Automatizado Rat single-pellet atingindo com 3-dimensional reconstrução de pata e dígitos trajetórias
10 de julho de 2019
O alcance hábil do roedor é comumente usado para estudar habilidades destosas, mas requer tempo e esforço significativos para implementar a tarefa e analisar o comportamento. Nós descrevemos uma versão automatizada do alcance hábil com seguimento do movimento e reconstrução tridimensional de trajetórias do alcance.
Este método baseia-se em protocolos de alcance qualificados para fabricantes de ratos estabelecidos para automatizar o treinamento e os testes, fornecendo um meio eficiente de adquirir grandes conjuntos de dados relativamente rapidamente. Ele minimiza o esforço do experimentador, permitindo a reconstrução tridimensional da cinemática de membros dianteiros. A cinemática pode ser usada para avaliar os efeitos de intervenções precisamente cronometradas ou correlacionadas com gravações fisiológicas.
Com alguns ajustes, essa técnica também pode ser aplicada em camundongos. Comece acendendo as luzes e coloque o rato em uma câmara de alcance habilidosa. Use fórceps para segurar uma pelota através do slot de alcance na frente da caixa.
Deixe o rato comer três pelotas das fórceps. Puxe a pelota de volta da próxima vez que o rato tentar comer a pelota dos fórceps e repetir até que o rato alcance a pelota com uma pata a mais de 11 atinge a preferência da pata indicando. Em seguida, alinhe a haste de entrega de pelotas com o lado da fenda de alcance contralateral à pata preferida do rato.
Coloque uma pelota na haste de entrega. Em seguida, use fórceps para isca o rato com a pelota, mas direcione o rato em direção à vara de entrega para que sua pata bata na pelota na haste. Depois que o rato tentar 10 chegar à vara de entrega sem ser iscado, avance o rato para a próxima fase.
Em seguida, posicione a haste de entrega de pelotas com base na preferência da pata do rato e ajuste-a para a posição dois. Ajuste a posição de altura da haste de entrega da pelota usando o controle remoto do atuador. Uma vez que a haste de entrega esteja na altura correta, segure o número desejado até que a luz pisque em vermelho para definir.
Em seguida, coloque o rato na câmara e isca o rato para trás com uma pelota. Quando o rato se mover o suficiente para a parte de trás da câmara que quebraria o feixe infravermelho se a versão automatizada estivesse funcionando, mova a haste de entrega de pelotas para a posição três. Finalmente, espere o rato pegar a pelota e, em seguida, mova a haste de entrega de pelotas de volta para a posição dois.
Coloque uma nova pelota na haste de entrega se for derrubada. Repita gradualmente esses passos iscando o rato cada vez menos até que o rato comece a um, mova-se para trás para solicitar uma pelota sem ser iscado, e dois, imediatamente mover-se para a frente depois de pedir uma pelota na parte de trás. Depois que o rato tiver feito isso 10 vezes, comece a treinar sobre a tarefa automatizada.
Para configurar o sistema automatizado, acenda as luzes da câmara e reabastete o reservatório de pelotas. Posicione a haste de entrega da pelota de acordo com a preferência da pata do rato. Verifique se as posições do atuador estão definidas corretamente.
Em seguida, ligue o computador e abra o programa de alcance qualificado. Digite o número de identificação do rato no assunto e selecione a preferência da pata no menu suspenso manual. Especifique o caminho de salvamento para os vídeos.
Em seguida, defina a hora da sessão e o número de vídeos máximos. Defina a duração do elevador de pelotas também e habilite a penalidade de alcance antecipado. Em seguida, para tirar imagens de calibração, coloque a mão amiga dentro da câmara de alcance e cutuque o clipe do jacaré através do slot de alcance.
Segure o cubo na frente da fenda de alcance com o clipe do jacaré. Em seguida, posicione o cubo para que o lado vermelho apareça no espelho superior, no lado verde no espelho esquerdo e no lado azul no espelho direito. No programa comportamental, certifique-se de que o limite de ROI seja definido para um valor muito grande.
Clique no botão executar e assim que o botão inicializado da câmera ficar verde, pressione comece a iniciar a aquisição de vídeo. Clique em Modo Cal e, em seguida, tire uma imagem clicando em Take Cal Image. Mova o cubo ligeiramente e tire outra imagem.
Repita novamente para um total de três imagens. Por fim, pare o programa clicando em parar e clique no botão stop sign. Remova a mão amiga e o cubo da caixa.
Tenha cuidado para não bater nada na câmara comportamental depois que as imagens de calibração foram tiradas naquele dia. Primeiro, coloque o rato na câmara de acesso hábil. Clique na seta branca para executar o programa.
Em seguida, ajuste a posição do ROI para detecção da pata ajustando x deslocamento, y offset, largura do ROI e altura do ROI. Posicione o ROI no espelho lateral que mostra o dorso da pata diretamente em frente ao slot de alcance e clique em começar o programa. Enquanto o rato não está alcançando, ajuste o baixo valor do limiar do ROI até que o valor do gatilho do ROI ao vivo esteja oscilando entre zero e um.
Em seguida, defina o limiar de ROI para ser significativamente maior do que o valor do gatilho do ROI ao vivo durante as cutucadas do nariz e menor do que o valor do gatilho do ROI ao vivo quando o rato chegar. Ajuste até que os vídeos sejam constantemente acionados quando o rato chegar, mas não quando ele cutuca o nariz através da ranhura. Monitore os primeiros testes para garantir que tudo esteja funcionando corretamente.
Quando um rato chega antes de solicitar uma pelota, observe o aumento do número de alcances precoces. Quando um rato chega depois de solicitar uma pelota, observe o número de vídeos aumentar enquanto uma cópia do vídeo é salva como um arquivo de lixo. Finalmente, após o tempo de sessão ou o número máximo de vídeos ser alcançado, pressione o botão stop sign.
Os resultados indicam que após 20 dias, os ratos adquirem a tarefa de alcançar qualificados. Aqui, as trajetórias de alcance de uma única sessão são mostradas. Isso representa apenas o avanço inicial da pata para facilitar a apresentação.
Além disso, se o gatilho de detecção da pata não for configurado com precisão, há uma variabilidade significativa no quadro em que a pata rompe o slot de alcance que pode levar à variabilidade quando as intervenções são acionadas durante os movimentos de alcance. Além do manuseio cuidadoso dos animais, nenhuma precaução será tomada neste protocolo. É mais importante definir o limite do ROI corretamente para que vídeos ou outras intervenções sejam acionados nos momentos apropriados.
Este método pode ser emparelhado com várias outras técnicas, como optogenética, imagem de cálcio e modelos genéticos que podem abordar questões que vão desde o controle motor básico até a fisiopatologia da desordem de movimento. Esta técnica permite a correlação de alcance detalhado e compreender cinemática com gravações fisiológicas ou intervenções permitindo que os pesquisadores respondam não apenas se, mas como os movimentos mudam com as mudanças dos circuitos neurais.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um método automatizado para o alcance habilidoso em roedores, aumentando a eficiência do treinamento e dos testes, ao mesmo tempo que minimiza o esforço do experimentador. A técnica permite a reconstrução tridimensional da cinemática do membro anterior, facilitando a análise de habilidades hábeis.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Análise comportamental
- Rastreamento automatizado de movimento
Antecedentes
- A preensão habilidosa em roedores é um modelo comum para o estudo de habilidades destrosas.
- Métodos tradicionais exigem tempo e esforço significativos para implementação e análise.
- A automação pode agilizar os processos de coleta e análise de dados.
- O método pode ser adaptado para uso com camundongos.
Objetivo do Estudo
- Automatizar a tarefa de alcance habilidoso em roedores.
- Facilitar a aquisição eficiente de grandes conjuntos de dados.
- Permitir a análise tridimensional dos movimentos dos membros anteriores.
Métodos Utilizados
- Automação de protocolos de treinamento e testes para alcance habilidoso.
- Rastreamento de movimento para coleta precisa de dados.
- Reconstrução tridimensional de trajetórias de alcance.
- Avaliação da cinemática em relação a gravações fisiológicas.
Resultados Principais
- Aquisição eficiente de dados com reduzida participação do experimentador.
- Reconstrução tridimensional bem-sucedida da cinemática do membro anterior.
- Capacidade de correlacionar dados cinemáticos com intervenções fisiológicas.
- Adaptabilidade do método para uso em camundongos.
Conclusões
- O método automatizado aprimora o estudo de habilidades hábeis em roedores.
- Ele fornece uma estrutura robusta para analisar movimentos dos membros anteriores.
- Essa abordagem pode levar a desenhos experimentais mais eficientes na pesquisa em neurociência.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Os movimentos automatizados coordenados com reconstrução cinemática tridimensional permitem avaliação quantitativa e de alto rendimento da função motora em modelos de roedores, apoiando a validação de alvos na descoberta de fármacos em neurociência. Ao reduzir o esforço manual e aumentar a reprodutibilidade dos dados, este método melhora a confiança preditiva em estudos mecanicistas precoces de distúrbios do movimento. Ele facilita a correlação entre fenótipos comportamentais e manipulações de circuitos neurais, auxiliando na identificação de compostos promissores e na redução de riscos pré-clínicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses sobre circuitos motores por meio da medição precisa e automatizada da cinemática de alcance e preensão.
- Valor Operacional: Reduz a variabilidade e o viés do experimentador, aumentando a reprodutibilidade entre laboratórios e pontos temporais.
- Valor Preditivo: Reforça a confiança no alvo ao associar manipulações genéticas ou farmacológicas a desfechos mensuráveis de destreza.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Gera dados padronizados de vídeo com alta taxa de quadros adequados para pipelines automatizados de estimativa de postura, como o DeepLabCut.
- Saída Quantitativa: Fornece dados de trajetória 3D que permitem variáveis objetivas e contínuas para modelagem de efeitos de compostos.
- Escalabilidade: A entrega automatizada de pellets e o acionamento permitem triagem em grandes coortes com mínima intervenção manual.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Modela a disfunção da função dos membros anteriores observada no Parkinson, Huntington e acidente vascular cerebral, permitindo o alinhamento de biomarcadores translacionais.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Permite a correlação entre déficits cinemáticos e intervenções optogenéticas, quimigenéticas ou eletrofisiológicas para estabelecer mecanismos neurais causais.
- Continuidade Pré-clínica: Permite o acompanhamento longitudinal da recuperação motora ou da degeneração em modelos de progressão de doenças.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a verificação da hipótese do alvo até a otimização do composto líder e a eficácia pré-clínica, especialmente para programas do SNC focados na função motora.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao quantificar como perturbações nos circuitos neurais afetam a dinâmica de movimentos habilidosos.
- Triagem: Permite leituras comportamentais padronizadas e prontas para ensaios na avaliação de bibliotecas de compostos em modelos de comprometimento motor.
- Análises: Fornece trajetórias cinemáticas 3D e vídeos sincronizados com gatilhos para correlação multimodal com registros neurais.
- Pesquisa Translacional: Alinha-se com avaliações motoras clínicas (por exemplo, batida digital, testes de destreza) para aumentar a validade preditiva.
- Reutilização Empresarial: Representa uma plataforma escalável e padronizada para fenotipagem motora em múltiplos projetos em diferentes áreas terapêuticas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a compreensão mecanicista ao permitir o alinhamento temporal preciso do comportamento com intervenções neurais.
- Valor Operacional: Padroniza protocolos de treinamento e testes, reduzindo a variabilidade entre usuários e aumentando a produtividade.
- Valor Estratégico: Melhora decisões de prosseguimento ou interrupção ao fornecer desfechos motores objetivos e quantificáveis no início da descoberta.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de compostos com base na melhora motora funcional, reduzindo falhas em estágios avançados em programas de distúrbios do movimento.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em manipulação de roedores, treinamento comportamental e ferramentas de estimativa de postura baseadas em aprendizado de máquina.
- Exige câmeras de alta velocidade, iluminação sincronizada, entrega de pelotas controlada por atuadores e software de rastreamento de vídeo em tempo real.
- Exige padronização entre equipes dos parâmetros da região de interesse (ROI), calibração de limiares e lógica de acionamento para garantir o momento reprodutível da intervenção.
- A adaptação entre espécies (por exemplo, camundongos para ratos) requer revalidação dos parâmetros cinemáticos do alcance e da posição das pelotas.
- As limitações práticas incluem a dependência de um ajuste adequado do limiar da ROI para evitar acionamentos falsos durante movimentos do focinho ou alcances perdidos.
