Murine Modelo de Transplante de Aorta Cervical usando uma técnica de manguito não sutura modificada
2 de novembro de 2019
Aqui, apresentamos um protocolo de transplante heterotópico da aorta em camundongos usando a técnica de manguito não sutura em um modelo de urina cervical. Este modelo pode ser usado para estudar a patologia subjacente da vasculopatia aloenxerto crônica (CAV) e pode ajudar a avaliar novos agentes terapêuticos, a fim de evitar a sua formação.
Sou Martin Ryll, dos laboratórios de pesquisa do Departamento de Cirurgia Geral, Visceral e transplantada da LMU em Munique. Hoje vamos mostrar um modelo de transplante aórtico heterotópico murine usando uma técnica modificada de manguito não sutura. Primeiro, anestesiar o animal receptor com uma injeção intraperitoneal de midazolam, medetomidina e fentanil.
Corte todos os cabelos da região lateral cervical com um cortador de cabelo elétrico para animais pequenos e aplique pomada oftalmica com cotonetes de algodão para evitar que os olhos sequem durante o procedimento. Coloque o animal na posição supina em uma almofada de aquecimento sob o microscópio e grave suavemente as pernas na mesa de operação com tiras de gesso sensíveis à pele. Incline a cabeça para trás e esfregue o campo operacional várias vezes com álcool.
Faça uma incisão de pele da incisão jugular para a mandíbula inferior direita com uma tesoura pequena. Remova o lobo inferior direito da glândula submandibular através de cautery bipolar do pediculo do vaso e excisão subsequente com micro tesoura. Remova o músculo estenicleidomastoide direito através do cautery bipolar da porção superior e inferior e excisão subsequente com micro tesoura para ter acesso à artéria carótida comum.
Mobilize a artéria carótida comum o mais longe possível, puxando o tecido conjuntivo circundante com fórceps finos. Amarre duas ligaduras de seda 7-0 com distância mínima entre si ao redor do meio da artéria carótida comum e transecte a artéria carótida comum com micro tesoura fina entre as ligaduras. Passe a extremidade ligada proximal através da braçadeira e fixe-a com um pequeno grampo de artéria.
Remova a ligadura com uma micro tesoura fina o mais próximo possível da ligadura e lave o lúmen com soro fisiológico heparinizado com uma agulha calibre 30, tomando cuidado para não danificar as paredes do vaso. Distende o lúmen aberto usando dilatadores vasculares finos e inverta o toco carótida sobre o manguito puxando-o suavemente sobre o tubo de poliamida. Fixar imediatamente a carótida invertida com um laço de seda 7-0 vagamente pré-amarrado.
Realize o mesmo procedimento na outra extremidade da artéria carótida com a outra braçadeira. Passe a extremidade distal ligada através da braçadeira e fixe-a com um grampo de artéria pequeno. Remova a ligadura com uma micro tesoura fina o mais próximo possível da ligadura e lave o lúmen com soro fisiológico heparinizado com uma agulha calibre 30, tomando cuidado para não danificar as paredes do vaso.
Distende o lúmen aberto usando dilatadores vasculares finos e inverta o toco carótida sobre o manguito puxando-o suavemente sobre o tubo de poliamida. Fixar imediatamente a carótida invertida com um laço de seda 7-0 vagamente pré-amarrado. Desista o animal receptor e hidrate o dois terço superior com soro fisiológico até que o segmento aórtico seja explantado.
Anestesiar o rato doador da mesma forma que o animal receptor. Corte todos os cabelos da região abdominal e torácica com um cortador de cabelo elétrico para animais pequenos e aplique pomada oftalmica com cotonetes de algodão para evitar que os olhos sequem durante o procedimento. Coloque o animal na posição supina em uma almofada de aquecimento sob o microscópio e grave suavemente as pernas na mesa de operação com tiras de gesso sensíveis à pele.
Esfregue o campo operacional várias vezes com álcool. Realize uma laparotomia abdominal média com uma tesoura pequena e empurre os intestinos ligeiramente para cima para expor a cava vena inferior. Injete o IVC com um cc de soro fisiológico heparinizado usando uma agulha calibre 30.
Corte a aorta abdominal e o IVC abaixo das artérias renais com uma pequena tesoura para exsanguinar o animal doador. Coloque uma compressa no abdômen para absorver o sangue. Realize uma toracotomia através de desvio bilateral das costelas com tesouras e incline a parede do peito anterior cranialmente com um grampo cirúrgico para expor o mediastino.
Corte o IVC e o esôfago diretamente acima do diafragma com micro tesoura. Remova o coração e os pulmões titulando-os para cima com fórceps segurando o IVC cortado e o esôfago e, em seguida, excisá-los com micro tesouras da base para ter acesso à aorta torácica e ao mediastino dorsal. Mobilize a aorta torácica de seu tecido circundante, retirando o tecido conjuntivo circundante e a gordura com fórceps finos, tomando cuidado para não danificar nenhuma artéria intercostal.
Cauterize todos os ramos da aorta torácica com fórceps cautery bipolares e extirpe o segmento aórtico entre o diafragma e o arco aórtico usando micro tesoura. Lave o segmento aórtico excisado com soro fisiológico heparinizado com uma agulha calibre 30, tomando cuidado para não danificar as paredes do vaso para remover qualquer sangue ou coágulos restantes e transferir o enxerto para o animal receptor. Puxe a extremidade proximal do segmento aórtico do doador sobre o manguito proximal em cima da artéria carótida invertida com fórceps finos e fixe-o imediatamente com um laço de seda 7-0 vagamente pré-amarrado.
Apare a extremidade livre distal do enxerto aórtico com micro tesoura para que o comprimento do enxerto se encaixe na distância entre as duas algemas. Puxe a extremidade distal do segmento aórtico do doador sobre o manguito distal em cima da artéria carótida invertida com fórceps finos e fixe-o imediatamente com um laço de seda 7-0 vagamente pré-amarrado. Remova primeiro o grampo distal para permitir a perfusão retrógrada.
Após atingir a hemostasia, remova o grampo proximal para completar a anastomose. Por fim, feche a ferida com sutura contínua de 6-0. Após 28 dias, os animais são sacrificados e os enxertos preservados para coloração histológica.
Como mostrado nestes furos de Van-Gieson de seções aórticas, as aortas alografadas totalmente mhc incompatíveis de doadores balb/c para seis receptores pretos desenvolveram uma hiperplasia neointimal significativa resultando em estreitamento luminal. Por outro lado, transplantes aórticos síngênicos de seis doadores negros para seis receptores negros desenvolveram apenas pouca hiperplasia neointimal. A coloração da imunofluorescência contra o SM22, um marcador para células musculares lisas vasculares, como mostrado neste quadro em fluorescência verde, demonstra que o neointima consiste principalmente de células musculares lisas vasculares.
O transplante aórtico murina serve como modelo para vasculopatia de transplante crônico que é a causa mais comum de falha tardia do enxerto. Em comparação com o modelo abdominal ortotópico, nossa técnica de manguito modificado é menos microcirúrgica exigindo uma alta taxa de sucesso. Além disso, devido ao diâmetro constante da braçadeira, variações da anastomose vascular vistas em outros modelos de transplante microcirúrgico podem ser negligenciadas.
Além disso, o tempo isquêmico quente é mantido constante em todos os grupos experimentais, à medida que o animal receptor é preparado primeiro antes do segmento aórtico ser explantado. Nosso modelo modificado deve ajudar outros laboratórios a estabelecer transplantes aórticos murinas.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para transplantação aórtica heterotópica em camundongos usando uma técnica de manguito sem sutura. Este modelo murino cervical é projetado para estudar a vasculopatia crônica do enxerto (CAV) e avaliar novos agentes terapêuticos para prevenir sua formação.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia do Transplante
- Biologia Vascular
- Cirurgia Experimental
Fundamentos
- A vasculopatia crônica do enxerto (CAV) é uma complicação significativa no transplante.
- Compreender a CAV pode levar a melhores estratégias terapêuticas.
- Modelos animais são essenciais para estudar patologias relacionadas ao transplante.
- A técnica de manguito sem sutura oferece uma abordagem nova para o transplante aórtico.
Propósito do Estudo
- Apresentar um modelo murino confiável para estudar a CAV.
- Avaliar a eficácia de novos agentes terapêuticos na prevenção da CAV.
- Refinar técnicas cirúrgicas na pesquisa de transplantes.
Métodos Utilizados
- Anestesia dos camundongos receptores usando midazolam, medetomidina e fentanil.
- Preparação do local cirúrgico por meio de corte de pelos e aplicação de pomada oftálmica.
- Posicionamento do animal em uma almofada térmica para condições cirúrgicas ideais.
- Utilização de uma técnica de manguito sem sutura para transplante aórtico.
Principais Resultados
- A técnica de manguito sem sutura facilita com sucesso o transplante aórtico.
- Este modelo permite a avaliação do desenvolvimento da CAV.
- Agentes terapêuticos potenciais podem ser avaliados usando este modelo.
- Uma melhor compreensão da fisiopatologia da CAV é alcançável através desta abordagem.
Conclusões
- O modelo apresentado é uma ferramenta valiosa para estudar a CAV.
- Pode levar a avanços nas estratégias terapêuticas para pacientes transplantados.
- Pesquisas adicionais usando este modelo podem melhorar nossa compreensão da biologia do transplante.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Chronic allograft vasculopathy (CAV) remains a leading cause of long-term graft failure in solid organ transplantation, with limited therapeutic options due to incomplete understanding of its pathophysiology. This murine cervical aortic transplantation model using a modified non-suture cuff technique provides a reproducible, minimally microsurgical platform to study CAV mechanisms and evaluate potential interventions. By enabling consistent vascular anastomosis and controlled warm ischemic time, the model supports preclinical de-risking of therapeutic strategies targeting vascular remodeling in transplantation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in vascular pathology by modeling human-relevant neointimal hyperplasia and luminal narrowing in allografted aortas.
- Operational Value: Offers a standardized, suture-free anastomosis that reduces technical variability and supports high success rates across experimental groups.
- Predictive Value: Facilitates biological de-risking of targets involved in smooth muscle cell-mediated vascular remodeling, as demonstrated by SM22-positive neointima formation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a quantifiable output—neointimal hyperplasia and luminal stenosis—enabling dose-response assessment of candidate compounds in a disease-relevant system.
- Operational Value: Ensures assay readiness through constant cuff diameter and standardized surgical timing, minimizing anastomosis-related confounding variables.
- Translational Value: Supports screening readiness by using fully MHC-mismatched allografts to mimic human alloimmune responses in vascular graft failure.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models chronic allograft vasculopathy as a progressive pathology, allowing longitudinal assessment of graft changes up to 28 days post-transplant.
- Operational Value: Enables histological and immunofluorescence analysis (e.g., Van-Gieson’s staining, SM22 detection) to validate target engagement and mechanism of action.
- Predictive Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by distinguishing between syngeneic (minimal hyperplasia) and allogeneic (significant hyperplasia) graft responses.
Pipeline & Workflow Integration
The model fits within the discovery continuum from target validation through preclinical evaluation, particularly for therapies aimed at inhibiting vascular smooth muscle proliferation or modulating immune-mediated vascular injury in transplantation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on pathways driving neointima formation, enabling mechanistic de-risking before lead optimization.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative vascular outcomes suitable for compound library screening in a standardized surgical model.
- Analytics: Generates measurable endpoints—luminal area, neointimal thickness, smooth muscle marker expression—enabling comparative analysis across treatment groups.
- Translational Research: Mirrors human CAV pathophysiology, supporting continuity from discovery to preclinical validation of vascular-protective agents.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable surgical platform for multiple therapeutic modalities (small molecules, biologics, gene therapies) targeting vascular remodeling in transplant settings.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in target validation by modeling a clinically relevant cause of late graft loss with defined histological and functional readouts.
- Operational Value: Improves reproducibility and reduces inter-animal variability through standardized non-suture cuff technique and controlled operative conditions.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing early evidence of efficacy in preventing pathological vascular remodeling, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-stratified prioritization of vascular-targeted candidates based on their ability to suppress neointimal hyperplasia in an immunocompetent allograft model.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical techniques, including vessel isolation, ligation, and inversion using fine forceps and micro scissors.
- Depends on specialized instrumentation such as vascular dilatators, heparinized saline flush systems, and stereomicroscopes for precise anastomosis.
- Necessitates standardized postoperative care and timed sacrifice (e.g., 28 days) to ensure consistent assessment of chronic vasculopathy development.
- Involves adaptation considerations when extending to different mouse strains or graft sizes, though cuff dimensions help maintain anastomotic consistency.
- Limited to modeling arterial vasculopathy; venous thrombosis or cardiac-specific pathologies require complementary models.
