Name: Uma abordagem personalizável para a produção enzimática e purificação de produtos naturais de Diterpenóides (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Aprenda a produzir e purificar diterpenoides usando enzimas biosintéticas em Escherichia coli ou Nicotiana benthamiana. Este método simples e econômico gera quantidades em miligramas de metabolitos especializados para análises estruturais e bioatividade.

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Nós reconhecemos agradecidamente Dr. Reuben Peters (Iowa State University, EUA) para fornecer os pIRS e pGGxZmAN2 construções. O apoio financeiro para este trabalho pelo programa de interações planta-biótica da NSF (Grant # 1758976 para P.Z.), o programa de pesquisa de carreira precoce DOE (Grant # DE-SC0019178 para P.Z.), o programa de ciência da Comunidade do Instituto genoma conjunto DOE (Grant # CSP2568 to P.Z.), o NSF Programa de bolsas de estudo de pós-graduação (para K.M.M.), e uma UC Davis Dean ' s mentorship Award Fellowship (para K.M.M.) são gratos.

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A investigação e a aplicação mais amplas de produtos naturais de diterpenóides necessitam de protocolos simples e baratos para sintetizar e purificar quantidades suficientes de compostos desejados. O rápido aumento do número de enzimas diterpenóides-metabólicas disponíveis a partir de uma ampla gama de espécies agora fornece um inventário expansivo para a produção enzimática de diterpenóides usando sistemas hospedeiros microbianos e baseados em plantas. Além disso, a arquitetura modular de muitas vias diterpenóides permite o uso de enzimas da mesma espécie ou de diferentes espécies em ' plug & Play ' abordagens de engenharia combinatória para gerar uma matriz de natural e nova natureza-como diterpenóide natural produtos2,14,26,35.
E. coli é um hospedeiro microbiano preferencial para a biossíntese de produtos naturais devido à sua robustez, facilidade de escalabilidade, complexidade química limitada para contaminação por subprodutos reduzidos e a riqueza de ferramentas disponíveis para a montagem e expressão de DNA Otimização. Em nossa experiência, a plataforma descrita aqui é bem adequada para produzir rendimentos de produtos de até várias centenas de mg de olefinas de diterpeno e álcoois, o que é adequado para muitas aplicações a jusante, incluindo as propostas aqui. Apesar de não atender à escala industrial, a plataforma de produção descrita aqui pode servir como base para mais vias, acolhimento e otimização da fermentação, como foi demonstrado com sucesso para diterpenóides relacionados, como o taxadieno e o sclareol33 ,34. A sobreexpressão dos genes da via MVA ou MEP com limitação de taxa foi estabelecida com sucesso para superar fatores limitantes da produtividade para a biossíntese de diterpenóides, como suprimento insuficiente de precursor e fluxo precursor em vias concorrentes13, 32,33,39. Embora provado bem sucedido em diversos estudos, a expressão pobre e a atividade catalítica do P450s eucarióticas terpenoid-metabólico e de outras enzimas membrana-ligadas em e. coli são um fator de limitação provável33,39 ,48,49,50,51,52. O uso de seqüências Codon-aperfeiçoadas e de modificações da proteína, tais como a remoção do peptide endoplasmático do sinal do retículo ou a introdução de um peptide do sinal do núcleo, provaram útil aumentar a expressão do P450 solúvel14,38 ,49,50,53. Tais modificações também foram empregadas para a coexpressão microbiana do milho CYP71Z1839 utilizada como exemplo de via neste estudo. Os protocolos descritos baseiam-se no uso de plasmís que transportam um ou dois genes por construto, todos o mesmo promotor induzível. Onde as combinações de genes de maior escala são desejadas, é aconselhável usar várias gavetas de múltiplos genes disponíveis ou sistemas de empilhamento de genes para mitigar a eficiência de transformação reduzida e o crescimento da cultura devido ao uso de múltiplos plasmímicos e antibióticos13 .
Com a disponibilidade mais ampla de recursos genéticos e genômica, os sistemas hospedeiros de plantas também se tornam cada vez mais adequados para a fabricação de produtos naturais. As vantagens incluem a capacidade das plantas para produzir os precursores naturais exigidos pstos pela fotossíntese, assim permitindo a formação do produto sem a necessidade de complementar moléculas do precursor54,55. N. javanica já é amplamente utilizado para a caracterização funcional in vivo e expressão combinatória de terpenóides e outras vias de produto natural14,35,36,40 . As vantagens notáveis do uso de N. javanica como sistema hospedeiro incluem a produção endógena de precursores diterpenóides, o uso de sequências genéticas nativas, a expressão simplificada de P450s eucariótica, a facilidade de transformação genética combinatória (como os antibióticos separados não são exigidos para a cotransformação transiente), e a extração simples de produtos do alvo do material da folha. Quando necessário, a produção de diterpenóides pode ser reforçada através da coexpressão dos genes-chave da via do MEP para aumentar o suprimento precursor36,41. As restrições para a produção escalável de diterpenóides em N. javanica são mais complexas em comparação com as culturas microbianas líquidas, devido à necessidade de gerar biomassa vegetal suficiente, a purificação de produtos mais trabalhosa do complexo quimicamente tecido vegetal e possível metabolização indesejável de produtos-alvo através, por exemplo, de oxidação, glicosilação ou deposforilação por enzimas endógenas36,43,44,45 ,46,47. No entanto, este procedimento pode ser dimensionado até as quantidades do produto mg, aumentando o número de plantas utilizadas para agroinfiltração56.
Os protocolos de extração e purificação de produtos descritos aqui são compatíveis com e . coli e N. javanica, assim como S. cerevisiae e outros sistemas hospedeiros de plantas ou microbiana, e proporcionam uma abordagem econômica que é fácil de criado em laboratórios de biologia e química e não requer equipamento de purificação caro. A extração do metabolito usando um funil funil é apropriada para a extração eficiente e a separação da fase antes da purificação cromatográfica. Os tamanhos de funil podem ser prontamente ajustados para permitir volumes de cultura maiores e reduzir o tempo experimental necessário para extrair de grandes culturas. Encontramos o uso de um gradiente de hexano/acetato de etilo para ser ideal para a extração de diterpenóides de diferentes polaridade, como demonstrado aqui para o grupo de dolabralexinas que compõem os compostos hidrocarbônico e oxigenado (Figura 3). Dependendo das propriedades dos produtos-alvo, outras misturas de solventes podem ser vantajosas. No entanto, os solventes não devem ser miscível com água para garantir a extração bem-sucedida e separação de fase usando a técnica de funil separatório. Além disso, a perda de produto por evaporação deve ser levada em conta ao usar essa abordagem para a produção de compostos orgânicos voláteis (COV), como o menor peso molecular mono e sesqui-terpenóides e outros VOCs. A separação cromatográfica de diterpenóides de diferentes níveis de oxigenação usando uma coluna de sílica de maior escala (~ 2 L) tem sido vantajosa em nossa experiência, uma vez que proporciona uma melhor separação de produtos e minimiza a necessidade de purificação iterativa etapas ao usar volumes de coluna menores. Os volumes e matrizes das colunas podem ser ajustados conforme necessário para o volume de cultura desejado e o tipo de produto natural. A pureza dos produtos-alvo que podem ser alcançados usando este protocolo é adequada para muitas aplicações a jusante, tais como ensaios de Bioatividade ou para uso em análises de atividade enzimática. No entanto, onde os níveis de pureza mais elevados são necessários, tais como análises estruturais através de RMN, a pureza do produto pode ser eficientemente reforçada pela purificação adicional usando (semi)-HPLC preparative.
Este protocolo descrito aqui foi otimizado para a produção de produtos naturais diterpenóides, mas também pode ser prontamente personalizado para mono-, sesqui e Tri-terpenóides relacionados, bem como outras classes de produto natural, simplesmente gerando a enzima desejada módulos para a expressão combinatória14,57. No entanto, as modificações dos procedimentos de extração e purificação do produto devem ser levadas em consideração para compostos com maior volatilidade, como mono-e sesqui-terpenóides, ou maior polaridade e modificação funcional, como exemplificado por glicosilação de muitos triterpenoids, phenylpropanoids, e outras classes naturais do produto.
Embora as plataformas da industrial-escala para a manufatura de produtos naturais estejam disponíveis, os protocolos descritos aqui oferecem uma ferramenta barata, customizável que possa facilmente ser ajustada acima em a maioria de laboratórios. Como demonstrado pela produção de milho dolabralexins aqui e em outros lugares39, as quantidades do produto e pureza que podem ser alcançados usando esta abordagem são tipicamente suficientes para facilitar a análise de vários downstream e usos, incluindo, mas não limitado a, vários estudos de bioatividade, análise de interações entre organismos, bem como para uso como substratos enzimáticos ou como material de partida para abordagens de semisíntese.

Os diterpenóides compreendem um grupo quimicamente diverso de mais de 12.000 produtos naturais predominantemente policíclicos de 20 carbonos que desempenham papéis críticos em muitos organismos1. Fungos e plantas produzem a maior diversidade de diterpenóides, mas as bactérias também foram mostradas para formar diterpenóides bioativos (ver comentários2,3,4,5). Enraizada na sua vasta diversidade estrutural, os diterpenóides servem uma infinidade de funções biológicas. Alguns diterpenóides, tais como hormônios de crescimento Giberelina, têm funções essenciais em processos de desenvolvimento5. No entanto, a maioria dos diterpenóides servem como mediadores da defesa química e interorganismal interações. Entre estes, os ácidos da resina do diterpenos na defesa da praga e do micróbio patogénico de árvores coníferas e de misturas espécie-específicas de diterpenóides antimicrobianos em colheitas de alimento principais tais como o milho (Zea Mays) e o arroz (Oryza sativa) foram o mais extensivamente estudou6,7. Estas Bioatividades fornecem um repositório químico rico para aplicaçõescomerciais, eos diterpenóides seleto são usados como produtos farmacêuticos importantes, aditivos de alimento, adesivos, e outros Bioprodutos da vida moderna diária8,9 ,10. Para avançar a pesquisa sobre a diversidade natural e as funções biológicas dos diterpenóides e, finalmente, promover aplicações comerciais mais amplas, são necessárias ferramentas para a preparação rentável de compostos puros. O isolamento em grande escala do material vegetal foi estabelecido para alguns Bioprodutos diterpenóides, como os ácidos de resina diterpeno que são produzidos como um subproduto da indústria de celulose e papel8. No entanto, a acumulação de diterpenóides em apenas tecidos específicos e regulação apertada por estímulos ambientais, muitas vezes limita o isolamento de quantidades suficientes de produtos do produtor natural2. Além disso, a complexidade estrutural dos diterpenóides dificulta sua produção através da síntese química, embora tais abordagens tenham sido bem-sucedidas em vários casos11,12. Com a disponibilidade de tecnologias avançadas de genômica e bioquímica, as plataformas de produção enzimática ganharam atenção crescente para a produção de uma variedade de compostos diterpenóides (ver comentários13,14, 15,16,17,18).
Todos os terpenóides, incluindo diterpenóides, são derivados de dois precursores isoméricos isoprenóides, isopentenila difosfato (IPP) e dimetilalilo difosfato (DMAPP)19 que, por sua vez, são formados através do mevalonato (MVA) ou o metilerythritol-5-fosfato (MEP) caminho. A biossíntese de terpenóides prossegue através da via MEP em bactérias e a via MVA em fungos, enquanto as plantas possuem um MVA citosólico e uma via de Pemáx núcleo, sendo esta última a principal via para a formação de diterpenóides20. A condensação de IPP e DMAPP por prenilo transferases produz o precursor central de 20 carbonos para todos os diterpenóides, difosfato de difosfato (GGPP)20. A jusante da formação GGPP, duas famílias enzimáticas, terpenos sintases (tpss) e citocromo P450 monooxigenases (P450s) controlam em grande parte a formação da vasta diversidade química do metabolismo terpenóide21,22. Os sintases do diterpenos (ditpss) catalisam a ciclização e o rearranjo carbocation-conduzidos cometidos de GGPP para dar forma a vários andaimes estereosespecíficos do diterpenos do BI-, poli-, ou macro-cíclicos1,3,23, a 24. A oxigenação e a decoração funcional mais adicional destes andaimes são facilitadas então por enzimas P450 e selecionam outras famílias da enzima22,25. Os TPSs e P450s comumente existem como famílias multigênicas específicas de espécies que podem formar redes biossintéticas modulares, onde a combinação de diferentes módulos enzimáticos ao longo de um esquema comum possibilita a formação de uma ampla gama de compostos2, a descoberta 26. The rápida de enzimas funcionalmente distintas que operam-se em caminhos terpenoid modulares nos últimos anos forneceu oportunidades de expansão para seu uso como uma lista de peças versátil para a engenharia metabólica de vias parciais ou completas em plataformas de produção microbiana e de base vegetal. Por exemplo, levedura (Saccharomyces cerevisiae) tem sido aplicada com sucesso para o engenheiro de vias multienzimáticas para a fabricação de bioprodutos terpenóides, como a droga antimalárico artemisinina27, os biocombustíveis sesquiterpenóides bisaboleno e farneseno28, mas também selecionar diterpenóides29,30,31. Da mesma forma, plataformas de Escherichia coli projetadas para a manufatura em escala industrial foram estabelecidas para alguns metabólitos diterpenóides, incluindo o taxadieno precursora Taxol usado como um medicamento anticancerígeno e o álcool diterpeno, sclareol , usado na indústria da fragrância13,32,33,34. Os avanços nas tecnologias de engenharia genética e transformação também tornaram os sistemas hospedeiros de plantas cada vez mais viáveis para a produção de produtos naturais de plantas9,14,35,36. Em particular, o parente próximo do tabaco, Nicotiana javanica, transformou-se um chassi amplamente utilizado para a análise e a engenharia do caminho terpenoid, devido à facilidade da transformação Agrobacterium-negociada de combinações múltiplas do gene , biossíntese eficiente de precursores endógenos e alta biomassa14,35,36.
Baseando-se nestas plataformas estabelecidas para a biossíntese terpenóide, descrevemos aqui métodos fáceis de usar e rentáveis para a produção enzimática de diterpenóides e a purificação de compostos individuais. Os protocolos apresentados ilustram como as plataformas de e. coli e de N. javanica projetaram para a biossíntese realçada do precursor do ciclodecanos podem ser utilizadas para a expressão combinatória de diferentes enzimas de ditpss e de P450 para gerar compostos diterpenóides desejados. A aplicação deste protocolo para produzir e purificar os diterpenóides estruturalmente diferentes é mostrada pelo exemplo de diterpenóides especializados do milho (Zea Mays), denominado dolabralexins, a biossíntese endógena de que recruta dois ditps e um P450 Enzima. A purificação de dolabralexins diferentes que variam das olefinas aos derivados oxigenados é conseguida então combinando a extração funil do funil com a cromatografia em grande escala da coluna do silicone e a cromatografia líquida de alta pressão preparativa (HPLC). Os protocolos descritos são otimizados para a produção de diterpenóides, mas também podem ser prontamente adaptados para classes terpenóides relacionadas, bem como outros produtos naturais para os quais os recursos enzimáticos estão disponíveis. Os compostos produzidos com esta abordagem são adequados para várias aplicações a jusante, incluindo, mas não se limitando a, a caracterização estrutural através da análise de ressonância magnética nuclear (RMN), utilização como substratos para estudos funcionais enzimáticos, e uma gama de ensaios de Bioatividade.

<table><tbody><tr><td>1020 bandejas</td><td>Greenhouse Megastore</td><td>CN-FLHD</td><td></td></tr><tr><td>2- (N-morfolino) ácido etanossulfônico</td><td>Sigma</td><td>M8250-500g</td><td>MES</td></tr><tr><td>4 "Tech Square Pot</td><td>McConkey Atacado Grower's Supply</td><td>JMCTS4</td><td></td></tr><tr><td>5977 Extrator XL MS</td><td></td> Agilent-7890B <td></td><td></td></tr><tr><td>GC</td><td></td> Agilent-Acetonitrile <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>271004</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher</td><td>BP1423-2</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura bacteriana</td><td>Fisher</td><td>BP9727-2</td><td></td></tr><tr><td>Copo</td><td>CTechGlass</td><td>BK-2001-015B</td><td></td></tr><tr><td>Cap, parafuso azul de 9 mm, PFTE</td><td>Agilent</td><td>5185-5820</td><td>GC tampa do frasco</td></tr><tr><td>Carbenicilina</td><td>Genesee</td><td>25-532</td><td>Carb</td></tr><tr><td>Coluna</td> de cromatografia <td>de</td><td>cloro</td>50247423 <td>Fisher</td></tr><tr><td>Chlor</td><td>CTechGlass</td><td>CL-0015-022</td><td></td></tr><tr><td>Cúpula de umidade clara</td><td>Estufa Megastore</td><td>CN-DOME</td><td></td></tr><tr><td>ColiRollers Contas de chapeamento</td><td>Sigma</td><td>71013</td><td>Contas de vidro</td></tr><tr><td>Argamassas de porcelana CoorsTek Argamassa</td><td>Fisher</td><td>12-961A</td><td>Argamassa</td></tr><tr><td>de porcelana CoorsTek Pilões</td><td>Fisher</td><td>12-961-5A</td><td>pilão</td></tr><tr><td>Cloridrato de ácido delta-aminolevulínico</td><td>Sigma</td><td>50981039</td><td>Ácido aminoleucovolínico</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher</td><td>A962-4</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de etila</td><td>EtOH Fisher</td><td>E1454</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL Tubos de centrífuga cônicos</td><td>Fisher</td><td>14-432-22</td><td>Tubos de falcão</td></tr><tr><td>Fisherbrand Descartáveis Cuvetes</td><td>Fisher</td><td>14-955-127</td><td>cubeta</td></tr><tr><td>Fisherbrand Petri Placas com Tampa Transparente</td><td>Fisher</td><td>FB0875713</td><td>placa de Petri</td></tr><tr><td>Fisherbrand Polipropileno Microtubo Racks de Armazenamento Fisher</td><td></td><td>05-541</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher</td><td>G33-500</td><td></td></tr><tr><td>Hexanes</td><td>Fisher</td><td>H292-4 (CS)</td><td></td></tr> <tr><td>HP-5MS</td><td>Agilent</td><td>19091S-433 Adaptador de</td> entrada de <td>coluna GC</td></tr><tr><td></td><td>CTechGlass</td><td>AD-0006-003</td><td>adaptador de entrada de vidro</td></tr><tr><td>Isopropil &beta;-D-1-tiogalactopiranosídeo</td><td>Fisher</td><td>BP1755-100</td><td>IPTG</td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Fisher</td><td>BP9065</td><td>e</td></tr><tr><td>tampas KIM-KAP, descartáveis, polipropileno, Kimble Chase</td><td>VWR</td><td>60825-798</td><td>tampas de tubos de ensaio respiráveis</td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>Acros</td><td>223210010</td><td>MgCl2</td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio</td><td>Sigma</td><td>M7506-500g</td><td>MgSO4</td></tr><tr><td>Miracle-Gro Alimento vegetal multiuso solúvel em água</td><td>Miracle-Gro</td><td>2756810</td><td></td></tr><tr><td>Mixer Mill MM 200</td><td>Retsch</td><td>20.746.0001</td><td>tecido moinho</td></tr><tr><td>Nalgene Fernbach frasco de cultura</td><td>Sigma</td><td>Z360236</td><td>2,8 L frasco</td></tr><tr><td>New Brunswick I26</td><td>Eppendorf</td><td>M1324-0000</td><td>Incubadora agitada</td></tr><tr><td>Nicotiana benthamiana seed</td><td>USDA</td><td>Germplasm Repository Accession TW16</td><td>N. benthamiana</td></tr><tr><td>OverExpress C41(DE3) Células quimicamente competentes</td><td>Lucigen</td><td>60442</td><td>Células C41-DE3</td></tr><tr><td>Filme de embrulho Parafilm M</td><td>Fisher</td><td>S37440</td><td>Parafilm</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Sigma</td><td>P-9541</td><td>KCl</td></tr><tr><td>Fosfato de potássio dibásico anidro</td><td>Fisher</td><td>P288-3</td><td>Fosfato dipotássico</td></tr><tr><td>Fosfato de potássio monobásico</td><td></td><td></td><td>Fosfato monopotássico</td></tr><tr><td>Tubos de cultura descartáveis Pyrex, sem aro</td><td>Sigma</td><td>CLS9944516</td><td>tubos de ensaio</td></tr><tr><td>Piruvato Ácido Sal de Sódio</td><td>Fisher</td><td>501368477</td><td>Anel de Retorta de Sódio</td></tr><tr><td>Suportes</td><td>CTechGlass</td><td>ST00</td><td>suporte de anel</td></tr><tr><td>Riboflavin</td><td>Amresco</td><td>0744-250g</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicina</td><td>Sigma</td><td>R7382</td><td>Rif</td></tr><tr><td>Rotovap</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sand, tamanho de partícula de malha 50-70</td><td>Sigma</td><td>274739-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sílica</td><td>Fisher</td><td>AC241660010</td><td>gel de sílica</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Fisher</td><td>5271-3</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Fisher</td><td>SS266-1</td><td>NaOH</td></tr><tr><td>Espectinomicina</td><td>Fisher</td><td>501368607</td><td></td></tr><tr><td>Spec Funil Separatório Squibb</td><td>CTechGlass</td><td>FN-1060-006</td><td>Funil Separatório</td></tr><tr><td>Sunshine Mix #1</td><td>Sungro Horticultura</td><td></td><td>Potting soil</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Snap Cap Tubos de microcentrífuga de baixa retenção</td><td>Fisher</td><td>21-402-902</td><td>microtubo</td></tr><tr><td>Funil triangular</td><td>CTechGlass</td><td>FN-0035</td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Fisher</td><td>BP14212</td><td></td></tr><tr><td>Vial, parafuso, 2 mL, âmbar, WrtOn</td><td>Agilent</td><td>5182-0716</td><td>GC</td></tr><tr><td>frasco visível espectrofotômetro, V-1200</td><td>VWR</td><td>634-6000P</td><td>espectrofotômetro</td></tr><tr><td>ZORBAX Eclipse XDB-C18</td><td>Agilent</td><td>990967-202</td><td>Coluna HPLC</td></tr><tr><td>ZORBAX Eclipse XDB-CN</td><td>Agilent</td><td>990967-905</td><td>Coluna HPLC</td></tr></tbody></table>

uma abordagem personalizável para a produção enzimática e purificação de produtos naturais de diterpenóides

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Os diterpenóides formam uma classe diversa de produtos naturais de pequenas moléculas que são amplamente distribuídos pelos reinos da vida e têm funções biológicas críticas em processos de desenvolvimento, interações interorganismal e adaptação ambiental. Devido a essas várias Bioatividades, muitos diterpenóides também são de importância econômica como produtos farmacêuticos, aditivos alimentares, biocombustíveis e outros Bioprodutos. A genômica avançada e as abordagens bioquímicas permitiram um rápido aumento no conhecimento dos genes, enzimas e vias diterpenóides-metabólicos. No entanto, a complexidade estrutural dos diterpenóides e a estreita distribuição taxonômica de compostos individuais em muitas vezes apenas uma única espécie permanecem fatores constronômicos para sua produção eficiente. A disponibilidade de uma escala mais larga de enzimas metabólicas fornece agora recursos para produzir diterpenóides em títulos e na pureza suficientes para facilitar uma investigação mais profunda deste grupo importante do metabolito. Baseando-se em ferramentas estabelecidas para a coexpressão de enzimas microbianas e vegetais, apresentamos um protocolo facilmente operado e personalizável para a produção enzimática de diterpenóides em Escherichia coli ou Nicotiana javanica, e a purificação de produtos desejados através de cromatografia de sílica e HPLC semipreparativa. Usando o grupo de diterpenóides do dolabralexin do milho (Zea Mays) como um exemplo, nós destacamos como as combinações modulares de enzimas do diterpenos sintase (ditps) e do citocromo P450 monooxigenase (P450) podem ser usadas para gerar andaimes ciclodecanos diferentes. Compostos purificados podem ser usados em várias aplicações a jusante, tais como análises estruturais do metabolito, estudos de função da estrutura enzimática e experimentos de Bioatividade in vitro e em planta.

Fluxo de trabalho esquemático para produção de diterpenóides usando E. coli A Figura 1 ilustra o fluxo de trabalho descrito para produção de diterpenóides. O protocolo esboçado aqui foi adaptado de uma plataforma previamente descrita de E. coli para a biossíntese do ciclodecanos13,32 para o uso de culturas do maior-volume e a purificação de produtos desejados do ciclodecanos através da sílica Cromatografia. Para demonstrar o uso deste protocolo, utilizou-se uma via de dolabralexina recém-identificada do milho que compreende dois diTPSs, ZmAN2 (Zm00001d029648) e ZmKSL4 (Zm00001d032858), um P450 multi-funcional (CYP71Z18, Zm00001d014134) e um citocromo P450 redutase (ZmCPR2, Zm00001d026483) (Figura 2). Em suma, as células competentes de e. coli BL21DE3-C41 foram pré-transformadas com o pcdfduet: IRS e pacyc-Duet: ggpps/ZmAN2 plasmídeos13,32. O pcdfduet: o plasmídeo do IRS contem enzimas chaves para a produção do precursor do ciclodecanos, incluindo 1-deoxy-d-xylulose-5-phosphate sintase (DXS), 1-deoxy-d-xylulose-5-fosfato redutase (DXR), e isopentenila difosfato isomerase (IDI), e foi mostrado para aumentar a formação do ciclodecanos em e. coli13. O pacyc-Duet: o plasmídeo de ggpps/ZmAN2 contem o milho ent-copalyl difosfato sintase ZmAN2 e um sintase de GGPP de Abies grandis. As enzimas que catalisam as reações comprometidas na biossíntese de dolabralexin foram então transformadas em plasmídeos pET28b: ZmKSL4 e petduet: ZmCPR2/ZmCYP71Z18. Para detalhes sobre sequências e construções de plasmídeo ver mafu et al. 201839.
Um cromatograma GC-MS dos produtos enzimáticos extraídos é mostrado na Figura 3a, ilustrando a formação de três compostos de dolabralexina, a saber, o dolabradieno (1,2 ± 0,25 mg/l cultura), epoxydolabrene (0,65 ± 0,2 mg/l cultura), e epoxydolabranol (11,4 ± 1,1 mg/L cultura) como quantificada com base em uma curva padrão usando o diterpenóide sclareol. O sclareol foi utilizado como padrão de referência, devido à sua estrutura semelhante e propriedades químicas em relação às dolabralexinas. Os subprodutos menores tipicamente observados incluem o cloranfenicol, o oxindol de derivados indol e o indol-5-aldeído, e o precursor do difosfato de difosfato (GGPP) (Figura 3). Indole geralmente representa o subproduto primário, mas não é mostrado aqui, devido ao seu tempo de retenção mais curto do que o atraso de solvente definido de 7 min para preservar a integridade do instrumento GC-MS.
Fluxo de trabalho esquemático da produção de diterpenóides utilizando N. javanica A Figura 4 retrata uma visão geral da expressão da via dolabralexina em N. javanica. Para os produtos aqui descritos, os seguintes constructos foram transformados separadamente em estirpe de a. tumefaciens GV3101: pLife33: P19 (expressando a proteína supressora de silenciamento de genes P19), PLife33: ZmCYP71Z18, PLife33: ZmAN2, PLife33: ZmKSL4. Seqüências nativas de comprimento total dos genes do trajeto do dolabralexin do milho foram usadas no vetor binário do T-ADN pLife3341 com resistência do canamicina para A propagação em e . coli e A. tumefaciens. A coexpressão dos genes de via terpenóide upstream é opcional, uma vez que o difosfato de difosfato precursor é formado endogenamente em N. benthamiana. Entretanto, diversos estudos empregaram com sucesso tais aproximações para aumentar a formação do ciclodecanos em N. javanica14,36,41. Como ilustrado na Figura 3, a coexpressão produziu com sucesso o dolabradiene e 15,16-epoxydolabrene. Diferentemente da coexpressão enzimática em E. coli, 15, 16-epoxydolabranol não foi detectada em extratos metabólito.
A presença de 15,16-epoxydolabrene em extratos foliares demonstrou a atividade de CYP71Z18 em N. javanica. Como 15, 16-epoxydolabranol mostrou-se estável após a extração de culturas microbianas (Figura 3), bem como após o isolamento de tecidos de raízes de milho em estudos anteriores39, parece plausível que o produto hidroxilado é glicosilado por glicosiltransferases endógenas e subsequentemente seqüestrado no vacuol, tornando-o inacessível à extração com as misturas orgânicas do solvente usadas aqui para a extração36,43,44,45 ,46. Modificações de produto indesejáveis semelhantes no contexto da engenharia de vias em N. javanica foram relatadas em estudos anteriores47. Como mostrado para a coexpressão em E. coli, a expressão transitória em N. javanica resulta na extração de vários subprodutos, incluindo os alcanos lineares de comprimento de cadeia diferente como baseado na comparação com bases de dados de espectros de massa de referência. Os títulos compostos extraídos do material foliar foram encontrados em média 2,4 +/-0,5 mg dolabradiene e 0,9 +/-0,3 mg 15,16-epoxydolabrene por g tecido foliar seco. Estes títulos não podem ser comparados diretamente ao sistema da co-expressão de E. coli dado os diferentes set-ups experimentais.
Purificação de diterpenoid A purificação do diterpenoid foi conseguida usando a cromatografia da coluna do silicone e a HPLC semipreparative subseqüente. Extratos metabólito de 12 L de culturas de E. coli agrupadas foram purificados utilizando cromatografia em coluna de sílica para separar os três compostos de dolabralexina focal (Figura 3a). A cromatografia de sílica é ideal para alcançar a alta pureza dos compostos alvo, uma vez que permite a separação simples de olefinas de diterpeno e derivados oxigenados, e remove prontamente o principal contaminante, o oxindol, que é retido na matriz de sílica ( Figura 3a).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig1.jpg"> Figura 1: fluxo de trabalho para produção de diterpenóides em e . coli e purificação de metabolito de culturas bacterianas líquidas. As caixas tracejadas descrevem etapas opcionais onde a purificação adicional é exigida. (A) imagem representativa da cultura de E. coli extraída utilizando um funil separatório. (B) imagem representativa da purificação do extrato metabólito utilizando cromatografia de sílica.   <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig2v2.jpg"> Figura 2: caminhos biossintéticos de Dolabralexin e construções genéticas utilizadas neste estudo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig3v2.jpg"> Figura 3: resultados do GC-MS. São mostrados os cromatogramas GC-MS representativos de produtos purificados de diterpenóides obtidos por meio de ensaios de coexpressão enzimática em (A) e . coli e (B) N. javanica. As identificações de produto baseiam-se em comparações com padrões autênticos e espectros de massa de referência da biblioteca espectral de massa do Instituto Nacional de normas e tecnologia (NIST). 1, Oxindol; 2, indol-5-aldeído; 3, pyrrolo [1,2-a] pirazina-1,4-diona, hexahydro-3-(2-metilpropil)-; 4, 6-O-acetil-1-[[4-bromophenyl] THIO]-a-d-glucoside S, S-dióxido; 5, dolabradieno; 6, 15, 16-epoxydolabrene; 7, pyrrolo [1,2-a] pirazina-1,4-diona, hexahydro-3-(fenilmetil)-; 8, 15, 16-epoxydolabranol; 9 e 12, desconhecido; 10, cloranfenicol; 11, 3, 7, 11, 15-tetrametil-2-hexígeno-1-ol; 13-16, alkanes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig4.jpg"> Figura 4: produção de Diterpenóides em N. benthamiana. (A) fluxo de trabalho de produção de diterpenóides em n. javanica e purificação de metabolito a partir de material foliar. (B) imagem representativa de plantas de n. javanica prontas para experimentos de infiltração, antes da poda. (C) imagens representativas de plantas de N. javanica após a poda. (D) imagem da seringa-folhas infiltradas. Áreas mais escuras foram infiltradas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Aqui apresentamos protocolos de fácil utilização para a produção e purificação de metabólitos diterpenóides através da expressão combinatória de enzimas biossintéticas em Escherichia coli ou Nicotiana javanica, seguida de produto cromatográfico Purificação. Os metabólitos resultantes são adequados para vários estudos, incluindo caracterização de estruturas moleculares, estudos funcionais enzimáticos e ensaios de Bioatividade.

Uma abordagem personalizável para a produção enzimática e purificação de produtos naturais de Diterpenóides

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Este protocolo é adequado para produzir diterpenóides purificados que podem ser usados para diferentes análises a jusante e podem ser personalizados para uma gama de diferentes alvos metabólitos. A principal vantagem deste método é que é um método simples e barato para produzir quantidades miligramas de metabólitos especializados. Ao trocar os genes e enzimas usados para co-expressão, este método pode ser modificado para produzir outros terpenóides, incluindo monoterpenóides e sesquiterpenóides, bem como outras classes metabólicas, como flavonoides.Para produção e transformação metabólicas diterpenóides, comece pelo aquecimento quimicamente competente células E.coli no gelo. Quando a cultura descongelar, adicione 25 microliters de células competentes por construção a um microtubo refrigerado de 1,5 mililitro e adicione 1 microlitra de uma solução de 100 nanogramas por microlitra de cada construção usada para co-expressão. Incubar as misturas no gelo por 30 minutos com uma mistura suave a cada 10 minutos raspando os tubos através de um rack de microtubo.No final da incubação, o calor choca as misturas celulares a 42 graus celsius por um minuto antes de colocar as células de volta no gelo por pelo menos mais dois minutos. Em seguida, adicione 200 microliters de 37 graus celsius soc médio aos tubos. E incubar as culturas por uma hora a 37 graus celsius e 200 rotações por minuto.No final da incubação, adicione aproximadamente 10 contas de vidro autoclavadas e 100 microliters de células a um caldo de nhogogênio aquecido de 37 graus celsius com os antibióticos apropriados. E agite a placa horizontalmente com a tampa no lugar para distribuir uniformemente as células. Em seguida, bata suavemente as contas de vidro em um recipiente de lixo e incubar a placa a 37 graus celsius durante a noite, revestida de superfície para baixo.No dia seguinte, retire a placa da incubadora. Adicione 5 mililitros de caldo de lysogeny recém-preparado com os antibióticos apropriados a um tubo de vidro estéril de 15 mililitros com uma tampa respirável de plástico por cultura planejada de 1 litro, e use uma ponta de pipeta para escolher colônias E.Coli transformadas individuais da placa de ágar. Adicione uma colônia escolhida a cada um dos tubos preparados de 15 mililitros e tampa cada tubo com a tampa de plástico respirável que acompanha.Em seguida, coloque as pequenas culturas E.coli tampadas em uma incubadora de agitação de 37 graus celsius por 12 a 24 horas. No dia seguinte, adicione 100 mililitros de PBS de 10x a 900 mililitros de caldo fantástico em um frasco de 1 litro por pequena cultura com os antibióticos apropriados. E coloque os frascos a 37 graus celsius e 140 rotações por minuto por aproximadamente 30 minutos.Quando o caldo fantástico estiver quente, adicione todo o volume de 5 mililitros de cada cultura de inoculação a um frasco de cultura de 1 litro por cultura. E coloque os frascos na incubadora a 140 rotações por minuto durante aproximadamente 3 horas. Quando a densidade óptica de 600 nanômetros atingir 0,6, reduza a temperatura da incubadora para 16 graus celsius.Uma vez que a incubadora tenha esfriado, adicione 1 mililitro de um IPTG molar, 1 mililitro de 4 gramas por litro de riboflavina e 1 mililitro de ácido aminolevulinic recém-preparado para cada cultura. Para a produção de diterpenóides, adicione 25 mililitros de um piruvato de sódio molar a cada cultura para garantir uma formação precursora suficiente. Em seguida, incubar as culturas a 16 graus celsius e 140 rotações por minuto durante 72 horas, adicionando 25 mililitros de piruvato de sódio diariamente às culturas apropriadas.Para separação metabólica e purificação, fixar um funil separador em um suporte de anel em um capô de fumaça. E coloque um recipiente de lixo sob o funil. Despeje 500 mililitros de uma solução 50/50 de acetato etílico e hexanos no funil separador.E adicionar 500 mililitros da cultura de co-expressão transformada de E.coli no funil. Coloque a rolha de vidro no funil e agite o funil 5 a 10 vezes para misturar a cultura com o solvente de extração, abrindo frequentemente o espigão enquanto o funil está de cabeça para baixo e aponte-o para o capô da fumaça para desgas o funil. Depois de uma segunda rodada de agitação e desgaseamento como apenas demonstrado, coloque o funil ereto no suporte do anel por aproximadamente um minuto.Quando a camada de solvente superior tiver se separado da camada de cultura aquosa, remova a rolha e escorra a camada E.coli em um béquer de resíduo, mantendo a camada de solvente dentro do funil. Em seguida, repita a extração com os 500 mililitros restantes da cultura usando os mesmos 500 mililitros de solvente usados para a primeira extração, antes de drenar o solvente contendo os metabólitos extraídos em um frasco limpo. Aqui, nosso cromatógrafo de espectrometria de massa gasosa representativo é mostrado.Subprodutos menores comumente observados incluem clororamfenicol e os derivados indol oxindole e pivalaldeído indole. Após a purificação de diterpenóides através da cromatografia da coluna de sílica, três compostos de dolabralexina podem ser obtidos, conforme quantificado com base em uma curva padrão usando o diterpenoid sclareol. A cromatografia de sílica é ideal para alcançar uma alta pureza dos compostos alvo.Uma vez que permite a simples preparação de olefinas diterpene e derivados oxigenados e prontamente remove o oxindole contaminado principal, que é retido na matriz de sílica. Além disso, a co-expressão dos genes da via terpenóide pode ser usada para produzir diterpenóides em N.Benthamiana, resultando na produção de dolabradiene e 15, 16 epóxidolabrene. Os solventes utilizados durante a extração devem ser otimizados para as propriedades químicas físicas dos metabólitos de interesse e não devem ser misturados com água para manter duas camadas distintas.Após este procedimento, metabólitos purificados podem ser usados para análise a jusante, incluindo análise estrutural e ácidos antibióticos. Esta técnica permitiu a descoberta de novos diterpenóides, incluindo os aqui mostrados, permitindo que esses metabólitos fossem analisados para sua estrutura química e novas biativas. Tome precauções ao usar solventes orgânicos em um funil separador.Certifique-se sempre de descartar resíduos biológicos de acordo com seus padrões de segurança de laboratório.

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