Name: Geração de alta eficiência de células T Cytotoxic do rato preliminar antígeno-específico para o teste funcional em um modelo auto-imune do diabetes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Aprenda a gerar células T CD8 antígeno-específicas funcionais de alta eficiência em ratos para estudos de diabetes autoimune tipo 1. Este método utiliza transdução viral otimizada para expansão celular in vitro.

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Este estudo foi apoiado por JDRF Grants 1-INO-2015-74-S-B, 2-SRA-2016-238-S-B, e SRA-2-S-2018-648-S-B, um prêmio de educação e ação de diabetes, e o fundo de lei Caroline Wiess para pesquisa em medicina molecular na Baylor College of Medicine. O Cell-Sorting foi apoiado pelo núcleo da citometria e da classificação da pilha na faculdade de medicina de Baylor com o financiamento do NIH (S10RR024574 e P30CA125123). Todos os tetrâmeros do peptide-MHC foram obtidos da facilidade do núcleo de tetramer de NIH.

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</ol>

MAb287 e seus derivados são protegidos por uma patente dos EUA emitida em 2014.

Este protocolo descreve um método eficiente para produzir pilhas CD8 antígeno-específicas do CAR-T pela transdução retroviral. A eficiência de transdução do nosso protocolo é tipicamente alta, e a expressão robusta do CAR é geralmente observada. As pilhas de T do carro expandido mantêm as características essenciais das pilhas de T pai-ativadas, e da especificidade do anticorpo, e são apropriadas para in vitro e in vivo uso. Nós aplicamos pilhas do AB-carro CD8 T em reprogramação tipo-1 diabetes em ratos Nod<sup class="xr...

Dado o provável risco reduzido de efeitos indesejados fora do alvo, as terapias imunes antígeno-específicas (ASI) são tratamentos prometedores para doenças auto-imunes tais como T1D. Evidências acumulantes sugerem que as respostas imunes à insulina (prepro) podem ser particularmente importantes na T1D1. Na última década, estudos de vários grupos, incluindo os nossos, sugerem fortemente que a apresentação de um epítopo contendo aminoácidos de cadeia de insulina B 9 a 23 por moléculas específicas de classe II de MHC (B: 9-23/MHCII), desempenha um papel importante no desenvolvimento de T1D em camundongos e humanos2,3,4,5. Para segmentar seletivamente o complexo B: 9-23/MHCII, geramos um anticorpo monoclonal, denominado mAb287, que não tem reatividade cruzada para a insulina hormonal ou complexos contendo outros peptídeos6. MAb287 bloqueia a apresentação do antígeno in vitro, e a administração semanal de mAb287 a camundongos NOD pré-diabéticos atrasou o desenvolvimento de T1D em 35% dos camundongos tratados6. Para obstruir a apresentação do antígeno in vivo, as injeções freqüentes são exigidas tipicamente a fim manter uma concentração de circulação elevada. Nós supor que nós poderíamos superar esta dificuldade tirando proveito da especificidade elevada de Ab287 para reprogramar pilhas de T, assim fornecendo uma terapia antígeno-específica melhorada da pilha de T para T1D7.
As células T citotóxicas são relatadas para serem capazes de matar seu alvo se até mesmo uma única cópia de seu ligante cognato é expressa8,9,10. Assim, B: as pilhas CD8 T específicas de 9-23/MHCII são esperadas ter uma eficiência mais elevada em eliminar a apresentação indesejada do antígeno do que o anticorpo do pai, que precisará provavelmente de ligar aos complexos múltiplos no mesmo APC para exercer seu efeito. As pilhas de T do carro foram usadas tratando cancros humanos múltiplos11,12,13, e podem igualmente ser eficaz na autoimunidade14. No entanto, as células CAR-T com especificidade para complexos peptídeos-MHC patogênicos ainda não foram utilizadas para modificar a progressão da T1D. Ao usar a técnica de transdução de células T CD8 otimizada descrita abaixo, demonstramos recentemente uma prova de princípio de que isso representa, de fato, uma abordagem viável7.
Neste protocolo, nós esboçamos um método eficiente e aerodinamizado da transdução e da expansão. Nosso protocolo é aplicável a outros estudos que exigem a geração de pilhas CD8 do carro T do rato com eficiência elevada.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoetanol (50mM)</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td>50 &mu; M</td></tr><tr><td>5' RACE PCR</td><td>Clontech</td><td>634859</td><td></td></tr><tr><td>anticorpos CD28 anti-camundongo</td><td>eBioscience</td><td>14-0281-86</td><td>concentração final em 1&micro; g/ml</td></tr><tr><td>anticorpo CD3e de camundongo</td><td>eBioscience</td><td>145-2C11</td><td>concentração final a 1&micro; g/ml</td></tr><tr><td>de Biotina Rato Anti-Camundongo IFN-&gama;</td><td>BD Biosciences</td><td>554410</td><td>Concentração de trabalho em 0,5 &micro; g/ml</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Kit Maxi-Prep sem Endo-free</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td>Final 50 &micro; g/ml.</td></tr><tr><td>Termoinativado FCS</td><td>Hyclone</td><td>SH30087.03</td><td>Final 10% FCS</td></tr><tr><td>HEPES (100X)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>1X</td></tr><tr><td>IAg7-CLIP tetrâmero-BV421</td><td>NIH tetrâmero Instalação em Emory</td><td>por aprovação</td><td>Concentração de trabalho em 6 &micro; g/ml</td></tr><tr><td>IAg7-insulina P8E tetrâmero-BV421</td><td>NIH tetrâmero Instalação em Emory</td><td>por aprovação</td><td>Concentração de trabalho em 6 &micro; g/ml</td></tr><tr><td>Insulina-Transferrina-Selênio-Etanolamina (ITS 100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>51500056</td><td>A concentração final é 1x</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>LS Colunas</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de Separação MACS</td> Kit de Isolamento <td></td> de Células T CD8a+ de Camundongo Miltenyi Biotec <td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Miletenyi Biotec Inc</td><td>130-104-075</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Isolamento de Células T CD8a+ de Camundongo</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-075</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM medium</td><td>ThermoFisher</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (5000U/ml)</td><td>ThermoFisher</td><td>15070063</td><td>50 U/ml</td></tr><tr><td>Células Phoenix-ECO</td><td>ATCC</td><td>CRL-3214</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>pMIG II</td><td>Addgene</td><td>52107</td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-IRES-GFP II</td><td>Addgene</td><td>52107</td><td></td></tr><tr><td>Purificado Rato Anti-Rato IFN-&gama;</td><td>BD Biosciences</td><td>551216</td><td>Concentração de trabalho em 3 e micro; g/ml</td></tr><tr><td>Tampão de lise de glóbulos vermelhos</td><td>Sigma</td><td>R7767</td><td></td></tr><tr><td>RetroNectin</td><td>Takara</td><td>T100A</td><td>Concentração de trabalho a 50 &micro; g/ml em PBS</td></tr><tr><td>rhIL-2 (concentração de estoque 105 UI/ul)</td><td>Peprotech</td><td>200-02</td><td>Concentração final a 200 UI/ml</td></tr><tr><td>rmIL-7 (concentração de estoque 50ng/ul)</td><td>R& D</td><td>407-ML-005</td><td>Concentração final a 0,5 ng/ml</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de células estéreis</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>Tryple</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td></td></tr></tbody></table>

geração de alta eficiência de células t cytotoxic do rato preliminar antígeno-específico para o teste funcional em um modelo auto-imune do diabetes

High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

O diabetes tipo 1 (T1D) é caracterizado por autoimunidade específica de Islet, levando à destruição de células beta e perda absoluta da produção de insulina. No modelo espontâneo do rato do diabetes não-obeso (nod), o insulin é o alvo preliminar, e a manipulação genética destes animais para remover um único epítopo mapeado chave da insulina impede a doença. Assim, a eliminação seletiva de pilhas de apresentação do antígeno profissional (APCs) que carregam este epítopo patogénico é uma aproximação para inibir as respostas auto-imunes insulin-específicas indesejadas, e tem provavelmente o maior potencial translacional.
Os receptores de antígeno Quimérico (CARs) podem redirecionar as células T para segmentar seletivamente antígenos causadores de doenças. Esta técnica é fundamental para tentativas recentes de usar a engenharia celular para terapia celular adotiva para tratar vários cânceres. Neste protocolo, nós descrevemos uma transdução aperfeiçoada do retrovírus de célula T (RV) e o protocolo in vitro da expansão que gera números elevados de pilhas CD8 antígeno-específicas funcionais do Car-T que partem de um baixo número de pilhas ingênuas. Os protocolos previamente múltiplos da pilha de CAR-T foram descritos, mas tipicamente com eficiência relativamente baixa da transdução e viabilidade da pilha depois da transdução. Em contrapartida, nosso protocolo fornece até 90% de eficiência de transdução, e as células geradas podem sobreviver mais de duas semanas in vivo e atrasar significativamente o início da doença após uma única infusão. Nós fornecemos uma descrição detalhada do protocolo da manutenção e da transdução da pilha, de modo que as etapas críticas possam facilmente ser seguidas. Todo o procedimento do isolamento da célula primária para a expressão CAR pode ser realizado dentro de 14 dias. O método geral pode ser aplicado a qualquer modelo de doença do mouse no qual o alvo é conhecido. Da mesma forma, a aplicação específica (visando um complexo de peptídeo patogênico/MHC classe II) é aplicável a qualquer outro modelo de doença auto-imune para o qual um complexo-chave foi identificado.

Tipicamente, a eficiência da transdução que usa este protocolo é ~ 60-90%. No experimento mostrado na Figura 3, antes de classificar aproximadamente, 70% das células T CD8 expressaram a GFP. Eles também coexpressaram CD28 e CD3 (Figura 3C). É importante ressaltar que todas as células GFP+ de "teste" também estão cocoradas com os tetramers iaG7-b: R3, mas não com o controle tetrâmero (Fig...

Este artigo descreve um protocolo para a geração de pilhas CD8 T antígeno-específicas, e sua expansão in vitro, com o objetivo de render números elevados de pilhas de T funcionais para o uso in vitro e in vivo.

Geração de alta eficiência de células T Cytotoxic do rato preliminar antígeno-específico para o teste funcional em um modelo auto-imune do diabetes

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...

Este protocolo permite gerar um grande número de células T específicas de antígeno funcional que são uma abordagem segura desejada no tratamento de doenças autoimunes. A principal vantagem desta técnica é que ela fornece um processo de transdução altamente eficiente e um grande número de células T funcionais. Esta técnica pode ser estendida para tratar diabetes tipo 1 e outras doenças autoimunes nas quais os antígenos são conhecidos.Além disso, as células CAR T podem ser um tratamento promissor para certos tipos de câncer. Este método pode ser usado para gerar células imunes expressando outros CARs. É importante ter uma técnica bem aceita, ler todo o protocolo e planejar todo o experimento com antecedência.Este protocolo de duas semanas inclui mini-passos e o sucesso depende do desempenho adequado de cada etapa. Demonstrações visuais deste método são fundamentais para que os alunos sigam corretamente. Prepare as células de Phoenix para transfecção, como descrito no manuscrito.É uma boa prática marcar a parede lateral onde o meio será adicionado e removido para minimizar o desmendo as células. No dia zero aspirar o supernaente das células e lavá-los com cinco mililitros de PBS. Adicione cuidadosamente sete mililitros de soro reduzido médio dropwise à parede lateral da placa e transfira as células de volta para a incubadora.Adicione 1,5 mililitros de meio de soro reduzido a dois tubos de polipropileno de fundo redondo de 14 milímetros. Adicione 40 micrômetros de reagente de transfecção a um dos tubos e 15 microgramas de plasmídeo CAR redirecionado de anticorpos, juntamente com cinco microgramas de plasmídeo de embalagem para o outro. Incubar os tubos à temperatura ambiente por cinco minutos e, em seguida, adicionar reagente de transfecção ao tubo plasmídeo.Misture gentilmente a solução três vezes e incuba-a à temperatura ambiente por pelo menos 20 minutos. Adicione três mililitros da mistura às células de Phoenix e coloque-as em uma incubadora de cultura tecidual. Depois de quatro a cinco horas adicione um mililitro de FCS às células e cultue-as durante a noite a 37 graus Celsius.No dia seguinte, remova o supernasce das células e adicione quatro mililitros de meio de cultura pré-armada fresco. Colher o vírus no segundo dia coletando o vírus contendo meio das células de Phoenix e filtrando-o para remover detritos de células residuais. Adicione estoque de IL-2 humano recombinante ao vírus para uma concentração final de 200 unidades internacionais por mililitro e use-o imediatamente para transdução.Adicione quatro mililitros de meio fresco às células de Phoenix e coloque-os na incubadora durante a noite. Repita a coleta de vírus no dia seguinte para uma segunda transdução e descarte as células. Um dia antes de semear células murine CD8 T, adicione um mililitro de uma mistura de anticorpos anti-mouse CD3 e CD28 a cada poço de uma placa de 24 poços e incubar a placa durante a noite a quatro graus Celsius.No dia zero, colhe o baço do rato e coloca-os em um coador de células imersos em 10 mililitros de PBS em um prato de cultura celular no gelo. Em uma capa de cultura celular, corte cada baço em três a cinco pedaços e use um êmbolo estéril de uma seringa para pressionar o tecido através da malha de arame. Remova suavemente os glóbulos vermelhos reutilizando esplenócitos em um a quatro tampão de lise de células vermelhas diluídas e incubando-os à temperatura ambiente por cinco minutos e depois dilua 10 microliters da suspensão celular com Trypan Blue para contagem celular.E pelota o resto das células por centrifugação a 350 vezes g por sete minutos. Use um kit de isolamento celular CD8 T para enriquecer as células CD8 T e suspender as pelotas de células em 400 microliters de buffer com 100 microliters de coquetel de anticorpos biotina por uma vez 10 a oitava células. Misture bem a suspensão celular e incuba-a por cinco minutos a quatro graus Celsius para permitir a ligação de anticorpos.Em seguida, adicione 300 microliters de tampão de rotulagem e 200 microliters de MicroEsferas Anti-Biotina por uma vez 10 às oitavas células. Misture bem e incubar por mais 10 minutos a quatro graus Celsius. Enquanto isso, configure uma coluna de separação no separador e lave-a com três mililitros de tampão de rotulagem.Coloque um coador de células de 40 micrômetros na parte superior de uma coluna e passe um mililitro da mistura de contas e células através do coador na coluna de separação. Colete o fluxo através de um tubo pré-15 mililitro e lave a coluna de acordo com as instruções do fabricante, coletando efluentes no mesmo tubo. Conte as células e colete-as por centrifugação a 350 vezes g por cinco minutos.Lave-os com dois mililitros de células T média e centrífuga novamente. Em seguida, resuspensá-los em meio de células T pré-armados em uma concentração de 250.000 a 500.000 células por mililitro. Lave as placas revestidas de anticorpos CD3 e CD28 previamente preparadas com um mililitro de PBS estéril três vezes e adicione dois mililitros da suspensão celular a cada poço.Use um movimento de redemoinho para dispensar as células uniformemente. Como controle, plaque o mesmo número de células CD8 T em um único poço não revestido da placa e incuba as células a 37 graus Celsius em uma incubadora de tanques de gás de 10% de dióxido de carbono por 48 horas. No primeiro dia, prepare as placas revestidas de fragmento de fibronectina humana adicionando 0,5 mililitros de fibronectina aos poços de uma placa de 24 poços e incubando-a durante a noite a quatro graus Celsius.No dia seguinte, remova a solução de fibronectina e adicione um mililitro de 2%BSA e PBS por poço. Incubar a placa em temperatura ambiente por 30 minutos e lavar os poços tratados com um mililitro de PBS estéril. A placa está pronta para uso após a remoção da solução de lavagem.Conte as células CD8 T ativadas usando Trypan Blue. Colecioná-los por centrifugação. E resuspensá-los em cinco milhões de células viáveis por mililitro para transdução.Adicione 100 microliters da suspensão celular CD8 ativada a cada poço da placa revestida de fibronectina. Em seguida, adicione 1,5 a dois mililitros do vírus previamente preparado contendo meio e misture usando um movimento de redemoinho para dispensar uniformemente as células. Sele a placa em um saco Ziploc e centrifuá-la a 2.000 vezes g por 90 minutos a 37 graus Celsius.Remova a placa da centrífuga e leve-a para um armário de segurança biológica. Retire cuidadosamente o saco plástico e certifique-se de que a parte externa da placa não esteja contaminada com meio. Transfira a placa para uma incubadora de dióxido de carbono de 37 graus Celsius.Após quatro horas, remova um mililitro de meio de cada poço, substitua-o por um mililitro de meio de célula T completo pré-armado e coloque a placa de volta na incubadora. Os aspectos críticos deste protocolo são um vírus de alta titulação, células T ativadas saudáveis e o método de transdução apropriado. As células foram co-manchadas com pe tamanho sete anti-CD8 conjugado, AF647 conjugado anti-CD3, e BV 421 conjugado anti-CD28 para análise citométrica de fluxo.Aproximadamente, 70% das células CD8 T co-expressas GFP que indica expressão CAR. Eles também co-expressaram CD28 e CD3. É importante ressaltar que todas as células positivas do teste GFP também co-mancham com tetramers de insulina I-Ag7 BR3 que indica expressão de CAR na superfície celular, mas não com o tetramer de controle.Além disso, as células CAR T classificadas de teste e controle se secretaram altos níveis de gama interferon somente após a cocultura com células-alvo expressando seus ligantes cognatos que confirmam que as células transduzidas têm um fenótipo de células T efeito CD8 direcionados para o alvo dos anticorpos-pais. A transdução de células produtoras de vírus, o isolamento das células T primárias cd8 e a ativação dessas células T são os passos mais importantes deste experimento. Ter células T ativadas saudáveis e transdução dessas células T com reagentes apropriados garante resultados favoráveis.Este método pode ser usado para transdutar outras células T, mas deve ser personalizado para o tipo específico de célula T. Este protocolo abre caminho para a prevenção do diabetes tipo 1 com terapia celular receptor de antígeno t específica de antígeno.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

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Geração de alta eficiência de células T Cytotoxic do rato preliminar antígeno-específico para o teste funcional em um modelo auto-imune do diabetes (Vídeo) | JoVE Journal

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