumor mouse model.</a> Radiation Oncology. 7 (1), 52(2012).</li>
<li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+retain+their+defining+stem+cell+characteristics+after+exposure+to+ionizing+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Oncology+Biology+Physics%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells retain their defining stem cell characteristics after exposure to ionizing radiation.</a> International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 87 (5), 1171-1178 (2013).</li>
<li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+are+resistant+to+carbon+ion+radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells are resistant to carbon ion radiotherapy.</a> Oncotarget. 6 (4), 2076-2087 (2015).</li>
<li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+exhibit+resistance+to+topoisomerase+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+letters%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells exhibit resistance to topoisomerase inhibition.</a> Cancer letters. 374 (1), 75-84 (2016).</li>
<li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+maintain+their+defining+stem+cell+characteristics+after+treatment+with+cisplatin%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells maintain their defining stem cell characteristics after treatment with cisplatin.</a> Scientific Reports. 6, 20035(2016).</li>
<li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+are+sensitive+to+bleomycin+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells are sensitive to bleomycin treatment.</a> Scientific Reports. 6, 26645(2016).</li>
<li>Rühle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cisplatin+radiosensitizes+radioresistant+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Cisplatin radiosensitizes radioresistant human mesenchymal stem cells.</a> Oncotarget. 8 (50), 87809-87820 (2017).</li>
<li>Münz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stem+cells+lose+their+functional+properties+after+paclitaxel+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stem cells lose their functional properties after paclitaxel treatment.</a> Scientific Reports. 8 (1), 312(2018).</li>
<li>Rühle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Radiation+Resistance+of+Human+Multipotent+Mesenchymal+Stromal+Cells+Is+Independent+of+Their+Tissue+of+Origin%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Oncology+Biology+Physics%22%5BJournal%5D)">The Radiation Resistance of Human Multipotent Mesenchymal Stromal Cells Is Independent of Their Tissue of Origin.</a> International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 100 (5), 1259-1269 (2018).</li>
<li>Dean, P. N., Jett, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mathematical+analysis+of+DNA+distributions+derived+from+flow+microfluorometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mathematical analysis of DNA distributions derived from flow microfluorometry.</a> Journal of Cell Biology. 60 (2), 523-527 (1974).</li>
<li>Fox, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+the+computer+analysis+of+synchronous+DNA+distributions+obtained+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">A model for the computer analysis of synchronous DNA distributions obtained by flow cytometry.</a> Cytometry. 1 (1), 71-77 (1980).</li>
<li>Costes, S. V., Boissière, A., Ravani, S., Romano, R., Parvin, B., Barcellos-Hoff, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+features+that+discriminate+between+foci+induced+by+high-+and+low-LET+radiation+in+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Imaging features that discriminate between foci induced by high- and low-LET radiation in human fibroblasts.</a> Radiation Research. 165 (5), 505-515 (2006).</li>
<li>Meyer, B., Voss, K. -O., Tobias, F., Jakob, B., Durante, M., Taucher-Scholz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clustered+DNA+damage+induces+pan-nuclear+H2AX+phosphorylation+mediated+by+ATM+and+DNA-PK%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK.</a> Nucleic Acids Research. 41 (12), 6109-6118 (2013).</li>
<li>Lopez Perez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+light+microscopy+shows+nanostructure+of+carbon+ion+radiation-induced+DNA+double-strand+break+repair+foci%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB%22%5BJournal%5D)">Superresolution light microscopy shows nanostructure of carbon ion radiation-induced DNA double-strand break repair foci.</a> FASEB. 30 (8), 2767-2776 (2016).</li>
<li>Schipler, A., Iliakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-strand-break+complexity+levels+and+their+possible+contributions+to+the+probability+for+error-prone+processing+and+repair+pathway+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">DNA double-strand-break complexity levels and their possible contributions to the probability for error-prone processing and repair pathway choice.</a> Nucleic Acids Research. 41 (16), 7589-7605 (2013).</li>
<li>Stenerlow, B., Hoglund, E., Carlsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+fragmentation+by+charged+particle+tracks%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Space+Research%22%5BJournal%5D)">DNA fragmentation by charged particle tracks.</a> Advances in Space Research. 30 (4), 859-863 (2002).</li>
<li>Friedland, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+track-structure+based+evaluation+of+DNA+damage+by+light+ions+from+radiotherapy-relevant+energies+down+to+stopping%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Comprehensive track-structure based evaluation of DNA damage by light ions from radiotherapy-relevant energies down to stopping.</a> Scientific Reports. 7, 45161(2017).</li>
<li>Pang, D., Chasovskikh, S., Rodgers, J. E., Dritschilo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+DNA+Fragments+Are+a+Hallmark+of+Heavy+Charged-Particle+Irradiation+and+May+Underlie+Their+Greater+Therapeutic+Efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Short DNA Fragments Are a Hallmark of Heavy Charged-Particle Irradiation and May Underlie Their Greater Therapeutic Efficacy.</a> Frontiers in Oncology. 6, 130(2016).</li>
<li>Böcker, W., Iliakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+Methods+for+analysis+of+foci%3A+validation+for+radiation-induced+gamma-H2AX+foci+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Computational Methods for analysis of foci: validation for radiation-induced gamma-H2AX foci in human cells.</a> Radiation Research. 165 (1), 113-124 (2006).</li>
<li>Löbrich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B3H2AX+foci+analysis+for+monitoring+DNA+double-strand+break+repair%3A+Strengths%2C+limitations+and+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">γH2AX foci analysis for monitoring DNA double-strand break repair: Strengths, limitations and optimization.</a> Cell Cycle. 9 (4), 662-669 (2010).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O método caracterizado é fácil de usar e oferece uma medida rápida, exata e reprodutível da resposta de dano do ADN que inclui a indução e o reparo da ruptura da dobro-Costa (DSB), os efeitos do ciclo de pilha e a morte da pilha apoptóticas. A combinação desses Endpoints fornece um quadro mais completo de suas inter-relações do que os ensaios individuais. O método pode ser amplamente aplicado como um ensaio de genotoxicidade abrangente nos campos de biologia de radiação, terapia e proteção, e mais geralmente em Oncologia...

O objetivo da Oncologia é matar ou inativar as células cancerosas sem prejudicar as células normais. Muitas terapias, direta ou indiretamente, induzem o estresse genotóxico em células cancerosas, mas também para alguns se estendem em células normais. A quimioterapia ou as drogas alvejadas são combinadas frequentemente com a radioterapia para realçar a radiosensibilidade do tumor irradiado1,2,3,4,5, que permite uma redução de a dose de radiação para minimizar os danos teciduais normais.
A radiação ionizante e outros agentes genotóxicos induzem diferentes tipos de danos ao DNA, incluindo modificações de base, ligações cruzadas e quebras de fio simples ou duplo. As rupturas da dobro-Costa do ADN (DSBs) são as lesões as mais sérias do ADN e sua indução é chave ao efeito da matança da pilha da radiação ionizante e das várias drogas cytostatic na radioquimioterapia. Os DSBs não só prejudicam a integridade do genoma, mas também promovem a formação de mutações6,7. Conseqüentemente, as rotas diferentes do reparo de DSB, e os mecanismos para eliminar pilhas irreparàvel danificadas como o apoptose desenvolveram durante a evolução. A resposta inteira do dano do ADN (DDR) é regulada por uma rede complexa de vias de sinalização que alcangam do reconhecimento de dano do ADN e da apreensão do ciclo de pilha para permitir o reparo do ADN, à morte de pilha programada ou à inactivação em caso da falha do reparo8.
O método cytometric do do fluxo apresentado foi desenvolvido para investigar o DDR após o esforço genotóxico em um ensaio detalhado que cubra a indução e o reparo de DSB, assim como conseqüências da falha do reparo. Combina a medida do marcador amplamente aplicado γH2AX do DSB com análise do ciclo da pilha e da indução do apoptosis, usando a análise subG1 clássica e uma avaliação mais específica da ativação do caspase-3.
A combinação destes valores-limite em um ensaio reduz não somente o tempo, o trabalho e as despesas de custo, mas igualmente permite a medida ciclo-específica da pilha da indução e do reparo de DSB, assim como a ativação de caspase-3. Tais análises não seriam possíveis com ensaios conduzidos independentemente, mas são altamente relevantes para uma compreensão detalhada da resposta de dano do ADN após o esforço genotóxico. Muitas drogas anti-câncer, tais como compostos citostáticos, são dirigidas contra a divisão de células e sua eficiência é fortemente dependente da fase de ciclo celular. A disponibilidade de diferentes processos de reparo do DSB também depende do estágio do ciclo celular e da escolha do caminho que é crítico para a precisão do reparo, e por sua vez determina o destino da célula9,10,11, doze anos. Além, a medida ciclo-específica da pilha de níveis de DSB é mais exata do que a análise agrupada, porque os níveis de DSB são não somente dependentes da dose de um composto ou de uma radiação genotóxico, mas igualmente no índice do ADN da pilha.
O método tem sido utilizado para comparar a eficácia de diferentes radioterapias para superar os mecanismos de resistência no glioblastoma13 e dissecar a interação entre radiação ionizante e drogas direcionadas em osteossarcoma14,15 e cancros rhabdoid teratoides atípicos16. Adicionalmente, o método descrito tem sido amplamente utilizado para analisar os efeitos colaterais da rádio e da quimioterapia nas células-tronco mesenquimais17,18,19,20,21, 22,23,24, que são essenciais para o reparo de dano de tecido normal induzido pelo tratamento e têm uma aplicação potencial na medicina regenerativa.

<table><tbody><tr><td>1.000 &micro; L pontas de filtro</td><td>Nerbe plus</td><td>07-693-8300</td><td></td></tr><tr><td>100-1.000 &micro; Pipeta L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>12 mm x 75 mm Tubos com Tampa do Filtro de Células, 35 &micro; m tamanho de poro de malha</td><td>BD Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>tubos de 15 mL</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; L pontas de filtro</td><td>Nerbe plus</td><td>07-662-8300</td><td></td></tr><tr><td>20-200 &micro; L pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>4',6-Diamidin-2-fenilindol (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>Dissolver em água a 200 &micro; g/mL e armazene alíquotas a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-H2A.X Fosfo-3 Anticorpo, RRID: AB_2248011</td><td>BioLegend</td><td>613406</td><td>Diluir 1:20</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Rabbit Anti-Active Caspase-3 Anticorpo, AB_1727414</td><td>BD Pharmingen</td><td>560626</td><td>Diluir 1:20</td></tr><tr><td>BD FACSSosolução</td><td>Lean BD Biosciences</td> 340345 <td>Para rotina de limpeza de citômetros após medição</td>BD <td></td></tr><tr><td>FACSSosolução de inse</td><td>BD Biosciences</td><td>340346</td><td>Para rotina de limpeza do citômetro após a medição</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Biochrom</td><td>L 182</td><td>Dissolver em água até a concentração de 1x</td></tr><tr><td>Meio de Eagle modificado de Dulbecco com glutamina estável</td><td>Biochrom</td><td>FG 0415</td><td>Material de cultura de células de rotina para a linha celular de exemplo usada no protocolo</td></tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>VWR</td><td>20821.330</td><td></td></tr><tr><td>Software Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS Superior (soro fetal bovino)</td><td>Biochrom</td><td>S 0615</td><td>Material de cultura de células de rotina para a linha celular de exemplo usada no protocolo</td></tr><tr><td>FlowJo v10 software</td><td>LLC</td><td>pedido</td><td></td>on-line</tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td>Meio de incorporação para preparação opcional de lâminas microscópicas a partir de amostras coradas</td></tr><tr><td>Filtros de celulose dobrados, grau 3hw</td><td>NeoLab</td><td>11416</td><td></td></tr><tr><td>LSRII ou LSRCotômetro de orquestra</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MG132</td><td>Calbiochem</td><td>474787</td><td>medicamento opcional para controle positivo de apoptose</td></tr><tr><td>Multifuge 3SR +</td> <td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>AppliChem</td><td>A3813</td><td>Prepare a solução a 4,5% fresca. Diluir em PBS aquecendo a 80 & C com agitação lenta sob a hotte. Cobrir o balão com folha de alumínio para evitar a perda de calor. Deixe a solução esfriar até a temperatura ambiente e ajuste o volume final. Passe a solução por um filtro de celulose.</td></tr><tr><td>Phospho-Histone H3 (Ser10) (D2C8) XP Rabbit mAb (Alexa Fluor&reg; 555 Conjugate) RRID: AB_10694639</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#3475</td><td>Diluir 3:200</td></tr><tr><td>PIPETBOY acu 2</td><td>Integra Biosciences</td><td>155 016</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas, 10 mL</td><td>Corning</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas, 25 mL</td><td>Corning</td><td>4489</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas, 5 mL</td><td>Corning</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>SuperKillerTRAIL (ligante indutor de apoptose relacionado ao TNF modificado)</td><td>Biomol</td><td>AG-40T-0002-C020</td><td>medicamento opcional para controle positivo de apoptose</td></tr><tr><td>Frascos de cultura de células T25</td><td>Greiner bio-one</td><td>690160</td><td>Material de cultura de células de rotina para a linha celular de exemplo usada no protocolo</td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA</td><td>PAN Biotech</td><td>P10-025500</td><td>Material de cultura celular de rotina para a linha celular de exemplo usada no protocolo</td></tr><tr><td>Células de glioblastoma U87 MG</td><td>ATCC</td><td>ATCC-HTB-14</td><td>Exemplo de linha celular usada no protocolo</td></tr></tbody></table>

medição específica do ciclo celular de γh2ax e apoptose após estresse genotóxico por citometria de fluxo

Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

O método apresentado ou versões ligeiramente modificadas foram concebidas para estudar respostas específicas de tratamento e efeitos colaterais de vários tratamentos anticancerígenos utilizados na oncologia clínica. Permite uma análise quantitativa e longitudinal da resposta de dano do ADN após o esforço genotóxico, como induzido pela radioterapia e por uma multidão de drogas anticancerígenas. O método abrange todas as fases da resposta ao dano do DNA, proporcionando desfechos para indução e reparo de quebras de dupla vertente de DNA (DSBs), prisão por ciclo celular e morte celular por apoptose em caso de falha no reparo. Combinar estas medidas fornece a informação sobre efeitos ciclo-dependentes do tratamento da pilha e permite assim um estudo detalhado do interação entre a proliferação celular e os mecanismos de enfrentamento de encontro aos danos do ADN. Como o efeito de muitos terapêutica oncológica, incluindo agentes quimioterápicos e radiação ionizante é limitado ou fortemente varia de acordo com as fases específicas do ciclo celular, análises correlativas dependem de um método robusto e viável para avaliar os efeitos do tratamento no DNA de uma forma específica do ciclo celular. Isso não é possível com ensaios de ponto de extremidade único e uma vantagem importante do método apresentado. O método não é restrito a qualquer linha celular em particular e foi exaustivamente testado em uma infinidade de tumores e linhas celulares normais do tecido. Pode ser amplamente aplicado como um ensaio de genotoxicidade abrangente em muitos campos de Oncologia, além de rádio-oncologia, incluindo avaliação de fatores de risco ambiental, triagem de drogas e avaliação da instabilidade genética em células tumorais.

As pilhas humanas do glioblastoma U87 ou LN229 foram irradiadas com 4 GY da radiação do íon do Photon ou do carbono. Os níveis de γH2AX específicos do ciclo celular e apoptose foram medidos em diferentes pontos de tempo até 48 h após a irradiação utilizando o método citométrico de fluxo apresentado aqui (Figura 3). Em ambas as linhagens celulares, os íons de carbono induziram maiores níveis de pico de γH2AX que diminuíram mais lentamente e permaneceram significativamente elevados em 24 a 48 ...

O método apresentado combina a análise quantitativa das rupturas da dobro-Costa do ADN (DSBs), a distribuição do ciclo de pilha e o apoptose para permitir a avaliação ciclo-específica da pilha da indução e do reparo de DSB assim como as conseqüências da falha do reparo.

Medição específica do ciclo celular de γH2AX e apoptose após estresse genotóxico por citometria de fluxo

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer ...

O método fornece informações sobre efeitos de tratamento dependentes do ciclo celular e permite e em profundidade o estudo da interação entre a proliferação celular e os mecanismos de enfrentamento contra danos ao DNA. Este método combina pontos finais importantes da resposta de dano de DNA, incluindo reconhecimento e reparo de frag de dois fios, efeitos do ciclo celular e eventual morte celular por apoptose em um ensaio abrangente. Utilizamos essa técnica principalmente para investigar respostas específicas ao tratamento e efeitos colaterais de tratamentos radioquematerapêuticos em oncologia clínica.O ensaio é muito útil para estudos correlativos nas áreas de radiobiologia e radioterapia, mas também pode ser aplicado a diversas outras áreas da oncologia. Depois de coletar as células da cultura de acordo com os procedimentos padrão de coleta celular, resuspensar a pelota em um mililitro de PBS. E transfira as células para dois mililitros de solução de fixação em um capô.Após uma incubação de 10 minutos à temperatura ambiente, colete as células por centrifugação e decante o sobrenante. É importante fixar as células como uma única suspensão celular, e manter o tempo de fixação constante para todas as amostras. Dê às células aderentes tempo suficiente para se desprender para obter células bem arredondadas para análise.Em seguida, solte a pelota tocando e resuspense as células em três mililitros de 70% de etanol. Para lavar as células antes da coloração, sedimentar as células por centrifugação, e afrouxar a pelota tocando. Em seguida, resuspenja as células com duas lavagens consecutivas com três mililitros de solução de lavagem e uma lavagem com um mililitro de solução de lavagem.Descartando o supernaspeso entre cada lavagem. Após a última lavagem, aspire cuidadosamente o supernaente sem perturbar a pelota e resuspenda a pelota lucent em 100 microliters do coquetel de anticorpos de interesse. Após uma hora em temperatura ambiente, colete as células por centrifugação e aspire cuidadosamente o supernatante sem perturbar a pelota.Em seguida, resuspenque a pelota solta em 100 a 250 microliters de solução de coloração de DNA e dispense as células através da tampa do filtro celular de um tubo de amostra com um tamanho de poros de malha de 35 micrômetros. Para analisar as células por citometria de fluxo, abra a guia de parâmetros na janela do citômetro e selecione os parâmetros conforme indicado na tabela. Em seguida, abra a janela da planilha e crie parcelas conforme indicado.Carregue uma amostra de controle no citômetro e pressione o botão de execução. Selecione o primeiro tubo na janela do navegador e clique no nome do tubo. Ajuste as tensões do detector para dispersão para frente e lateral e DAPI na guia parâmetros da janela do inspetor.Pressione o botão de espera para continuar com a configuração da planilha no software. Use a ferramenta do portão do polígono para definir a população das células na área de dispersão dianteira versus o enredo da área de dispersão lateral e use a ferramenta do portão de retângulo para definir a população de células únicas no dapi com o plot da área versus DAPI. Pressione o controle G para mostrar a hierarquia da população e clique nos nomes dos portais padrão para renomeá-los.Posteriormente, clique com o botão direito do mouse em todos os histogramas para selecionar mostrar populações e células únicas do menu de contexto. Adquira amostras de controle e tratadas para otimizar as tensões do detector para os fluoroforos acoplados a anticorpos para cobrir toda a gama dinâmica de sinal. Para medir as amostras, pressione o botão de execução no citômetro e use o painel de aquisição no software para medir as amostras.Em seguida, selecione arquivo, exportação e experimentos para selecionar a exportação do diretório na caixa de diálogo para salvar os dados como arquivos ponto FCS. Para avaliar os dados, arraste e solte os arquivos do ponto FCS no navegador de amostra do software de análise citométrica de fluxo. E use a ferramenta polígono para definir a população das células no enredo da área de dispersão dianteira versus lateral e para excluir detritos da análise.No gráfico da área DAPI versus DAPI, use a ferramenta retângulo para definir a população de células únicas e para excluir quaisquer dobras celulares ou aglomerados da análise. No histograma da área da DAPI, use a ferramenta bisetor para distinguir células individuais com um conteúdo normal de DNA de células apoptóticas com DNA degradado. Selecione biologia de ferramentas e ciclo celular para abrir a ferramenta de modelagem do ciclo celular e selecione Dean-Jett Fox para estimar a frequência de células nas fases G one S e G two M.Crie portões de fase G um S e G dois e M no traçado da área DAPI versus DAPI da população do ciclo celular para permitir uma medição de gama H específica de ciclo celular dois A X. Use a ferramenta bisetorial para distinguir o fosfohistone H três células positivas e negativas no histograma da área Alexa 555 da população do ciclo celular e para distinguir a base cas três células positivas e negativas no histograma da área Alexa 647 da população de células únicas. Pressione o controle T para abrir o editor da tabela e configure a tabela conforme indicado.Em seguida, selecione Para Arquivar para definir o formato e o destino na seção de saída da fita do menu e exporte os dados para uma folha de propagação. Íons de carbono induzem maiores níveis de pico de gama H dois AX em células glioblastoma que declinam mais lentamente e permanecem significativamente elevados em 24 a 48 horas em comparação com a radiação de fótons na mesma dose física. Tanto para íons de carbono quanto para radiação de fótons, os dois níveis de AX gama H foram mais altos em células G uma fase provavelmente porque o reparo de quebra de fios duplos de DNA é limitado à via de extremidade nonhomologous juntando-se nesta fase no ciclo celular.Em linha com a maior taxa de indução de quebra de fios duplos e cinética de reparo mais lenta, íons de carbono induzem uma prisão de ciclo celular mais forte e duradoura em fase G duas e uma taxa maior de apoptose do que os fótons. Dependendo da força do efeito do tratamento, a resolução das diferentes fases do ciclo celular pode ser desafiadora. Em algumas linhas celulares, a concentração de DAPI tem um grande impacto na qualidade do perfil do ciclo celular e precisa ser ajustada.Slides podem ser preparados a partir das amostras restantes após a citometria de fluxo para avaliar o número, tamanho e forma de gama H dois focos AX e distinguir entre a coloração de gama H e parnuclear focal e parnuclear. Usando nosso método, poderíamos mostrar que as células-tronco mesenquimais são relativamente resistentes contra radiações ionizantes e inibição de topoisomerase, mas sensíveis à gliomyacina. Como os vapores PFA são tóxicos, use sempre um capuz de fumaça ao preparar a solução de fixação e durante a etapa de fixação.Lembre-se também de usar luvas ao manusear DAPI.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Quantificação de DNA dupla fita-estrias usando formação γH2AX como um marcador molecular tornou-se uma ferramenta valiosa na biologia da radiação. Aqui mostramos o uso de um teste de imunofluorescência para a quantificação dos focos γH2AX após a exposição das células à radiação.

Quantificação de γH2AX Focos em resposta à radiação ionizante

Quantificação de DNA dupla fita-breaks, com base em γH2AX focos tem se tornado uma ferramenta valiosa, especialmente na biologia da radiação, para a avaliação da radiossensibilidade de tecidos e os efeitos de compostos de radiação modificando. Aqui mostramos o uso de um teste de imunofluorescência para quantificação de γH2AX focos em amostras de tecido.

Quantificação de γH2AX Focos em amostras de tecido

Neste vídeo, descrevemos a técnica de microscopia de imunofluorescência para detectar proteínas específicas de resposta a danos no DNA localizadas nos locais de quebras de fita dupla de DNA em células mononucleares humanas. As proteínas são reconhecidas por anticorpos primários específicos, que por sua vez se ligam a anticorpos secundários marcados com fluoróforo que fluorescem durante a visualização microscópica, permitindo a visualização das proteínas como focos fluorescentes distintos dentro...

Microscopia de imunofluorescência para análise de quebras de fita dupla de DNA

Este protocolo descreve o uso de bromodesoxiuridina (BrdU) para permitir a absorção de seguimento temporais de células que estavam na fase S de um determinado ponto no tempo. A adição de corantes de ADN e rotulagem anticorpo facilita a análise detalhada do destino das células em fase S em momentos posteriores.

Acompanhamento Temporal de progressão do ciclo celular utilizando citometria de fluxo, sem a necessidade de sincronização

Um protocolo para avaliar alterações nos níveis de dano ao DNA e na capacidade de reparo do DNA que podem ser induzidas por irradiação crônica in vivo de baixa dose em linfócitos do baço de camundongo, medindo a histona fosforilada H2AX, um marcador de quebras de fita dupla de DNA, usando citometria de fluxo é apresentado.

Medindo danos DNA e reparar no mouse Esplenócitos Depois crônica<em&gt; In Vivo</em&gt; A exposição a doses muito baixas de beta e gama-radiação

Este manuscrito fornece um protocolo de análise de quebras de DNA dobro-costa pela microscopia de imunofluorescência de γH2AX e 53BP1.

Microscopia de imunofluorescência de γH2AX e 53BP1 para analisar a formação e reparação do DNA Double-strand Breaks

Após danos no DNA, as células humanas ativam caminhos essenciais de reparação para restaurar a integridade de seu genoma. Aqui, descrevemos o método de imunofluorescência indireta como um meio de detectar proteínas de reparação de DNA, analisar seu recrutamento espacial e temporal e ajudar a interrogar a interação proteína-proteína nos locais de danos ao DNA.

Visualização de Proteínas de Reparação de DNA Interação por Imunofluorescência

Este protocolo apresenta a preparação do slide e a pontuação automatizada do ensaio de focos γ-H2AX em linfócitos sanguíneos periféricos. Para ilustrar o método e a sensibilidade do ensaio, linfócitos isolados foram irradiados in vitro. Este método automatizado de detecção de DSB de DNA é útil para aplicações de dosimetria biológica rápida e de alto rendimento.

Um método automatizado de pontuação microscópica para o ensaio de γ-H2AX Foci em Linfócitos de Sangue Periféricos Humanos

Aqui apresentamos um método baseado em citometria de fluxo para visualização e quantificação de marcadores associados à senescência múltipla em células únicas.

Detecção simultânea baseada em imagens e flutometria de marcadores de senescência fluorescentes múltiplas em células cancerígenas senescentes induzidas por terapia

Este protocolo apresenta um método para avaliar a formação e o reparo de quebras de dupla fita de DNA através da detecção simultânea de focos de γH2AX e 53BP1 em núcleos interfásicos de linfócitos periféricos humanos tratados com bleomicina.

Imunofluorescência Dupla de γH2AX e 53BP1 em Linfócitos Periféricos Humanos

Aqui, apresentamos um protocolo simples e rápido para a detecção de interação proteica em locais de dano ao DNA.

Ensaio de ligante de proximidade para localizar proteínas em locais de dano ao DNA

Aprenda a medir quebras de dupla fita no DNA, distribuição do ciclo celular e apoptose por citometria de fluxo. Este método avalia respostas específicas ao ciclo celular após estresse genotóxico em oncologia clínica.

Medição específica do ciclo celular de γH2AX e apoptose após estresse genotóxico por citometria de fluxo

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