Name: Uma abordagem de alimentação de anticorpos para estudar o tráfico de receptores de glutamato em culturas hipocampais primárias dissociadas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Aprenda a técnica de alimentação de anticorpos para estudar o tráfico de receptores de glutamato em culturas hipocampais primárias dissociadas. Este método versátil permite quantificar a expressão de superfície, internalização e reciclagem de receptores.

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Agradecemos ao centro noroeste de microscopia avançada para o uso do microscópio Nikon a1 confocal e sua assistência no planejamento e análise dos experimentos. Esta pesquisa foi apoiada por NIGMS (T32GM008061) (A. M. C.), e NIA (R00AG041225) e um jovem investigador NARSAD Grant do cérebro & Fundação de pesquisa do comportamento (#24133) (A. S.-C.).

O trabalho relativo à preparação da cultura preliminar hippocampal foi revisto e aprovado pelo Comitê do cuidado animal e do uso da Universidade de Northwestern (protocolo #IS00001151).
1. preparação antes da rotulagem
<ol><li>
Preparação e manutenção de culturas hipocampais primárias
	<ol>
<li>Prepare culturas hippocampal preliminares em uma densidade de 150.000 pilhas chapeadas em poli-D-lysine-revestido (0,1 mg/mL) 18 milímetros cobrem vidros. Excelentes guias para a preparação da cultura neuronal dissociada estão disponíveis7,8. Nota: Se necessário, as culturas podem ser tratadas com citosina arabinosídeo (ARA-C, 10 mM de DIV1) para evitar a proliferação glial na preparação. Nota: Reagentes de revestimento alternativos como fibronectina (1 mg/mL) ou laminina (5 mg/mL) podem ser usados em vez de poli-D-lisina.</li>
		<li>Manter culturas em uma incubadora de células a 37 ° c e 5% CO2 em 2 ml/poço de meios neurobasais suplementados com B27 e 2 mm L-glutamina. Nota: Substitutos para L-glutamina (por exemplo, Glutamax) pode ser usado, se desejado.</li>
		<li>Na base semanal, Remova metade do volume de mídia e substitua com o mesmo volume de meios neurobasais suplementados.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Opcional: transfection de receptores mutado e/ou epítopo-etiquetados Nota: os neurônios devem ser transfected pelo menos 3 – 4 dias antes do ponto de tempo de análise para permitir a expressão do receptor. O uso de neurônios jovens [dias in vitro 6 – 9 (DIV6)] resulta em melhor eficiência de transfecção do que os neurônios mais velhos (DIV15 – 20), mas um número suficiente de células transfectadas (> 20) pode ser alcançada independentemente da DIV empregada.<ol>
<li>Para cada poço de uma placa de 12 poços, diluir 1,5 μg de plasmídeo contendo o construto de interesse em 100 μL de meios neurobasais frescos sem suplementação de B27 ou glutamina em um tubo de microcentrífuga e misturar por vortexing rapidamente. Nota: Para o transfection bem sucedido, é crítico que os meios neurobasal usados são tão frescos como possível, idealmente menos de 1 semana após a abertura da garrafa.</li>
		<li>Num segundo tubo de microcentrifugação, misture 1 μL de um reagente de lipofecção adequado em 100 μl de meios neurobasais frescos e misture suavemente. Nota: Não vórtice a mistura de reagente de lipofecção. O uso de reagentes frescos da lipofecção pode melhorar a eficiência do transfection.</li>
		<li>Incubar os tubos durante 5 min à temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Adicione a mistura de reagente de lipofecção à mistura de DNA, misture suavemente e incubar durante 20 min em RT.</li>
		<li>Ajuste o volume de mídia em cada poço para 1 mL de mídia condicionada.</li>
		<li>Adicione o reagente de lipofecção-mistura de DNA gota gota para o poço.</li>
		<li>Retorne pilhas à incubadora e permita pelo menos 3 – 4 dias para a expressão da proteína. Nota: Para os propósitos dos protocolos de internalização e reciclagem descritos abaixo, os neurônios hipocampais foram transfectados em DIV11 – 12 com construções expressando GluN2B marcadas com GFP no domínio extracelular (GFP-GluN2B) e imaged em DIV15 – 16.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
OPCIONAL: incubação de células com fármacos (cronicamente ou agudamente) nos meios condicionados até a fixação. Nota: para o tratamento agudo, começar a tratar as células antes de rotulagem. Dependendo do protocolo de tratamento medicamentoso utilizado, as células podem ser mantidas em meios contendo medicamentos durante a seção 2. Em nosso exemplo, as células DIV21 estavam sujeitas a um protocolo de cLTP para aumentar a AMPAR de superfície expressa em9.<ol>
<li>Meios de comunicação condicionados para a solução extracelular (ECS).</li>
		<li>Trate as células com 300 μM de glicina em ECS durante 3 min em RT. Como um controle, tratar uma lamela irmã com ECS (sem glicina).</li>
		<li>Células de lavagem 3x com 37 ° c ECS e devolver as células em ECS (sem glicina) à incubadora de células durante 20 minutos antes de prosseguir com a secção 2. Nota: ECS (em mm): 150 NaCl, 2 CAcl2, 5 KCl, 10 HEPES, 30 glicose, 0, 1 TTX, 0, 1 estricnina e 0, 3 Picrotoxina em pH 7,4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. rotulagem ao vivo de receptores expressos na superfície
<ol><li>
Prepare coberturas para rotulagem
	<ol>
<li>Para conservar reagentes e facilitar a manipulação, transfira o lado da pilha dos COVERSLIP até uma bandeja película-coberta da parafina. Nota: É crítico nunca deixar as amostras secar.</li>
		<li>Guarde e mantenha suportes condicionados a 37 ° c para incubação e etapas de lavagem. Nota: Para uma lamínula de 18 mm, recomenda-se incubação com 75 – 100 μL de mídia para rotulagem de anticorpos e 120 – 150 μL para internalização/reciclagem.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Rotulagem de receptores de superfície com anticorpo primário
	<ol>
<li>Incubar células com anticorpo primário diluído em meios condicionados por 15 min em RT. Nota: Para os receptores GFP-etiquetados, o anticorpo do anti-GFP do coelho em uma diluição de 1:1000 foi usado. Para o GluA1 endógeno, o mouse anti-GluA1 em uma diluição 1:200 foi usado.</li>
		<li>Aspirar com cuidado os meios decontenção usando uma pipeta do vácuo e as pilhas da lavagem três vezes com meios condicionados. Nota: Se a mídia condicionada não estiver disponível, todas as etapas de lavagem podem ser executadas usando PBS + [tampão fosfato salina (PBS) contendo 1 mM MgCl2 e 0,1 mm CAcl2]. A aspiração manual usando uma micropipeta pode ser executada se a aspiração suave do vácuo não está disponível.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. expressão de superfície (Figura 2)
<ol><li>
Rotulagem de anticorpos secundários de receptores expressos na superfície
	<ol>
<li>Lave uma vez com PBS +.</li>
		<li>Fixar células incubando com paraformaldeído a 4% (PFA) e 4% de sacarose em PBS por 7 – 8 min. Nota: Diferentemente de outros métodos de fixação, como a incubação de metanol, a PFA não permeabiliza a membrana plasmática e, portanto, é adequada para a análise da expressão superficial. Para obter resultados ideais, use o PFA preparado na hora. O armazenamento a curto prazo de PFA no armazenamento de 4 ° c ou a longo prazo (até 30 dias) a-20 ° c é permissivo para a fixação adequada. Atenção: O PFA é um carcinógeno conhecido. Use equipamento de proteção pessoal adequado e um capuz de segurança ao manusear.</li>
		<li>Lave as células três vezes com PBS regular. Nota: Alternativamente, a glicina de 0,1 M pode ser usada lavando PFA em vez de PBS, porque a glicina extinguirá todo o fixador restante que pode aumentar o fundo na preparação.</li>
		<li>Bloqueie locais de ligação não específicos incubando com soro de cabra normal a 10% (NGS) em PBS por 30 min em RT. Nota: O tempo de bloqueio pode ser estendido sem efeitos adversos na rotulagem.</li>
		<li>Incubar com anticorpo secundário fluorescently-etiquetado diluído em 3% NGS em PBS para 1 h em RT para etiquetar os receptores anticorpo-etiquetados preliminares (isto é, superfície-expressado). Nota: Nestes exemplos, uma diluição 1:500 de anticorpos secundários de Alexa 555-conjugated: o anti-coelho da cabra para receptores GFP-etiquetados e o anti-rato da cabra para GluA1 foram usados.</li>
		<li>Lave as células com PBS 3x.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Rotulagem de receptores intracelulares
	<ol>
<li>Células de permeabilização com 0,25% Triton X-100 em PBS por 5 – 10 min em RT. Nota: Para verificar que a rodada inicial de rotulagem de anticorpos ocupa todos os Epitopes de superfície, esta etapa de permeabilização pode ser ignorada em uma cultura irmã. Neste caso, não deve ser obtido nenhum sinal para receptores intracelulares. Adicionalmente, para verificar que nenhum receptor interno foi etiquetado na seção precedente 2 (isto é, mostrando a integridade das membranas do plasma na cultura), a etapa da permeabilização pode ser ignorada em uma cultura da irmã, e um anticorpo preliminar de encontro a um a proteína intracelular (por exemplo, PSD-95 ou MAP2) pode ser utilizada na etapa 2.2.1. Nenhum sinal deve ser obtido a partir deste primário nestas condições. Neste caso, foi utilizado um anticorpo anti-PSD-95 coelho (1:500).</li>
		<li>Bloco com 10% NGS em PBS por 30 min em RT.</li>
		<li>Rotule receptores intracelulares incubando células permeabilizadas com o mesmo anticorpo primário utilizado na seção 2,2 diluída em 3% NGS em PBS por 1 h em RT. Nota: A diluição do anticorpo para etiquetar receptores intracelular pode ser diferente do que aquela exigida para etiquetar receptores superfície-expressados. No exemplo de GluA1, a mesma diluição do anticorpo (1:200) foi usada.</li>
		<li>Lave as células 3x com PBS.</li>
		<li>Etiqueta com o segundo anticorpo secundário fluorescently-etiquetado diluído em 3% NGS em PBS para 1 h em RT. Nota: Nestes exemplos, uma diluição 1:500 do anticorpo secundário do Alexa 647-conjugated da cabra do rato (para GluA1) foi usada.</li>
		<li>Lave as células 3x com PBS.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. internalização (Figura 3)
<ol><li>
Internalização de receptores de superfície rotulados por anticorpos
	<ol>
<li>Após a rotulagem de receptores de superfície-expressos e de lavagem do anticorpo (seção 2,2), mantenha pilhas em meios condicionados sem anticorpo e retorne-os à incubadora (37 ° c) para permitir o Internalization. Nota: Para os receptores NMDA, recomenda-se 30 min para internalização. Como controle, uma cultura irmã pode ser mantida com meios condicionados a 4 ° c durante o processo de internalização. A internalização mínima do receptor deve ocorrer nessas condições.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Rotulagem de receptores de superfície
	<ol>
<li>Lave as células uma vez com PBS +.</li>
		<li>Fixar células com 4% de PFA e 4% de sacarose em PBS por 7 – 8 min. Atenção: Use o equipamento de proteção pessoal apropriado e uma capa de segurança ao segurar o PFA.</li>
		<li>Lave as células 3x com PBS regular.</li>
		<li>Bloco com 10% NGS em PBS por 30 min em RT para evitar ligação não específica.</li>
		<li>Incubar amostras com anticorpo secundário fluorescently-etiquetado diluído em 3% NGS em PBS para 1 h em RT para etiquetar receptores anticorpo-etiquetados preliminares (isto é, receptores superfície-expressados que não foram internalizados). Nota: Para este exemplo, foi utilizado o anticorpo secundário de cabra conjugada com Alexa 555 (1:500) para rotulagem.</li>
		<li>Lave as células 3x com PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Rotulagem de receptores internalizados
	<ol>
<li>Células de permeabilização com 0,25% Triton X-100 em PBS por 5 – 10 min.</li>
		<li>Bloqueie a ligação não específica por incubação com 10% de NGS em PBS por 30 min em RT.</li>
		<li>Incubar amostras com anticorpo secundário cDNAs etiquetado diluído em 3% NGS em PBS para 1 h em RT para etiquetar receptores anticorpo-etiquetados internalizado. Nota: Para este exemplo, Alexa 647-conjugado de cabra anti-coelho anticorpo secundário (1:500) é usado para a rotulagem.</li>
		<li>Lave as células 3x com PBS.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. reciclagem (Figura 4)
<ol><li>
Internalização de receptores de superfície rotulados por anticorpos
	<ol>
<li>Após a rotulagem de receptores de superfície-expressos e de lavagem do anticorpo (seção 2,2), mantenha pilhas em meios condicionados sem anticorpo e retorne-os à incubadora (37 ° c) para permitir o Internalization. Nota: Para os receptores NMDA, recomenda-se 30 min para internalização.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bloqueio de receptores de superfície estáveis expressos
	<ol>
<li>Para obstruir os resumos no anticorpo preliminar Unido aos receptores superfície-expressados que não foram internalizados, incubar pilhas com os fragmentos não conjugada do anticorpo de fab anti-IgG (H + L) (de encontro ao preliminar usado na seção 2,2) diluído em meios condicionados ( 20 μg/mL) durante 20 min em RT. Este tratamento impede a interação futura com anticorpos secundários. Nota: Para este exemplo, foram utilizados fragmentos de cabra anti-coelho fab. Nota: Experimento de controle: para garantir que o bloqueio completo dos receptores expressos em superfície tenha ocorrido, as coberturas da irmã podem ser incubadas com e sem fab. As culturas devem ser fixadas imediatamente após o tratamento FAB, e ambas as culturas são incubadas com o anticorpo secundário de Alexa 555-conjugados. Nenhum sinal de Alexa 555 nas pilhas Fab-incubated indica o bloqueio apropriado do anticorpo.</li>
		<li>Lave as células 3x com mídia condicionada.</li>
		<li>Incubar pilhas com meios condicionados que contêm o dynasore de 80 μm para impedir mais internalização e pilhas do retorno à incubadora (° c 37) para permitir recicl de receptores internalizado. Dynasore é um inibidor de GTPase que inibe dynamin e, portanto, impede a internalização. Nota: 45 min para a reciclagem NMDAR é recomendado. Observe que Dynasore bloqueia exclusivamente o processo de internalização dependente de dynamin (por exemplo, internalização de NMDARs). Entretanto, a internalização de outra proteína sináptica (dynamin-Independent) ainda pode ocorrer na presença de Dynasore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Rotulagem de receptores reciclados
	<ol>
<li>Lave as células uma vez com PBS +.</li>
		<li>Fixar células com 4% de PFA e 4% de sacarose em PBS por 7 – 8 min. Atenção: Use o equipamento de proteção pessoal apropriado e uma capa de segurança ao segurar o PFA.</li>
		<li>Lave as células 3x com PBS.</li>
		<li>Bloco com 10% NGS em PBS por 30 min em RT para evitar ligação não específica.</li>
		<li>Células da etiqueta com o primeiro anticorpo secundário fluorescently-etiquetado diluído em 3% NGS em PBS para 1 h em RT. Nota: Para este exemplo, o anticorpo do anti-coelho da cabra de Alexa 555-conjugated (1:500) foi usado para etiquetar.</li>
		<li>Lave as células 3x com PBS. Nota: Lavas mais longas com PBS (5 – 10 min) podem ajudar a reduzir o fundo na preparação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Rotulagem de receptores internalizados
	<ol>
<li>Células de permeabilização com 0,25% Triton X-100 em PBS por 5 – 10 min.</li>
		<li>Bloco com 10% NGS em PBS por 30 min em RT.</li>
		<li>Etiqueta com o segundo anticorpo secundário fluorescently-etiquetado diluído em 3% NGS em PBS para 1 h em RT. Nota: Para este exemplo, o anticorpo do anti-coelho da cabra de Alexa 647-conjugated (1:500) foi usado para etiquetar.</li>
		<li>Lave as células 3x com PBS.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. montagem e imagem latente das amostras
<ol><li>Monte as células colocando suavemente o lado da célula de lamelas em 12 – 15 mL da mídia de montagem apropriada. Nota: A aspiração de suportes de montagem em excesso melhorará a qualidade das imagens.</li>
	<li>Células de imagem em um microscópio confocal apropriado. Nota: Recomenda-se a imagem de uma z-pilha em 60x ampliação com 0,35 μm passos, abrangendo toda a espessura do Neuron.</li>
</ol>7. considerações de tempo
<ol><li>Este é um protocolo longo que pode ser interrompido em vários pontos. Se desejado, realize a obstrução e as etapas preliminares da incubação do anticorpo durante a noite em 4 ° c em uma câmara húmida.</li>
	<li>
Alternativamente, se desejado, use um processador do tecido da microonda para acelerar vastamente acima dos tempos da incubação da borne-fixação. Para todas as etapas, use 150 W a 30 ° c para configurações "on".
	<ol>
<li>Para bloquear, execute o processador em 2 min "on", 1 min "off" e 2 min "on".</li>
		<li>Para etapas de incubação de anticorpos primários e secundários, execute o processador em 3 min "on", 2 min "off" e 3 min "on". Nota: Não observamos diferença na qualidade ao fazer as alterações acima do protocolo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. análise de imagem
<ol><li>É recomendável usar FIJI < https://Fiji.SC/> para realizar a análise de imagem, pois é compatível com vários formatos de arquivo. Para os nossos dados, as imagens no formato de arquivo Nikon ND2 foram adquiridas.</li>
	<li>Um script de macro é fornecido para a quantificação fácil de lotes de diferentes parâmetros pré-selecionados por FIJI. As etapas a seguir estão incluídas na macro: Nota: Para estes exemplos, a "intensidade integrada" foi medida.</li>
	<li>Abra os arquivos de imagem em FIJI e canais separados.</li>
	<li>Z-projetar cada pilha de canal como uma projeção de intensidade máxima.</li>
	<li>Defina um limite inferior para cada canal. Nota: Os limiares devem ser empiricamente determinados para cada conjunto de dados experimentais. Embora cada canal possa ter um valor de limite inferior separado, é crucial que os valores de limite de canal sejam consistentemente mantidos para todas as imagens do mesmo conjunto de dados.</li>
	<li>Selecione três a cinco dendritos secundários ou terciários e salve-os como regiões de interesse (ROIs).</li>
	<li>Meça a densidade integrada de cada ROI em canais superficiais e intracelulares.</li>
	<li>Normalize o sinal para cada ROI dividindo o valor de densidade integrado do canal de superfície pelo canal intracelular.</li>
	<li>Repita as medições para todas as imagens de controle e experimentais e normalizar valores experimentais para controlar valores (por exemplo, GluN2B WT ou condições de não-glicina).</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A interação entre uma célula e seu ambiente (por exemplo, comunicação com outras células, resposta a diferentes estímulos, etc.), depende fortemente da expressão correta dos receptores na superfície celular. O Regulamento rápido e fino-ajustado no conteúdo superfície-expressado do receptor permite a resposta celular apropriada a um ambiente constantemente em mudança. No caso particular dos neurônios, alterações no número, localização, e composição subunidade de receptores sináticamente expressos influencia fortemente a c...

As células utilizam o processo ativo de tráfico para mobilizar proteínas para localizações subcelulares específicas e exercer rigorosa regulação espaciotemporal sobre sua função1. Esse processo é especialmente importante para os receptores transmembranares, pois as respostas celulares a diferentes estímulos ambientais dependem de cascatas intracelulares desencadeadas pela ativação do receptor. As células são capazes de modificar essas respostas alterando a densidade, localização e composição da subunidade de receptores expressos na superfície celular através da regulação do tráfico subcelular receptor2. A inserção de receptores recém-sintetizados na membrana plasmática, juntamente com a endocitose e a reciclagem de receptores existentes são exemplos de processos de tráfico que determinam o pool líquido de receptores expressos na superfície2. Muitos mecanismos moleculares cooperam para regular o tráfico de proteínas, incluindo interações proteína-proteína e modificações pós-translacionais, como fosforilação, ubiquitinação ou palmitilação2.
A regulação do tráfico de receptores é particularmente necessária em células fortemente polarizadas com estruturas altamente especializadas. O exemplo paradigmático é o controle da função neuronal pelo tráfico regulamentado de receptores de glutamato (glurs)3,4. O glutamato, o principal neurotransmissor excitatória, liga e ativa os GluRs expressos em superfície para controlar funções neuronais fisiológicas fundamentais, como neurotransmissão sináptica e plasticidade sináptica. O fato de que o tráfico de GluR alterado tem sido observado em um amplo espectro de neuropatias, variando de distúrbios do neurodesenvolvimento a doenças neurodegenerativas, destaca a importância desse processo5. Assim, compreender os acontecimentos moleculares que controlam o tráfico de GluR é de interesse em muitas áreas de pesquisa.
Neste protocolo, um método baseado anticorpo-alimentando é usado para quantificar o nível de GluRs superfície-expressados em neurônios hippocampal preliminares assim como para avaliar como as mudanças na internalização e na reciclagem resultam na expressão líquida observada da superfície. O uso de farmacologia e/ou superexpressão de receptores exógenos que abrigando mutações específicas torna este protocolo uma abordagem particularmente poderosa para o estudo de mecanismos moleculares subjacentes à adaptação neuronal a diferentes estímulos ambientais. Um exemplo final da utilidade deste protocolo é estudar como as mudanças multifatoriais no ambiente (como em modelos de uma doença) afetam o tráfico de GluR através do exame da expressão de superfície em tais modelos.
Usando exemplos específicos, é demonstrado inicialmente como uma manipulação farmacológica que imita a estimulação sináptica physiological [LTP químico (CLTP)] aumenta a expressão de superfície da subunidade endógena do GluA1 do AMPA-tipo de glurs (ampars) 6. o tráfico de uma forma fosfomimética superexpressa da subunidade GluN2B do NMDA-tipo de GluRs (NMDARs) também é analisado para exemplificar como esse protocolo pode ser usado para estudar a regulação do tráfico de GluR por Modificações. Embora estes exemplos específicos sejam usados, este protocolo pode facilmente ser aplicado a outros glurs e outros receptores e proteínas que possuem domínios extracelular antigénicos. No caso de não existirem anticorpos disponíveis para os domínios extracelulares, a superexpressão do epitope-etiquetado extracelular (por exemplo, as proteínas Flag-, Myc-, GFP-Tagged, etc.) podem auxiliar na rotulagem de proteínas.
O protocolo atual fornece instruções para quantificar a densidade específica do subtipo GluR e o tráfico usando anticorpos específicos. Este protocolo pode ser utilizado para estudar 1) expressão de superfície GluR total, 2) internalização GluR e 3) reciclagem de GluR. Para estudar cada processo individualmente, é aconselhável começar com as secções 1 e 2 e continuar com a secção 3, 4 ou 5. Em todos os casos, termine com as secções 6 e 8 (Figura 1).

<table><tbody><tr><td>18 mm de diâmetro. #1.5 óculos de cobertura de espessura</td><td>Neuvitro</td><td>GG181.5</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555-conjugado cabra anti-rato secundário</td><td>Life Technologies</td><td>A21424</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555-conjugado cabra anti-coelho secundário</td><td>Life Technologies</td><td>A21429</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 647-conjugado cabra anti-rato secundário</td><td>Life Technologies</td><td>A21236</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 647-conjugado cabra anti-coelho secundário</td><td>Life Technologies</td><td>A21245</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Placas de Cultura de Células de Fundo Plano</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>Dynasore</td><td>Tocris</td><td>2897</td><td></td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Tocris</td><td>0219</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-coelho Fab fragmentos</td><td>Sigma</td><td>SAB3700970</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H7006</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anticorpo anti-GluA1</td><td>Millipore</td><td>MAB2263</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S6546</td><td></td></tr><tr><td>Mídia neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>NGS</td><td>Abcam</td><td>Ab7481</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM999</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Pelco BioWave</td><td>Ted Pella</td><td>36500</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Alfa Aesar</td><td>43368</td><td></td></tr><tr><td>Picrotoxina</td><td>Tocris</td><td>1128</td><td></td></tr><tr><td>Bromidrato de poli-D-lisina</td><td>Sigma</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Life Technologies</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-GFP para coelho</td><td>Invitrogen</td><td>A11122</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-PSD-95 para coelho</td><td>Sinalização celular</td><td>2507</td><td></td></tr><tr><td>Strychnine</td><td>Tocris</td><td>2785</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost mais lâminas de microscópio</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>TTX</td><td>Tocris</td><td>1078</td><td></td></tr></tbody></table>

uma abordagem de alimentação de anticorpos para estudar o tráfico de receptores de glutamato em culturas hipocampais primárias dissociadas

An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures

Respostas celulares a estímulos externos dependem fortemente do conjunto de receptores expressos na superfície celular em um determinado momento. Assim, a população de receptores de superfície expressa está constantemente se adaptando e sujeita a rigorosos mecanismos de regulação. O exemplo paradigmático e um dos eventos de tráfico mais estudados em biologia é o controle regulado da expressão sináptica de receptores de glutamato (GluRs). Os GluRs mediam a grande maioria da neurotransmissão excitatória no sistema nervoso central e controlam mudanças funcionais e estruturais dependentes da atividade fisiológica nos níveis sinápticos e neuronais (por exemplo, plasticidade sináptica). As modificações no número, na posição, e na composição do subunidade de glurs expressados superfície afetam profundamente a função neuronal e, de facto, as alterações nestes fatores são associadas com os neuropathies diferentes. Aqui apresentamos um método para estudar o tráfico de GluR em neurônios primários hipocampais dissociados. Uma abordagem de "alimentação de anticorpos" é usada para visualizar diferencialmente as populações de GluR expressas na superfície e nas membranas internas. Ao rotular receptores de superfície em células ao vivo e fixá-los em momentos diferentes para permitir a endocitose e/ou reciclagem de receptores, esses processos de tráfico podem ser avaliados e seletivamente estudados. Este é um protocolo versátil que pode ser usado em combinação com abordagens farmacológicas ou superexpressão de receptores alterados para obter informações valiosas sobre estímulos e mecanismos moleculares que afetam o tráfico de GluR. Similarmente, pode facilmente ser adaptado para estudar outros receptores ou proteínas expressadas superfície.

Este protocolo para estudar o tráfico de receptores de glutamato é baseado na rotulagem diferencial dos receptores expressos na superfície celular e naqueles expressos em membranas internas. A segregação é conseguida pela rotulagem dos receptores antes e após a permeabilização da membrana, utilizando o mesmo anticorpo primário, mas um anticorpo secundário conjugado com um fluoróforo diferente. Como descrito pelas etapas opcionais incluíram o protocolo, trata-se de um método muito versátil...

Este artigo apresenta um método para estudar o tráfico de receptores de glutamato (GluR) em culturas hipocampais primárias dissociadas. Usando uma abordagem de alimentação de anticorpos para rotular receptores endógenos ou superexpressos em combinação com abordagens farmacológicas, este método permite a identificação de mecanismos moleculares que regulam a expressão da superfície GluR modulando processos de internalização ou reciclagem.

Uma abordagem de alimentação de anticorpos para estudar o tráfico de receptores de glutamato em culturas hipocampais primárias dissociadas

Cellular responses to external stimuli heavily rely on the set of receptors expressed at the cell surface at a given moment. Accordingly, the population ...

As respostas celulares aos estímulos externos dependem fortemente do conjunto de proteínas que são expressas na superfície celular em um dado momento. Assim, o número, a localização subcelular e a composição subunidade dessas proteínas são controlados dinamicamente. Aqui, usaremos uma abordagem de alimentação de anticorpos para quantificar o nível de receptores expressos na superfície nas culturas celulares, desde que a internalização e a reciclagem retomem.Trata-se de um protocolo muito versátil, que fornece informações mecanicistas da regulação das proteínas expressas em superfície. Em nosso exemplo, estudaremos receptores de glutamina em neurônios hipocampais primários. Este protocolo pode ser adaptado a qualquer proteína que possua um epítope extracelular anagênico, se os anticorpos não estão disponíveis, a transvecção de construções marcadas pode ser útil tanto para rotular quanto para estudar mutações específicas.Em nossos exemplos, usamos anticorpos contra glua1 endógeno, e marcamos Glu12 B.To iniciar este procedimento, transferir a capa desliza lado da célula até uma bandeja coberta de filme de parafina, para salvar reagentes e facilitar a manipulação. Salve e mantenha a mídia condicionada a 37 graus Celsius para incubação e lavagem de passos. Incubar as células com anticorpos primários diluídos em mídia condicionada, em temperatura ambiente, por 15 minutos.Depois disso, use uma pipeta de vácuo para aspirar cuidadosamente o anticorpo que contém mídia, e lave as células três vezes com mídia condicionada. Se estudar a expressão superficial versus receptor intracelular fixe as células com paraformaldeído após esta etapa, conforme descrito no protocolo de texto. Mantenha as células em mídia condicionada sem anticorpos, e devolva-as à incubadora a 37 graus Celsius para permitir a internalização.Se estudar o processo de internalização, fixar as células com paraformaldeído após esta etapa, conforme descrito no protocolo de texto. Para bloquear os epítopos do anticorpo primário ligado à superfície, os receptores expressos que não foram internalizados, incubam células com fragmentos de anticorpos anti-IgG fab não julgados diluídos em mídia condicionada, por 20 minutos à temperatura ambiente. Depois disso, lave as células três vezes com mídia condicionada.Incubar os poços lavados com mídia condicionada contendo 80 dynasores micromolar, a 37 graus Celsius, para permitir a reciclagem de receptores internalizados. Depois de terminar as modificações em células vivas, lave as células uma vez com PBS plus. Adicione uma solução de 4% de paraformaldeído e 4% de sacarose em PBS às células, e incubar em um capô de fumaça à temperatura ambiente por sete a oito minutos, para consertar as células.Em seguida, lave as células três vezes com PBS regular. Adicione uma solução de soro de cabra 10% normal em PBS às células e incubar à temperatura ambiente por 30 minutos, para bloquear locais de ligação não específicos. Em seguida, incubar as células com anticorpo secundário fluorescente com marcação fluorescente diluída em 3%NGS em PBS em temperatura ambiente por uma hora, para rotular receptores de rótulos de anticorpos primários.Depois disso, lave as células três vezes com PBS. Para começar a rotular os receptores intracelulares, adicione uma solução de 0,25% TritonX em PBS e incubar à temperatura ambiente por cinco a 10 minutos, para permeabiliizar as células. Em seguida, bloqueie com 10% de NGS em temperatura ambiente por 30 minutos.Se estudar superfície versus total, incubar as células com o mesmo anticorpo primário usado anteriormente, diluído com 3%NGS em PBS, em temperatura ambiente por uma hora, para rotular os receptores intracelulares. Em seguida, lave as células três vezes com PBS. Etiqueta com segundo anticorpo secundário marcado fluorescentemente, diluído em 3% NGS em PBS, em temperatura ambiente por uma hora.Depois desta lavagem as células três vezes com PBS. Primeiro coloque suavemente os deslizamentos de cobertura, lado da célula para baixo, em 12 a 15 microliters da mídia de montagem apropriada para montar as células. Em seguida, imagem as células no microscópio confocal apropriado, e analisar as células como descrito no protocolo de texto.Este protocolo para estudar o tráfico de receptores de glutamato baseia-se na rotulagem diferencial dos receptores, expressos na superfície celular, e aqueles expressos em membranas internas. Após a aquisição de imagens confocal, o sinal fluorescente pode ser facilmente quantificado para mostrar um aumento na expressão da superfície, em relação à população intracelular, seguindo a LTP química. Nenhum sinal para PSD-95 pode ser obtido em células não permeabilizadas, demonstrando a integridade da membrana plasmática.Isso indica que o sinal obtido para a superfície GluA1 corresponde de fato aos receptores expressos na superfície. É importante ressaltar que um sinal mínimo para GluA1 internalizado pode ser observado em condições de não permeabilização, mostrando que todos os epítopos de superfície são ocupados pela rodada inicial de rotulagem de anticorpos. Os receptores que foram internalizados são então identificados.Este exemplo destaca que a fosforilação GluN2B em S1480 promove a internalização do receptor. Como o mutante fosfomimetic S1480E apresentou uma taxa de internalização muito maior em comparação com receptores do tipo selvagem. Como esperado, nenhum sinal é obtido para receptores internalizados no controle.Em seguida, são identificados receptores reciclados e receptores internalizados. A razão de reciclagem gerada mostra que o GluN2B S1480E não tem efeito na reciclagem do NMDAR. No controle, pode-se observar um sinal forte para o GluN2B expresso na superfície expressa na ausência de bloqueio fab.Este sinal desaparece nas culturas tratadas pela Fab, demonstrando que o protocolo de bloqueio é suficiente para bloquear completamente os epítopos expressos da superfície, e que os sinais de superfície observados após a reciclagem correspondem de fato aos receptores traficados de volta para a membrana plasmática. O protocolo atual é apenas um dos métodos disponíveis para estudar a regulação de proteínas expressas em superfície. Outras abordagens podem ser tomadas para expandir ou verificar os dados obtidos aqui.Estes incluem métodos bioquímicos, como biotinilação, técnicas de imagem de vida ou abordagens funcionais, como eletrofisiologia ou imagem de cálcio. Usamos PFA para congelar a localização de receptores, porém o PFA é um cancerígeno conhecido, por isso é crucial executar etapas usando PFA sob um capô de fumaça, enquanto usa EPI apropriado.

an-antibody-feeding-approach-to-study-glutamate-receptor-trafficking

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo demonstra uma abordagem de alimentação com anticorpos para estudar o tráfego de receptores de glutamato em culturas neuronais primárias do hipocampo. Essa abordagem permite a observação de populações de receptores nas membranas plasmática e interna. A discriminação entre esses subconjuntos é obtida marcando os receptores antes e depois da permeabilização da membrana, usando o mesmo anticorpo primário, mas anticorpos secundários conjugados a diferentes fluoróforos.

Uma técnica in vitro para estudar o tráfego de receptores de glutamato em neurônios do hipocampo

Descreve-se um método para marcar a proteína na superfície de neurónios vivos utilizando um anticorpo policlonal específico para epitopos extracelulares. A proteína ligada pelo anticorpo na superfície da célula e subsequentemente internalizados através de endocitose podem ser distinguidas a partir de proteína restante na, ou vendidas para, a superfície durante a incubação.

Rotulagem diferencial de superfície celular e internalizado Proteínas após Anticorpo Alimentação da Vivo Cultivadas neurônios

Aqui demonstramos a utilização do corante fluorescente Alexa acoplado a α-bungarotoxina para medir GABA A localização do receptor de superfície e endocitose em neurónios do hipocampo. Através da utilização de construções que ostentam uma marca curta extracelular que se liga α-bungarotoxina, análise de proteína da membrana plasmática do tráfico endocítica pode ser alcançado.

Usando um α-Bungarotoxina Binding Tag Site para Estudar GABA um receptor de membrana Localização e Tráfico

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Formação Sinapse Inibitória em uma co-cultura-tipo que comportem GABAérgicos espinhosos médios neurônios e células HEK293 expressando estavelmente GABA A Receptores

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Aprenda a técnica de alimentação de anticorpos para estudar o tráfico de receptores de glutamato em culturas hipocampais primárias dissociadas. Este método versátil permite quantificar a expressão de superfície, internalização e reciclagem de receptores.

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