Síntese de Oligosacárido de um pote programável e hierárquica
6 de setembro de 2019
Este protocolo demonstra como usar o software auto-CHO para a síntese hierárquica e programável de um pote de oligossacarídeos. Descreve também o procedimento geral para experimentos de determinação de RRV e glicosilação de um pote de SSEA-4.
Demonstramos como usar nosso software recém-desenvolvido, Auto-CHO, para síntese hierárquica de oligossacarídeo de um pote. O Auto-CHO inclui algoritmos em blocos de construção expandidos, com valores relativos de reatividade previstos através do aprendizado de máquina. O software Auto-CHO fornece uma diretriz valiosa para a seleção de blocos de construção e um projeto hierárquico para a síntese múltipla de um pote de glicocanos mais complexos através da composição de fragmentos.
As implicações dessa técnica se estendem à terapia de cânceres ou doenças infecciosas por terapêuticas à base de carboidratos. Antes de usar o Auto-CHO, certifique-se de que o Ambiente Java Runtime tenha sido instalado em um PC ou Mac. A demonstração visual da manipulação do software Auto-CHO e o experimento de determinação de valor de reatividade relacionado ajudarão os químicos a seguir o protocolo e prosseguirão com o experimento rapidamente.
Para realizar a inicialização do software do Java Runtime Environment, acesse o site Auto-CHO e baixe o software de acordo com o sistema operacional. Atualmente, o Auto-CHO suporta Windows, macOS e Ubuntu. O mais recente guia de usuário PDF é fornecido no site auto-CHO.
Para usuários do Windows, descompacte o Auto-CHO Windows. zip, e clique duas vezes em Auto-CHO. frasco na pasta Windows Auto-CHO para iniciar o programa.
Insira a estrutura glican desejada. Escolha desenhar uma estrutura glican ou ler um arquivo de estrutura existente. Para inserir por desenho, clique em editar glycan por GlycanBuilder ou na área de clique aqui para editar o alvo sintético para desenhar e editar a estrutura de consulta pelo GlycanBuilder.
As informações de ligação e quiralidade não devem ser ignoradas. Clique nos botões Globo-H, SSEA-4 ou OligoLacNAc para exibir os exemplos. Feche o diálogo GlycanBuilder para concluir a edição.
Defina os parâmetros de pesquisa na guia de configurações do parâmetro para obter resultados razoáveis de pesquisa. Clique no botão ok para ativar novas configurações. A configuração padrão é pesquisar apenas na biblioteca experimental.
Se desejar pesquisar as bibliotecas experimentais e virtuais, selecione a guia de biblioteca de blocos de construção virtual. Selecione usar bibliotecas experimentais e virtuais e aplique filtragem para exibir blocos de construção virtuais com determinados critérios. Blocos de construção experimentais e virtuais podem trabalhar juntos para melhorar a capacidade de pesquisa do Auto-CHO.
Atualmente, o Auto-CHO fornece mais de 50.000 blocos de construção virtuais, com RRVs previstos na biblioteca. Verifique um ou vários blocos de construção virtuais desejados que o usuário gostaria de usar para pesquisar. Clique no botão de blocos de construção virtuais selecionados para mostrar apenas os blocos de construção virtuais selecionados.
Clique no botão de blocos de construção virtuais filtrados para mostrar apenas blocos de construção virtuais com determinados critérios definidos pelo usuário. Clique no botão mostrar todos os blocos de construção virtuais para mostrar todos os blocos de construção virtuais disponíveis e redefinir o filtro. Selecione a guia estrutura de consulta e clique no botão de biblioteca de blocos de pesquisa para encontrar as soluções sintéticas de um pote para a estrutura de consulta.
Em seguida, confirme as configurações do parâmetro. Pesquise o visualizador de resultados. O resultado da pesquisa é mostrado na guia de visualização de resultados.
Os aceitadores finais redutores de diferentes números de resíduos são exibidos na coluna de aceitação final redutora. Em seguida, selecione um aceitador final redutor. As soluções são exibidas na lista de soluções sintéticas.
Fragmentos são mostrados na lista de fragmentos para sugerir quantos fragmentos devem ser usados na síntese. O sistema fornece informações detalhadas de cada fragmento, incluindo o RRV do fragmento, rendimento computacional, bem como qual grupo de proteção deve ser desprotegido para uso do fragmento na reação de um pote. Os blocos de construção usados para montar o fragmento selecionado e as informações de conexão de fragmento também são exibidos.
Para blocos de construção experimentais, visualize e verifique estruturas químicas dos blocos de construção selecionados na estrutura química da região do bloco de construção e consulte o navegador de blocos de construção de informações detalhadas. Em um frasco de fundo redondo de 10 mililitros, combine os dois doadores de tioglicoside, metanol absoluto e secador em DCM. Em seguida, mexa em temperatura ambiente por uma hora.
Pegue uma alíquota de 30 microliter desta mistura e injete a mistura em cromatografia líquida de alto desempenho em três injeções separadas. Meça o coeficiente entre a absorção e a concentração da molécula doadora sob as condições de separação da linha de base. Adicione uma solução de 0,5 molar N-Iodosuccinimida em acetonitrilo na mistura de reação, seguida pela adição de uma solução de ácido trifluorometanessulfônico molar 0,1 molar.
Mexa a mistura em temperatura ambiente por duas horas. Em seguida, diluir a mistura de reação com quatro mililitros de DCM. Filtre e lave a reação com tiossulfato aquoso de sódio saturado, contendo carbonato de hidrogênio 10%.
Agora extraia a camada aquosa três vezes com cinco mililitros de DCM. Misture todas as camadas orgânicas e lave com cinco mililitros de salmoura. Em seguida, seque as camadas combinadas com aproximadamente 200 miligramas de sulfato de magnésio anidro.
Agite levemente a mistura por 30 segundos e filtre-a através de um funil com um papel filtro de flanada, a fim de remover o sulfato de magnésio. Em seguida, colete o filtrado em um frasco fundo redondo de 25 mililitros. Remova o solvente, usando um evaporador rotativo.
Dissolva o resíduo em um mililitro de DCM. Pegue uma alíquota de 30 microliter desta mistura, e injete-a em cromatografia líquida de alto desempenho em três injeções separadas. Meça as concentrações dos doadores restantes pelo HPLC, sob as mesmas condições de separação.
Meça a reatividade relativa. Com base no valor relativo de reatividade do DR4, o valor relativo de reatividade do DX1 é de três. O resultado de pesquisa Auto-CHO baseado em configurações padrão do parâmetro indica que o SSEA-4 pode ser sintetizado por uma reação de dois mais um mais três de um pote.
Quando um aceitador final redutor de trisacarídeos é selecionado, o programa mostra quatro soluções potenciais para a consulta. A primeira solução tem um fragmento, e seu rendimento calculado é de cerca de 94% O fragmento pode ser sintetizado por dois blocos de construção. O RRV do primeiro bloco de construção descarado é 1462, e o RRV do segundo monossacarídeo é 32.0.
A estrutura química do primeiro bloco de construção sugerido usado na reação de um pote também é mostrada. O experimento de um pote mostra que o SSEA-4 pode ser sintetizado com sucesso em rendimento de 43% por esta sugestão. O SSEA-4 pode ser sintetizado por três unidades sugeridas pelo Auto-CHO.
Essas unidades incluem o bloco de construção de disscarido silele bloco um, edifício monossacarídeo bloco dois, e redução do aceitador final três. Para configurações de parâmetros, sugerimos definir parâmetros com critérios mais rigorosos no início. Para a seleção da biblioteca do bloco de construção, sugerimos pesquisar a biblioteca experimental apenas no início.
Através dessa demonstração, esperamos que glicanos mais importantes, como antígenos de carboidratos associados ao tumor, possam ser sintetizados pela abordagem de um pote para estudos futuros. Após este procedimento, a síntese de todos esses antígenos pode ser realizada a fim de projetar vacinas contra o câncer à base de carboidratos. Também esperamos que a inteligência artificial e algoritmos de computador possam facilitar a síntese automatizada de glicanos para beneficiar o tratamento e a prevenção de doenças.
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Visão Geral
Este protocolo demonstra o uso do software Auto-CHO para a síntese hierárquica e programável de oligossacarídeos em um único vaso. Inclui uma demonstração visual da manipulação do software e experimentos de determinação de RRV.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Síntese de oligossacarídeos
- Desenvolvimento de software
- Aplicações de aprendizado de máquina
Contexto
- O software Auto-CHO auxilia na síntese de oligossacarídeos.
- Algoritmos predizem valores de reatividade relativa usando aprendizado de máquina.
- São fornecidas diretrizes para a seleção de blocos de construção.
- Implicações para aplicações terapêuticas em câncer e doenças infecciosas.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar a funcionalidade do software Auto-CHO.
- Fornecer um protocolo para glicosilação em um único recipiente.
- Facilitar a síntese de glicanos complexos por meio da composição de fragmentos.
Métodos Utilizados
- Síntese hierárquica de oligossacarídeos.
- Algoritmos de aprendizado de máquina para prever valores de reatividade.
- Demonstrações visuais do uso de software.
- Experimentos de determinação de RRV.
Resultados Principais
- Demonstração bem-sucedida da síntese de oligossacarídeos em um único recipiente.
- Diretrizes eficazes para a seleção de blocos de construção.
- Instruções visuais claras para químicos.
- Aplicações terapêuticas potenciais destacadas.
Conclusões
- O software Auto-CHO é uma ferramenta valiosa para a síntese de oligossacarídeos.
- O aprendizado de máquina aprimora o processo de síntese.
- O protocolo permite a execução rápida de experimentos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A síntese programável de oligossacarídeos em um único recipiente permite a montagem rápida de glicanos complexos para a validação de alvos terapêuticos, reduzindo os prazos de desenvolvimento de candidatos a medicamentos baseados em carboidratos. O software Auto-CHO fornece seleção preditiva de blocos de construção e planejamento hierárquico da síntese, apoiando a redução de riscos mecanicistas na fase inicial de descoberta. Essa abordagem aprimora a triagem de portfólios ao aumentar a confiança nas relações estrutura-atividade de glicanos antes do investimento pré-clínico.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da síntese rápida de estruturas definidas de glicanos, como o SSEA-4, para validação de marcadores de células-tronco.
- Valor Operacional: Apoia a desconsideração de riscos biológicos ao gerar lotes homogêneos de oligossacarídeos para ensaios de validação funcional de alvos.
- Valor Preditivo: Facilita o mapeamento da relação estrutura-atividade para priorizar epítopos de glicanos com potencial terapêutico em alvos de câncer e doenças infecciosas.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão para Ensaios: Produz preparações padronizadas de glicanos adequadas para o desenvolvimento de microarranjos de carboidratos e ensaios de ligação.
- Resultados Quantitativos: Fornece rendimentos mensuráveis e perfis de pureza, permitindo triagem confiável de compostos contra proteínas ligadoras de glicanos.
- Reutilização da Plataforma: Permite o aprimoramento iterativo de bibliotecas de blocos construtores por meio do feedback do usuário sobre blocos virtuais, aumentando a escalabilidade de triagem a longo prazo.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: A síntese demonstrada de SSEA-4, um marcador de células-tronco pluripotentes, apoia o alinhamento de biomarcadores na medicina regenerativa e no direcionamento de células-tronco cancerígenas.
- Continuidade Tradutiva: Fornece uma via da síntese em escala de descoberta à avaliação pré-clínica de antígenos carboidratos associados a tumores para o desenvolvimento de vacinas.
- Avanço Ajustado ao Risco: Permite a produção de glicanos com estrutura definida para reduzir a ambiguidade nos perfis de eficácia imunológica e segurança.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se aos fluxos de trabalho de descoberta inicial ao permitir a síntese de glicanos orientada por hipóteses, contribuindo para a identificação de compostos líderes por meio de estruturas antigênicas definidas e apoiando a validação pré-clínica mediante produção reprodutível de glicanos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a desmistificação mecanicista ao esclarecer vias biossintéticas e validar alvos de glicanos por meio de síntese química definida.
- Triagem: Gera painéis de glicanos prontos para ensaios com rendimentos quantificados para triagem em alto rendimento de interações glicano-proteína.
- Análises: Fornece valores de reatividade relativa e rendimentos computacionais como leituras quantitativas para comparar a eficiência de rotas sintéticas e prever o sucesso.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se ao trabalho pré-clínico ao permitir a síntese de antígenos de carboidratos associados a tumores para avaliação de candidatos a vacinas.
- Reutilização Corporativa: Funciona como uma capacidade reutilizável por meio da expansão virtual orientada por feedback do Auto-CHO, reduzindo o planejamento redundante de síntese em diferentes projetos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista na função dos glicanos.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e a escalabilidade da produção de oligossacarídeos por meio de protocolos padronizados em um único recipiente.
- Valor Estratégico: Aprimora as decisões de prosseguir ou não prosseguir ao permitir uma exploração rápida da relação estrutura-atividade, reduzindo o risco de falhas biológicas em estágios avançados.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de candidatos baseados em glicanos por meio de previsões definidas de acessibilidade sintética e rendimento.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em química de carboidratos e interpretação de estruturas de glicanos para a seleção eficaz de blocos de construção.
- Necessita de acesso a HPLC e infraestrutura padrão de síntese orgânica para determinação de RRV e monitoramento de reações.
- Exige padronização entre equipes na nomenclatura de glicanos e nos formatos de entrada estrutural para consultas consistentes no Auto-CHO.
- Envolve considerações de adaptação ao estender o método a blocos de construção não-tioglicosídicos ou estratégias alternativas de proteção de grupos.
- Limitado pela precisão das RRVs previstas por aprendizado de máquina para blocos de construção novos, exigindo validação experimental para previsões de alta confiança.
