Uso de um microarray do antígeno da gripe para medir a amplitude de anticorpos do soro através dos subtypes do vírus

A microarray de antígeno de influenza permite a medição simultânea de isótipos de anticorpos múltiplos contra mais de 300 cepas de influenza de um pequeno volume de amostragem sanguínea de apenas um microliter. A microarray facilita uma medição de alta produtividade da amplitude dos anticorpos de influenza através da paisagem antigênica das cepas de influenza. Ao caracterizar anticorpos influenza com mais detalhes do que antes, essa microarray pode ajudar a determinar por que certas pessoas desenvolvem uma infecção por gripe e outras não.

A técnica de microarray de antígeno foi aplicada a 35 patógenos diferentes em nosso laboratório, permitindo a medição de anticorpos contra 60.000 alvos de antígeno e de 50.000 amostras de soro coletadas de casos de doenças infecciosas e controles saudáveis em todo o mundo. Tendo ensinado essa técnica através de oficinas presenciais, descobrimos que ser capaz de demonstrar visualmente a técnica é crucial para sua compreensão e desempenho. Demonstrando o procedimento estarão Al Jasinskas e Rafael De Assis, cientistas do projeto do nosso laboratório.

Para imprimir antígenos usando uma impressora de microarray, selecione uma impressora com pinos de manchas de microarray de baixo volume que podem aspirar os antígenos de uma placa de origem de 384 poços no canal de amostra e depositar os antígenos através de contato direto e ação capilar em lâminas de vidro revestidas de 16 pad nitrocelulose. No software de impressão, digite o número de placas de amostra que serão utilizadas na caixa de texto das placas e selecione o tipo de placa que será usada para a análise. Selecione uma configuração de pino e defina os deslocamentos de origem para as distâncias entre a origem do slide e o local onde os pinos de impressão começarão a imprimir nos slides.

Sob a guia de design de matriz, defina o tamanho e a forma das matrizes e selecione os parâmetros de como os pinos de impressão pegarão e dispensarão as amostras. Configure os protocolos de limpeza e manchas do pino e defina a sequência em que os blocos de amostra são impressos nos slides. O software de matriz construirá um arquivo de índice de grade anotado para descrever o arranjo de antígenos dentro de cada microarray.

Depois de programar o software de impressão com o protocolo desejado, inicie a execução de impressão. Quando concluído, coloque lâminas de microarray não prorvidas em uma caixa à prova de luz em um armário desiccador à temperatura ambiente. Para sondar sera para anticorpos na microarray, use clipes para anexar o lado da almofada de slides de microarray nas câmaras de sondagem e coloque as câmaras nos quadros.

Tenha cuidado ao montar os slides, pois eles são facilmente quebrados e verifique se há algum vazamento após a reidratação. Se necessário, desmonte e remonte os slides para corrigir vazamentos. Reidratar os slides com 100 microliters de tampão de bloqueio filtrado por poço e diluir o sera a uma proporção de 1 a 100 em 100 microliters de tampão de bloqueio por amostra.

Em seguida, incubar os slides de microarray rehidratados e o sera diluído por 30 minutos à temperatura ambiente e 100 a 250 rotações por minuto em um agitador orbital. No final da incubação, use pontas de pipeta conectadas a uma linha de vácuo com um frasco de coleta secundária para aspirar cuidadosamente o tampão de bloqueio do canto de cada câmara sem tocar nas almofadas e adicionar imediatamente a sera diluída às almofadas sem permitir que as almofadas sequem. Em seguida, coloque as molduras cobertas em bandejas contendo toalhas de papel úmidas seladas para manter a umidade e incubar as molduras durante a noite a quatro graus Celsius em um agitador de balanço.

Para rotulagem de anticorpos secundários conjugados por ponto quântico, aspire cuidadosamente a sera como apenas demonstrou e enxágue os slides com três lavagens em 100 microliters de tampão TTBS fresco por poço por cinco minutos cada um em um agitador orbital. Os slides são então incubados com uma mistura de anticorpos secundários conjugados de ponto quântico e, em seguida, lavados três vezes como descrito no protocolo, usando a mesma técnica que acabou de demonstrar. Após a última lavagem, remova cuidadosamente os slides das câmaras e enxágue suavemente os slides com água dupla destilada filtrada e, em seguida, coloque cada lâmina em um tubo de 50 mililitros.

Em seguida, seque as lâminas por centrifugação. Para adquirir imagens dos slides de microarray, primeiro ligue o imager portátil e coloque cuidadosamente o slide para ser exibido de frente para baixo no suporte de slides na câmara de imagem. Abra o software de imagem e, sob a guia configurar imager, selecione a configuração de slides apropriada.

Sob a guia de controle de imagem, selecione o canal fluorescente apropriado e ajuste os tempos de exposição e aquisição, dependendo da reatividade do sera. Em seguida, clique em capturar para iniciar a aquisição da imagem. No final da aquisição, use as grades orientadas nos marcadores fiduciários para detectar os pontos de matriz.

Para medir a intensidade do local, no painel de informações do arquivo, carregue o arquivo gal e especifique a pasta onde os arquivos de saída de análise devem ser salvos na seção de opções de análise. Sob a guia de controle de imagem, abra uma das imagens adquiridas para ser quantificada e selecione auto. Na seção de análise de matriz, crie um modelo fiduciário conforme instruído pelo software.

Clique na análise do lote para selecionar a pasta que contém as imagens a serem quantificadas e selecione o modelo fiduciário que acabou de ser criado. O software analisará cada imagem e quantificará a intensidade do ponto. Em seguida, analise os dados brutos para comparar a ligação de anticorpos entre antígenos e através de amostras de soro.

Neste estudo representativo, os anticorpos secundários utilizados foram IgG anti-humano de cabra conjugado a ponto quântico emissor a 800 nanômetros e IgA anti-humano de cabra conjugado ao ponto quântico emissor a 585 nanômetros para detecção multiplex de anticorpos IgG e IgA, respectivamente. No mapa de calor resultante, apenas os subtipos clinicamente relevantes com alta representação foram rotulados para economizar espaço com o sinal positivo denotando todos os subtipos restantes de um número maior. O Soro IgA e o IgG foram agrupados por suas formas moleculares e subtipos de hemaglutina e neuraminidase.

Para demonstrar a alta especificidade dos anticorpos do grupo chefe da hemagglutinina para os subtipos clínicos e a alta reatividade cruzada de inteiros hemaglutininas e anticorpos de hemaglutina inteira triamerizada com a inclusão da região do estoque. As respostas de anticorpos influenza medidas na microarray podem ser confirmadas por técnicas tradicionais, incluindo inibição de hemagglutinação e ensaios de microneutralização. Esta técnica produziu insights sobre a especificidade do subtipo dos anticorpos para o grupo chefe da gripe e a importância relativa dos anticorpos IgA e IgG para a suscetibilidade da gripe.

Embora nenhum dos materiais seja extremamente perigoso, todas as amostras de soro humano devem ser manuseadas de acordo com protocolos institucionais de biossegurança.