Identificação de RNAs circulares usando sequenciamento de RNA

Este protocolo é o resultado da avaliação de aspectos-chave da preparação da biblioteca circRNA, como tipo de kit, tratamento RNase, quantidades de entrada e seu impacto na detecção de circRNA. Permite a detecção ideal de circRNA e fornece dados sobre parâmetros ajustáveis, dependendo das necessidades do usuário. Identificar circRNAs em diferentes tipos de amostras nos ajudará a entender melhor a distribuição de sua expressão e prepara o cenário para delinear o papel funcional dessas moléculas.

Este método pode ser aplicado a qualquer amostra total de RNA. É importante manter amostras de RNA no gelo antes de iniciar o protocolo. Avalie os valores RIN e DV200 no Agilent Bioanalyzer ou TapeStation antes da preparação, e siga os procedimentos apropriados ao trabalhar com RNA.

Comece diluindo o RNA total para quatro microgramas em 39 microliters de água sem RNase e pipetting-lo para cima e para baixo para misturar. Em um tubo separado, use 1x RNase R Buffer para diluir o RNase R para uma concentração de trabalho de duas unidades por microliter. Pipeta 39 microliters de RNA total e cinco microliters de 10x RNase R Reaction Buffer em um tubo de reação de 1,5 microliter, e misturar.

Adicione seis microliters do RNase diluído R.Em seguida, ajuste a pipeta ao volume total de reação e misture a solução pipetando para cima e para baixo 10 vezes. Coloque o tubo em um banho de água Celsius de 37 graus por 10 minutos, certificando-se de que o volume total de reação esteja imerso no banho de água. Em seguida, coloque o tubo no gelo, e prossiga imediatamente com a limpeza e concentração do RNA.

Antes de começar, prepare o RNA Wash Buffer misturando o concentrado com 48 mililitros de 100% etanol, e coloque colunas de purificação em tubos de coleta. Quando estiver pronto, adicione dois volumes de tampão de ligação de RNA à amostra r-tratada r-tratada r e misture bem. Adicione 150 microliters de 100% de etanol à mistura para um total de 300 microliters, transfira todo o volume para a coluna e centrífuga por 30 segundos.

Remova o fluxo através e adicione 400 microliters de RNA Prep Buffer diretamente à coluna. Centrifugar por 30 segundos, e descartar o fluxo através. Em seguida, adicione 700 microliters de RNA Wash Buffer à coluna, centrífuga por 30 segundos e descarte o fluxo através.

Adicione mais 400 microliters do Wash Buffer, centrífuga por dois minutos e transfira a coluna para um tubo 1.5 mililitro fresco sem RNase. Adicione cuidadosamente 11 microliters de água sem RNase diretamente à coluna, segurando a ponta da pipeta bem acima do filtro da coluna. Deixe a amostra descansar por um minuto à temperatura ambiente e, em seguida, centrifuá-la por um minuto.

Certifique-se de que há fluxo através do tubo de 1,5 mililitro, e descarte a coluna. A amostra de RNA purificada pode ser armazenada a menos 80 graus Celsius ou usada imediatamente para a preparação da biblioteca. Transfira 10 microliters do RNA total purificado para um poço limpo em uma placa PCR de 96 poços.

Adicione cinco microliters de tampão de ligação rRNA seguido por cinco microliters de rRNA Removal Mix, em seguida, delicadamente pipeta para cima e para baixo para misturar os reagentes. Sele a placa e incuba-a por cinco minutos a 68 graus Celsius em um bloco termocicr pré-programado e pré-aquecido. Após a incubação, deixe a placa ficar em temperatura ambiente por um minuto.

Remova o selo da placa e adicione 35 microliters de contas de remoção de rRNA de temperatura ambiente vórtice à amostra. Ajuste a pipeta para 45 microliters, e pipeta para cima e para baixo 10 a 20 vezes para misturar completamente. Deixe o prato ficar em temperatura ambiente por um minuto.

Transfira a placa para um suporte magnético e incuba-a lá por um minuto ou até que a solução se limpe. Transfira o supernatante para um novo poço na placa. Em seguida, transfira a placa do suporte magnético para o suporte da placa.

As contas de limpeza do Vortex RNA até que estejam bem dispersas e adicionem 99 microliters de contas à amostra. Pipeta para cima e para baixo para misturar, e incubar a placa em temperatura ambiente por 10 minutos. Transfira a placa para o suporte magnético, e deixe-a lá por cinco minutos ou até que a solução se limpe, depois remova e descarte todo o supernatante do poço.

Com a placa ainda no suporte magnético, adicione 200 microliters de 80% de etanol recém-preparado ao poço sem interromper as contas. Deixe o etanol no poço por 30 segundos, depois retire e descarte. Adicione 11 microliters de Amortecedor de Elução ao poço, e pipete-o para cima e para baixo para misturar.

Incubar a placa em temperatura ambiente por dois minutos, depois transfira-a de volta para o suporte magnético e mantenha-a lá até que a solução se limpe. Transfira 8,5 microliters do supernante para um novo poço na mesma placa, e adicione 8,5 microliters de Elute, Primer, Fragment High Mix para cada poço contendo uma amostra. Pipeta para cima e para baixo 10 vezes para misturar bem, selar a placa e incuba-la por oito minutos em um termociclador pré-aquecido a 94 graus Celsius.

Esfrie a amostra a quatro graus Celsius, remova a placa do termociclador e centrífugue-a brevemente. Dois kits de preparação da biblioteca, TruSeq e KAPA, foram avaliados para este protocolo. No geral, foi detectado um maior número de RNAs circulares e menor percentual de RNA ribossômico ao usar o kit TruSeq, de modo que truseq foi selecionado para outros experimentos.

A significância do pré-tratamento Rnase R foi avaliada comparando-se os dados gerados a partir de bibliotecas pré-tratadas e não pré-tratadas. Como esperado, um maior número de RNAs circulares foi consistentemente identificado nas bibliotecas pré-tratadas em comparação com as não pré-tratadas. A quantidade de RNA de entrada foi otimizada para detectar uma maior diversidade de RNAs circulares.

As bibliotecas foram preparadas utilizando um, dois e quatro microgramas de RNA de entrada, e a maior diversidade de espécies circulares de RNA foi observada ao utilizar quatro microgramas de RNA total. O protocolo otimizado foi utilizado para comparar abundâncias circulares de RNA em cinco regiões cerebrais de quatro doadores saudáveis e para outros tipos de tecidos de seis doadores saudáveis. No geral, observou-se maior abundância de RNase circular no cérebro em comparação com outros tipos de tecido.

É importante lembrar de seguir os procedimentos apropriados ao trabalhar com RNA, incluindo usar luvas, limpar completamente o banco e pipetas com lenços rnase ou spray antes de iniciar o protocolo, e manter o RNA no gelo de antemão. Após este procedimento, pode ser realizada validação ortogonal, como o sequenciamento Sanger de junções circRNA identificadas. A descoberta de novas circRNAs e mais evidências de sua presença esculpiram uma nova área de pesquisa para explorar suas funções biológicas.