Name: Testes anticorpos anti-RDL e Anti-mglutr1 em seções cerebrais de abelhas usando CRISPR-Cas9 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Aprenda a usar CRISPR-Cas9 para editar genes de receptores GABAA e glutamato metabotrópico em cérebros de abelhas adultas. Este método permite estudar funções proteicas e testar especificidade de anticorpos em neurociência.

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Este trabalho foi apoiado pelos seguintes prêmios à BHS: Human Frontiers Science Program; NIH NIGMS (R01 GM113967); NsF Ideas Lab (1556337). O peptídeo e os anticorpos do DmGluRA foram projetados no laboratório Dr. Serge Birman (Marselha, Luminy, França) quando o EI foi apoiado pelo Programa d'Urgence FRM/Postdocs UFP20060306548 do Derramamento de Fondation la Recherche Medicale. Somos gratos por Daniela Junqueira Marosi e Alex Hanter, da Integrated DNA Technology (IDT), pela ajuda com o design de guias RDL e ensaios de entrega qPCR.

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Os autores não têm nada para divulgar.

Caracterização do anti-RDL e anti-mGlutR1 Primeiro, caracterizamos os anticorpos anti-RDL e anti-mGlutR1 por imunoblote e pré-adsorção nas fatias de cérebros fixos de abelhas. Cada anticorpo foi feito para reconhecer todas as suas isoformas conhecidas, e a análise ocidental mostra que eles reconhecem bandas que correspondem aos seus pesos moleculares previstos. Em seguida, ambos os anticorpos foram bloqueados pelo peptídeo conjugado contra o qual foram produzidos em seções cerebrais de abelhas.
Um dos primeiros objetivos em nosso estudo foi estabelecer que os anticorpos produzidos contra o peptídeo conjugado específico são específicos para sua proteína no tecido cerebral fixo. Para isso, aproveitamos o sistema CRISPR-Cas9. Projetamos guias específicos para rdl de abelhas e mGlutR1 e usamos cada um deles para fazer CRISPR-Cas9 rotulado com a sonda fluorescente ATTO550. Para cada receptor, injetamos uma mistura de três ribonucleoproteínas CRISPR-Cas9 diferentes no ocelli para reduzir a quantidade da proteína direcionada no cérebro de abelha adulta, eliminando o gene correspondente em células que tomaram nosso sistema Cas9 projetado. Em nosso estudo, realizamos esse passo.
Um dos primeiros passos cruciais para o sucesso desses experimentos é projetar o guia apropriado RNAs. Recomendamos projetar até cinco RNAs guias, localizados no início, meio e o fim da sequência genética. Em nosso trabalho preliminar, testamos em várias combinações em três a cinco abelhas. Também tentamos diferentes concentrações de injeções, bem como tempos após a injeção, e várias misturas de RNP nas injeções. Dissecamos cérebros e os processamos usando anticorpos anti-RDL e anti-mGlutR1. Nestes testes iniciais, estabelecemos a combinação apropriada, o tempo pós-injeção, bem como a concentração e quantidade de CRISPR-Cas9 para injeção. Estes testes iniciais foram a base para a criação dos experimentos que descrevemos em detalhes aqui.
O objetivo era duas vezes: 1) demonstrar em uma abelha que nossa coloração de anticorpos foi reduzida após o tratamento com CRISPR-Cas9 e 2) para trabalhar as melhores condições experimentais para estudos comportamentais. Assim, mostramos que se muitos núcleos celulares contiverem crispr-cas9 48 h após a injeção, a redução da coloração anti-RDL e anti-mGlutR1 é significativa. Além disso, isso demonstra que os anticorpos testados reconhecem especificamente a proteína mGlut1 e RDL na preparação cerebral da abelha e que podem ser usadas para estudos de localização no cérebro de abelhas.
Configuração experimental CRISPR-Cas9 para estudo comportamental Em seguida, montamos os experimentos para que o CRISPR-Cas9 pudesse ser usado em estudos comportamentais. Oito ou nove abelhas foram coletadas para controle e tratamentos experimentais. Eles foram testados comportamentalmente antes e depois da injeção, e então seus cérebros foram processados para ATTO550 e/ou imunocitoquímica para determinar as regiões cerebrais que mostraram redução da proteína-alvo. Aqui é essencial notar que o número de abelhas levadas para um conjunto de experimentos foi limitado a não mais do que 8-9 abelhas para o controle e condições experimentais. Desta forma, ambas as condições podem ser testadas no mesmo dia. Além disso, uma vez que preparamos as misturas CRISPR-Cas9 para injeção, nunca as congelamos. A mistura CRISPR-Cas9 não mudou de potência quando usada 3 dias seguidos e mantida em 4-8 °C. No entanto, não o testamos depois de 3 dias.
Como descrevemos na seção resultados para ambos os conjuntos de injeções experimentais e para ambos os anticorpos, apenas três abelhas de 16 testadas mostraram uma grande distribuição ATTO550 no corpo de cogumelos, protocerebrum e lóbulos antenais. Em todas as outras abelhas, a distribuição do CRISPR-Cas9 foi limitada ao corpo de cogumelo, complexo central e/ou protocerebrum posterior. É essencial entender para qualquer estudo comportamental que usando este método de injeção a redução da proteína-alvo será restrita apenas ao corpo de cogumelo na maioria das abelhas. Não se estenderá ao lóbulo antena ou gânglio subesofágico. Assim, a técnica de injeção que usamos é adequada para estudar o efeito da redução de receptores no corpo de cogumelo e complexo central em experimentos comportamentais, enquanto um método diferente de introdução do CRISPR-Cas9 será mais apropriado para estudar outras regiões cerebrais.
Em conclusão, nosso estudo demonstrou a aplicação bem sucedida do CRISPR-Cas9 como um controle para a coloração de anticorpos no cérebro. Para ambos os anticorpos (anti-RDL e anti-mGlutR1), quando a captação de mGlutR1-CRISPR-Cas9 ou RDL-CRISPR-Cas9 foi bem sucedida, o nível de coloração de anticorpos correspondente também foi reduzido significativamente. Além disso, é essencial notar que a injeção no ocelli levou a uma distribuição de CRISPR-Cas9 no cérebro que não era homogênea. A distribuição variou de uma área mínima ao redor do corpo de ocelli e cogumelo até muitas células em todo o cérebro. A variabilidade da captação mGlutR1 ou RDL-CRISPR-Cas9 pelas células provavelmente deveu-se à variação das injeções. Nossos dados mostram que o sistema CRISPR-Cas9 funciona em abelhas, mas o método de injeção precisa ser melhorado para reduzir a variabilidade da captação CRISPR-Cas9 em cérebros individuais de abelhas. Dentro dessas restrições, agora é possível empregar essa técnica para manipular genes em abelhas adultas para experimentos comportamentais.

O sistema CRISPR/Cas9 recentemente descoberto é uma ferramenta poderosa que tem sido usada para alterar o DNA genômico em vários sistemas e organismos de modelos. Acelerou a pesquisa biomédica e grandes avanços tecnológicos, tornando a modificação do genoma mais eficiente e robusta do que os métodos anteriores1. Nativo da bactéria S. pyógenes, o sistema conta com uma endonuclocaçãa cas9, cuja atividade leva a quebras duplas encalhadas (DSBs) no DNA, e um Guia RNA (gRNA) que direciona a proteína Cas9 para um local específico, dependente de sequência2. Pausas duplas-encalhadas geradas pelo CRISPR/Cas9 podem ser reparadas através de uma junção final não homologous (NHEJ), um processo propenso a erros que pode levar a mudanças de quadros ou reparo direto de homologia quando um modelo de doador está presente. O gRNA em si consiste em um CrispR RNA (crRNA) específico para alvos e um crRNA transativador universal (tracrRNA) que pode ser quimicamente sintetizado e entregue com nuclease Cas9 purificado como um complexo ribonucleoprotein (RNP)2,3. A rotulagem fluorescente do gRNA ou nuclease Cas9 pode permitir a detecção e visualização intracelular de componentes moleculares através de microscopia fluorescente4.
Em nosso trabalho atual, aproveitamos o sistema CRISPR-Cas9 para reduzir os níveis de proteína em cérebros adultos de abelhas. Estudamos o receptor glutamato metabotropic (mGluR) e anticorpos receptores anti-mGlutR1 e os anticorpos de subunidade RDL e anti-RDL do receptor GABAA. Desenvolvemos um método simples para reduzir a quantidade de proteína no cérebro da abelha adulta e a usamos para conduzir testes adicionais dos anticorpos desenvolvidos contra as proteínas correspondentes. O monitoramento da fluorescência do CRISPR-Cas9 nos permitiu estimar as áreas e células envolvidas na redução da proteína.
Usando este método, também caracterizamos os anticorpos anti-mGlutR1 que foram feitos em coelhos contra o peptídeo conjugado. O genoma da abelha codifica um AmGluRA altamente conservado (chamado mGlutR1 de acordo com a nomenclatura NCBI) receptor glutamato metabotropic5. O gene honeybee mGlutR1 tem quatro variantes de splice previstas de acordo com o banco de dados NCBI. Foi relatado que está expresso no sistema nervoso central (SNC) tanto de fase de abelhas pupa quanto adulta e está envolvido na formação de memória de longo prazo5. Anticorpos desenvolvidos contra mGlutR1 podem ser uma ferramenta essencial para estudar o sistema glutamatergico no processo de aprendizagem e memória em abelhas.
Em nossos estudos, também caracterizamos anticorpos anti-RDL desenvolvidos em coelhos imunizados com peptídeos conjugados da subunidade receptorapifera RDL. O gene Honeybee Rdl, AmRdl (XM_006565102.3, banco de dados NCBI), tem 14 variantes de emenda previstas. Um fragmento parcialmente clonado foi relatado no banco de dados da NCBI AF094822.1. A função receptora RDL e sua fisiologia são bem estudadas em insetos6,7,8, incluindo abelhas9,10,11. Anticorpos desenvolvidos contra o anti-RDL podem ser uma ferramenta essencial para estudar o sistema GABAergic no processo de aprendizagem e memória em abelhas.
Um estudo anterior sobre o papel dos receptores de octopamina e tirasmina usou RNAi injetado no cérebro com um teste subsequente da quantidade de proteína pela mancha ocidental12,13. No entanto, a RNAi tem algumas limitações significativas. Há apenas uma janela de curto tempo após a injeção RNAi dentro da qual ocorre uma redução da proteína13. CRISPR-Cas9 foi usado muito recentemente em embriões de abelhas para excluir ou modificar genes em todo o animal14,15,16. Reportamos o uso de CRISPR-Cas9 para reduzir a quantidade de proteína na abelha adulta. Desenvolvemos essa abordagem para abelhas devido à capacidade de acopla-la a estudos comportamentais de aprendizagem e memória em condições laboratoriais controladas17.
No presente trabalho, desenvolvemos anticorpos contra dois receptores e os testamos nas seções cerebrais de abelhas adultas depois que a proteína foi reduzida pela injeção CRISPR-Cas9. Ao mesmo tempo, estabelecemos um projeto experimental que permite o uso do método para experimentos comportamentais.

<table><tbody><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283_100 mL</td><td>western blotting</td></tr><tr><td>Acrilamida-bis Acrylamide</td><td>Bio-Rad</td><td>500 mL 1610156</td><td>western blotting</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0169-250g</td><td>usado com água destilada para fixar o cérebro da abelha em blocos</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragmento Burro Anti-Coelho IgG (H+L)</td><td>Jackson Laboratórios de Pesquisa</td><td>711-546-152</td><td>anticorpo secundário para revelar os anticorpos primários de coelho</td></tr><tr><td>Alt-R CRISPR-cas9 tracrRNA-5'ATTO</td><td>IDT</td><td>1075934</td><td>com RNA guia desingado, cria gRNA</td></tr><tr><td>Alt-R S.p. Cas9 nuclease V3</td><td>IDT</td><td>1081058</td><td>enzima usada para fazer ribonucleoproteína para o sistema CRISPR</td></tr><tr><td>Persulfato de amônio</td><td>Bio-RAD</td><td>10 g 1610700</td><td>western blotting</td></tr><tr><td>Anticorpos anti-mGlutR1</td><td>Covalab (FRANÇA)/21st Century Biochemical</td><td>caracterizado pelos autores no presente artigo</td><td>Usado para incubação primária de mGlut 1 em abelhas</td></tr><tr><td>Anticorpos anti-RDL</td><td>21st Century Biochemical</td><td>caracterizado pelos autores no presente artigo</td><td>Usado para incubação primária de RDL em abelhas</td></tr><tr><td>Aprotinina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0001154</td><td>inibidor de protease</td></tr><tr><td>Barraquer Iris Scissors 7mm Lâmina Ponta afiada</td><td>World Precision Instruments</td><td>14128-G</td><td>usado para dissecação de cérebro de abelha benzamidina</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12072</td><td>inibidor de protease</td></tr><tr><td>Lâmina (quebrável) para porta-lâmina</td><td>Ferramenta de Ciência Fina</td><td>10050-00</td><td>dissecação para mancha ocidental</td></tr><tr><td>Suporte de lâmina e disjuntor</td><td>Ferramenta de Ciência Fina</td><td>15309</td><td>dissecação para western blotting</td></tr><tr><td>Capilares de vidro borossilicato</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100 F</td><td>para procedimento de injeção</td></tr><tr><td>Substrato de detecção de western blot quimioluminescente</td><td>Bio-Rad</td><td>1705062</td><td>western blotting</td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472476-50mL</td><td>Isolamento de RNA</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Bio-Rad</td><td>1610611</td><td>western blotting</td></tr><tr><td>Kit fácil de DNA</td><td>QIAGEN</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>Kit de extração de DNA sem DNA</td><td>INVITROGEN</td><td>AM1907</td><td>Usado para remover a</td></tr><tr><td>pipeta DNA Eppendorf Research plus, pacote de 3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z683884</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 24 Poços Poliestireno Multipoços</td><td>Falcon</td><td>351147</td><td>Multiwell</td></tr><tr><td>Cápsulas de Incorporação de Fundo Plano,</td><td>Microscopia Eletrônica de Polietileno Cesta Science</td><td>70021</td><td>para seções cerebrais</td></tr><tr><td>Fórceps Dumont #5 (par)</td><td>Ferramenta de Ciência Fina</td><td>11254-20</td><td>para dissecação do cérebro de abelha da cabeça</td></tr><tr><td>Fórceps Dumont #5S (par)</td><td>Ferramenta de Ciência Fina</td><td>11252-00</td><td>para limpar o cérebro da traqueia antes da dissecação</td></tr><tr><td>Gene Expression Master Mix</td> Integrated <td>DNA</td> Technologies <td>1055770</td><td>qPCR drop off assay</td></tr><tr><td>Glutaraldeído</td><td>EMS</td><td>16220</td><td>usado para preparação de conjugados peptídicos para controle de peabsorção</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516-500 mL</td><td>western blotting, mídia de incorporação</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bio-Rad</td><td>1610718</td><td>western blotting</td></tr><tr><td>Hydrophobic filtered nylonmesh</td><td>Spectrum Labs</td><td>145910</td><td>para fundo da cesta para seções cerebrais</td></tr><tr><td>Isopropil álcool</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9030-50mL</td><td>Isolamento de RNA</td></tr><tr><td>Keyhole lapa hemocianina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7017</td><td>usado para preparação de conjugados para controle</td></tr><tr><td>LSM800 microscópio cofocal</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mGlu_Guide 1</td><td>IDT</td><td></td><td>projetado guia RNA para CRISPR-Cas 9. Sequências do genoma mGlutR1 alvo</td></tr><tr><td>mGlu_Guide 2</td><td>IDT</td><td></td><td>projetou RNA guia para CRISPR-Cas 9. Sequências do genoma mGlutR1 alvo</td></tr><tr><td>mGlu_Guide 3</td><td>RNA guia projetado por IDT</td><td></td><td>para CRISPR. Sequências do genoma mGlutR1 alvo</td></tr><tr><td>metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td>western blotting</td></tr><tr><td>Microplaca de PCR de 96 poços</td><td>Biossistema aplicado</td><td>4346907</td><td>ensaio de queda de qPCR e qRT-PCR</td></tr><tr><td>Microplaca de PCR de 384 poços</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z374911</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Óleo mineral</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904_500mL</td><td>para procedimento de injeção</td></tr><tr><td>Modelo p87 Extrator de Micropipeta Marrom Flamejante</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td>Preparação Capilar</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td>para solução de incorporação</td></tr><tr><td>Nanolitro 2000</td><td>World Precision Instruments Aparelho</td><td>de Injeção</td>de Nanolitros <td></td></tr><tr><td>Soro de Burro Normal</td><td>Jackson Research Laboratories AB_2337258</td><td></td><td>agente bloqueador para imunocitoquímica</td></tr><tr><td>Soro de cabra não imune</td><td>Invitrogen</td><td>50-062Z 100 mL</td><td>agente bloqueador para immunoblotting</td></tr><tr><td>Tampão livre de nuclease</td><td>IDT</td><td>1072570</td><td>Tampão livre de nuclease que é usado na preparação da injeção de CRISPR-Cas9</td></tr><tr><td>Água livre de nuclease</td><td>IDT</td><td>AM9337</td><td>água livre de nuclease que é usada na preparação do sistema CRISPR-Cas 9</td></tr><tr><td>OrbitalShaker Mp4</td><td>Genemate</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500 g</td><td>usado com PBS para fazer fixador para cérebros de abelhas</td></tr><tr><td>Fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626-250 mg</td><td>inibidor de protease</td></tr><tr><td>Tampão fosfato solução salina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-100TAB</td><td>Usado com paraformaldeído como fixador; tampão para anticorpos</td></tr></tbody></table>

testes anticorpos anti-rdl e anti-mglutr1 em seções cerebrais de abelhas usando crispr-cas9

Anti-RDL and Anti-mGlutR1 Receptors Antibody Testing in Honeybee Brain Sections using CRISPR-Cas9

Cluster Regularmente Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) é uma técnica de edição de genes amplamente utilizada em estudos de função genética. Usamos este método neste estudo para verificar a especificidade dos anticorpos desenvolvidos contra o inseto GABAA subunidade receptor Resistance to Dieldrin (RDL) e um receptor glutamato metabotropic mGlutR1 (mGluRA). Os anticorpos foram gerados em coelhos contra os peptídeos conjugados específicos das moscas frutíferas (Drosophila melanogaster) bem como para abelhas(Apis mellifera). Usamos esses anticorpos em seções cerebrais de abelhas para estudar a distribuição dos receptores em cérebros de abelhas. Os anticorpos foram purificados contra o peptídeo e testados com imunocoagulação e o método clássico de preadsorção com conjugados peptídeos para mostrar que os anticorpos são específicos para os conjugados correspondentes peptídeos contra os quais foram levantados. Aqui desenvolvemos a técnica CRISPR-Cas9 para testar a redução de metas proteicas no cérebro 48 h após injeção CRISPR-Cas9 com RNAs guia projetado para o receptor correspondente. O método CRISPR-Cas9 também pode ser usado em análises comportamentais nas abelhas adultas quando um ou múltiplos genes precisam ser modificados.

Testes de anticorpos anti-RDL Os anticorpos foram produzidos contra os conjugados de peptídeos RDL, como mostrado na Figura 1A. O primeiro passo para caracterizar os anticorpos anti-RDL é verificar o homogeneizado da proteína extraída do cérebro da abelha usando uma mancha ocidental com anticorpos anti-RDL e um anticorpo secundário igg de cabra rotulado por HRP(Figura 1A,inserção). Ambos os anticorpos anti-RDL reconheceram a banda localizada em ~50-60 kD (seta), correspondendo ao peso estimado das proteínas isoformes de subunidade RDL. Para demonstrar que anticorpos anti-RDL reconheceram o peptídeo nas fatias cerebrais, usamos um controle de preaversão(Figura 1B,C). Quando os anticorpos foram preincubados com peptídeos conjugados, a coloração na seção estava ausente. Isso demonstrou que os anticorpos anti-RDL reconheceram o peptídeo conjugado contra o qual foram levantados. Para demonstrar que os anticorpos anti-RDL reconhecem a proteína no tecido cerebral fixo, usamos o CRISPR-Cas9 para derrubar o gene RDL que produz a proteína RDL nas células. Figura 1D1-3, mostra controle seções cerebrais de abelhas frontals que foram rotuladas com anticorpos anti-RDL. Esta abelha não foi injetada com RDL-CRISPR-Cas9 RNP. Na Figura 1D1,anti-RDL rotula neuropilpiles na seção frontal do cérebro das abelhas. A mesma seção frontal na Figura 1D2 mostra a ausência de fluorescência da ATTO550, pois o complexo RDL-CRISPR-Cas9 não foi injetado.
A Figura 1E1-E3 mostra uma seção cerebral de uma abelha injetada com RDL-CRISPR-Cas 9 e depois processada com a mesma quantidade de anticorpos que o cérebro de controle na Figura 1D1-D3. A coloração anti-RDL foi significativamente reduzida em todo o cérebro 48 h após a injeção, e a distribuição da coloração ATTO550 no cérebro (Figura 1E2) mostra o sucesso das injeções RDL-CRISPR-Cas 9 no ocelli mediano da abelha. As múltiplas células dispersas do cérebro exibem ATTO550. A injeção bem sucedida de RDL-CRISPR-Cas 9 reduziu a expressão proteica em comparação com o controle (Figura 1E1-3). De oito cérebros de abelhas imunosmanchados, apenas um cérebro tinha um alto nível de distribuição do RDL-CRISPR-Cas9 nas células do corpo de cogumelo, protocerebrum e lobo antenal, enquanto outros cérebros tinham coloração celular com ATTO550 no calyx corporal de cogumelo, complexo central, mas não lobe antenal. É importante notar que nestas abelhas, a redução da imunocoloração anti-RDL não foi tão dramática quanto no cérebro mostrado na Figura 1E1.
Em seguida, para estimar o nível do gDNA RDL modificado nas abelhas 48 h após a injeção RDL-CRISPR-Cas9, realizamos um teste de entrega qPCR, onde a sonda de entrega foi projetada para combinar com a área de um dos gRNAs RDL. Nesses experimentos, nos cérebros das abelhas injetados com RDL-CRISPR-Cas 9, a redução relativa da fluorescência correspondia ao número de gDNA modificado nas amostras. Em nossos testes, a área correspondente a este guia no gDNA em 12 abelhas injetadas com RDL-CRISPR-Cas9 foram de 64 % ± (média ± 30 %SD) em comparação com gDNA em abelhas não injetadas(Figura 3A).
Em seguida, para estimar o nível do RNA RDL nas abelhas 48 h após a injeção, realizamos qRT-PCR em um grupo separado de abelhas(Figura 3B). Comparamos o nível de RNA RDL de abelhas injetadas RDL-CRISPR-Cas 9 (n = 19) com o nível de RNA em abelhas que não foram injetadas (n = 12). Nesses experimentos, a redução relativa do RDL mRNA foi de 59% ±(média ± 15% SE) em comparação com o nível de RNA em abelhas não injetadas. Quando examinamos o nível de RNA RDL em cada abelha individualmente, apenas 13 abelhas em 19 abelhas apresentaram uma redução significativa do RNA. Esses dados indicam que a injeção de abelhas injetadas RDL-CRISPR-Cas9 através do ocelli pode nem sempre atingir um grande número de células cerebrais, o que confirma os dados com abelhas injetadas RDL-CRISPR-Cas9 manchadas de RDL-CRISPR-Cas9. Nestas preparações, apenas uma abelha de 8 tinha RDL CRISP-Cas9 em muitas células cerebrais (corpo de cogumelo, protocerebrum e lobo antenal) em comparação com outros cérebros de abelhas, onde a distribuição do RDL-CRISPR-Cas9 estava concentrada em células no protocerebrum (calyx corpo de cogumelo e complexo central), mas não o lóbulo antenal(Figura 4A-D).
Testes anticorpos anti-mglutr1 Usamos os anticorpos anti-mGlutR1 produzidos em coelho contra peptídeos conjugados específicos do melanogaster Drosophila (Figura 2A). A sequência deste peptídeo mostra uma identidade de 94% com o peptídeo de abelha (CLSDKTRFDYFARTVPPD) Figura 2A. Primeiro, verificamos os anticorpos contra a proteína cerebral das abelhas usando imunocoagulante. O cérebro das abelhas homogeneado foi separado por 10% SDS-PAGE e eletrophoreticamente transferido para uma membrana de nitrocelulose e manchado com anti-mGlutR1. A inserção na Figura 2A mostra duas bandas com pesos estimados (103 e 83 kD) correspondentes a duas isoformas. Quando testamos este anticorpo em cérebros de abelhas, descobrimos que eles rotulam perfis neuropilar e células nas seções cerebrais das abelhas como ilustrado na Figura 2B,D. Após a preacisão do anticorpo anti-mGlutR1 com peptídeo conjugado-mGlutR1, a coloração específica desapareceu na fatia cerebral das abelhas(Figura 2C). Isso confirma que anticorpos anti-mGlutR1 reconhecem o peptídeo (Figura 2C). Em seguida, injetamos uma mistura de mGlutR1-CRISPR-Cas9 no ocelli mediano e usamos o noguideRNA de controle. Nas abelhas de controle (n = 7), a fluorescência da ATTO550 não estava concentrada nas células. Alguns cérebros tinham fluorescência dispersa etiquetando ATTO550. Assim, a preparação de controle na Figura 2D1-3 mostra a coloração anti-mGlutR1 no cérebro, mas não a fluorescência ATTO550. Quando mGlutR1-CRISPR-Cas9 foi injetado no ocelli e tomado por muitas células, o nível de fluorescência dos anticorpos secundários foi significativamente reduzido na área que capta o mGlutR1RNP funcional (Figura 2E1-3). As abelhas foram monitoradas por 48 h, e uma abelha de cada condição experimental foi encontrada morta. Assim, neste experimento, verificamos sete abelhas de controle e oito abelhas CRISPR-Cas9. Todas as abelhas injetadas com CRISPR-Cas9 tinham células que atiravam mGlutR1-CRISPR-Cas9. A maioria dessas células estavam no calyx do corpo de cogumelo, complexo central e protocerebrum posterior. Apenas duas em cada sete apresentaram rotulagem ATTO550 em muitas células do corpo de cogumelo, complexo central e o lobo antenal. Um exemplo de uma dessas abelhas é mostrado na Figura 2E. A redução do nível de coloração mGlutR1 nestas preparações foi significativa. As outras cinco abelhas têm rotulagem ATTO550 correspondente à entrega bem sucedida do mGlutR1 CRISPR-Cas9 no corpo do cogumelo e protocerebrum posterior, mas não nos lóbulos antenais.
Em seguida, para estimar o nível do gDNA mGlutR1 modificado nas abelhas 48 h após a injeção, realizamos um teste de entrega baseado em qPCR, onde a sonda de entrega foi projetada para estar na área perto do guia mGlutR1. Nesses experimentos, nos cérebros das abelhas injetados com mGlutR1-CRISPR-Cas 9, a modificação relativa do gDNA em 12 abelhas foi de 59% ± (média ± 33 %SD) em comparação com gDNA em abelhas não injetadas(Figura 3A).
Esses resultados também foram confirmados por testes qRT-PCR em um grupo diferente de abelhas, onde estimamos os níveis de RNA mGlutR1 usando qRT-PCR nas abelhas 48 h após injeções com RNPmGlutR1mix(Figura 3B). Comparamos o nível de RNA mGlutR1 das abelhas injetadas mGlutR1-CRISPR-Cas9 (n = 6) com os níveis de RNA em abelhas que não foram injetadas (n = 6). Nesses experimentos, a redução relativa do mGlutR1 mGlutR1 em abelhas injetadas foi de 53% ±(média ± 18% SE) em comparação com abelhas não injetadas(Figura 3B).
A seção de quatro abelhas diferentes que expressavam o RNP RDL-CRISPR-Cas9 na célula kenyon de corpo de cogumelo é mostrada na Figura 4A-D. O exemplo de abelha com fluorescência ATTO50 no corpo do cogumelo e o lobo antenal é mostrado na Figura 4E,F.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Guias</td>
			<td>Seqüências</td>
			<td>gRNA</td>
			<td>Rnp</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>[guideRNA:tracrRNA]</td>
			<td>[gRNA:Cas9 Nuclease]</td>
		</tr>
<tr>
<td>RDL_Guide1</td>
			<td>ACCGTAACGCGCCGCGCT</td>
			<td>GRDL1</td>
			<td>RRDL1</td>
		</tr>
<tr>
<td>RDL_Guide2</td>
			<td>AACGTCGATCGACTTGACGT</td>
			<td>GRDL2</td>
			<td>RRDL2</td>
		</tr>
<tr>
<td>RDL_Guide3</td>
			<td>CCATGACGAAAACACGTGCCC</td>
			<td>GRDL3</td>
			<td>RRDL3</td>
		</tr>
<tr>
<td>mGlu_Guide 1</td>
			<td>CGAAAGTTATCTGACGGTGTGTGT</td>
			<td>GMGL1</td>
			<td>RMGL1</td>
		</tr>
<tr>
<td>mGlu_Guide 2</td>
			<td>TTCAACGAGAGCAAAGTTCAT</td>
			<td>GMGL2</td>
			<td>RMGL2</td>
		</tr>
<tr>
<td>mGlu_Guide 3</td>
			<td>GCAAACGTCGGTAGGAGTGA</td>
			<td>GMGL3</td>
			<td>RMGL3</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Sequências nucleotídeas de guias projetados para RDL e mGlutR1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59993/59993fig1a.jpg"> Figura 1: Caracterização de anticorpos anti-RDL. (A)Esquemática da subunidade RDL, onde os círculos rosas indicam a localização do peptídeo 2 (cvnekqsyfhiattsnefiri-amide) no N-terminus e peptídeo 1 (CVRFKVHDPKAHSKGGTL-amide intracelular) no Terminal C. A inserção em A mostra as bandas na mancha ocidental de extratos cerebrais de abelhas processados com anticorpos anti-RDL correspondentes (um com pep1 anti-RDL e pep2 anti-RDL). Cada imunoblot mostra o tamanho aparente da proteína ~50-60 kD, correspondendo aos pesos estimados das várias isoformes das subunidades RDL. (B,C) Preaferionação dos anticorpos anti-RDL com peptídeo conjugado 1. A imagem em C mostra uma redução na coloração na seção quando os anticorpos foram preincubados com peptídeo conjugado 1. O corpo em forma de ventilador (Fb) e o corpo elipsoide (eb) são estruturas complexas centrais no cérebro. M = lobo medial do corpo de cogumelo. (D1-3) A coloração anti-RDL de um controle, seção de cérebro de abelha não injetada após 48 h. Green indica o perfil positivo anti-RDL no cérebro. (D2) Esta abelha não foi injetada e não contém fluorescência ATTO550. (D3) Imagens mescladas de D1 e D3. (E1-3) A injeção de RDL-CRISPR-Cas9 reduziu a coloração anti-RDL após 48 h. (E2) fluorescência ATTO550 nos núcleos celulares indicou a entrega bem sucedida RDL-CRISPR-Cas9. (E3) A imagem mesclada de anti-RDL (verde) e ATTO550 (vermelho). Barra de escala = 100 μm (B-E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59993/59993fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59993/59993fig2a.jpg"> Figura 2: Caracterização de anticorpos anti-mGlutR1. (A)Esquema de GCPR mGluR que mostra o peptídeo de melanogaster Drosophila usado para imunização. Para comparação, o peptídeo Apis mellifera é mostrado abaixo. O círculo indica a localização do peptídeo no terminal N do domínio extracelular do receptor mGlutR1. A inserção em A mostra que os anticorpos anti-mGlutR1 reconheceram duas bandas na mancha ocidental de cérebros de abelhas ~103 kD e ~83 kD que correspondem aos pesos estimados de isoformas conhecidas. (B,C) Controle de preadição do anticorpo anti-mGlutR1 em duas seções consecutivas do lobo-antena glomeruli. A imagem do anti-mGlutR1 na seção glomeruli antenal em C mostra a redução da coloração como resultado da preincubação do peptídeo anti-mGlutR1 com o anticorpo anti-mGlutR1. Esse procedimento faz com que o anticorpo se precipitasse fora da solução, o que abolia a coloração em comparação com B (controle, ausência do peptídeo na preincubação). (D1) mostra a coloração de anti-mGlutR1 em uma fatia cerebral de abelha após uma injeção de controle no ocelus mediano. Esta injeção não tinha o gRNA mGlutR1 que permite a derrubada de receptores mGlutR1 pelo CRISPR-Cas9, e assim a coloração do anticorpo anti-mGlutR1 não foi reduzida (verde). (D2) A ausência de fluorescência ATTO550 indica a ausência de CRISPR-Cas9 funcional no cérebro. (D3) Imagens mescladas de anti-mGlutR1 e ATTO550. (E1-E3) mostra a coloração de anti-mGlutR1 em uma seção cerebral onde mGlutR1 foi permanentemente derrubado 48 h após injeção com mGlutR1-CRISPR-Cas 9 no ocelus mediano. Assim, a coloração neste cérebro é muito reduzida devido ao nocaute bem sucedido do mGlutR1 em muitas células. (E2) A coloração ATTO550 em muitos núcleos celulares nos cérebros das abelhas indica que a injeção de mGlut1-CRISPR-Cas 9 foi bem sucedida. (E3) Imagem mesclada de ATTO550 (vermelho) e anti-mGlutR1 (verde). Barra de escala = 10 μm (B,C); 100 μm (D,E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59993/59993fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59993/59993fig3.jpg"> Figura 3: Avaliação de gDNA modificado e expressão de mRNA de RDL e mGlutR1 mRNA em cérebros de abelha48 h após injeção com 345 nL de RPN CRISPR-Cas9 correspondente. (A)O teste de ensaio baseado em qPCR para avaliar a quantidade de gDNA com uma área modificada foi calculado usando o método 2-ΔΔCt e normalizado contra o controle, cérebros não injetados. Os dados são expressos como média + SD . (B) O teste TheqRT-PCR foi usado para avaliar a quantidade de mRNA em abelhas injetadas e não injetadas crispr-cas9. Amactin foi usado como um gene de referência. A expressão genética relativa foi calculada usando 2 métodos-ΔΔCt e normalizada contra o controle, cérebros não injetados. Os dados são expressos como média + SE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59993/59993fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59993/59993fig4a.jpg"> Figura 4: Exemplo da distribuição de RNP CRISPR-Cas9 em cérebros de abelhas via fluorescência ATTO550. (A-D) As seções cerebrais de quatro abelhas diferentes que expressaram o RNP RDL-CRISPR-Cas9 na célula Kenyon do corpo de cogumelo. (E,F) Exemplo de dois cérebros 48 h após injeção com RNPmGlutR1 CRISPR-Cas9. Barra de escala = 150 μm (A-F). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59993/59993fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.</a>

Apresentado aqui é um protocolo para usar o sistema CRISPR-Cas9 para reduzir a produção de uma proteína no cérebro de abelha adulta para testar a especificidade do anticorpo.

Testes anticorpos anti-RDL e Anti-mglutr1 em seções cerebrais de abelhas usando CRISPR-Cas9

Cluster Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) is a gene editing technique widely used in studies of ...

Pela primeira vez estabelecemos uma modificação dos genes codificados para receptores de gabaa ionotrópicos e receptores de glutamato metabotrópicos em subconjuntos de neurônios no cérebro adulto de abelhas. A edição de genes CRISPR-Cas9 pode ser usada para modificar um ou múltiplos genes em cérebros de abelhas adultas para explorar seus papéis no aprendizado e na memória sob condições de laboratório controladas. Este método pode ser usado para estudar a função de proteínas específicas em abelhas adultas, bem como para testar a especificidade dos anticorpos contra suas proteínas correspondentes.Demonstrando o procedimento com Irina Sinakevitch estarão Lev Kurtzman e Hyun Choi, ex-alunos do meu laboratório. Para testar a expressão de RDL e mGlutR1 por meio da análise imunocitoquímica após a injeção crispr-cas9, primeiro, use uma ferramenta CRISPR-Cas9 on-line para projetar os guias usando a sequência de DNA guia de apis mellifera, RDL e mGlutR1. Para preparar as formações complexas de RNA guia para cada RNA guia, rotule um tubo de ensaio para cada guia com o nome do RNA guia e adicione 92 microliters de tampão sem nucleotídeos, quatro microlitadores de 100 fluoróforos de micromolar, rotulados de RNA CRISPR transativando e quatro microliters da solução RNA guia apropriada para cada tubo.Quando todos os materiais tiverem sido adicionados, misture as soluções suavemente e gire o conteúdo do tubo em uma centrífuga de bancada por cinco segundos para sedimentar a solução. Em seguida, mantenha as soluções a 95 graus Celsius por cinco minutos para criar um complexo de RNA guia seguido de 10 minutos de resfriamento à temperatura ambiente. Para preparar as formações complexas de ribonucleoproteína, adicione seis microlitadores de cada solução guia RNA e seis microliters de 0,5 microgramas por microliter SP-Cas9 nuclease V3 aos tubos devidamente rotulados.Após a mistura suave, incubar as soluções a 37 graus Celsius por 10 minutos Para fazer misturas de ribonucleoproteína RNP para injeção, no final da incubação adicione quatro microlitradores de cada ribonucleoproteína ao RDL apropriado. Para fazer um controle, a solução RNA sem guias mistura quatro microliters de RNA rastreador com 92 microliters de buffer e quatro microliters de água. Após a adição de água, mantenha a solução por cinco minutos a 95 graus Celsius e deixe a mistura esfriar até atingir a temperatura ambiente.Em seguida, misture seis microlitadores da solução RNA sem guia com seis microlitadores de 0,5 microgramas por microliter Cas9 nuclease V3. Para injeção de mistura de ribonucleoproteína, depois de capturar abelhas individuais em frascos com um pequeno orifício nas tampas, imobilizar as abelhas por não mais do que três minutos no gelo e fixar cada abelha em suportes metálicos previamente preparados com fita adesiva. Com o tórax traseiro, asas e a cabeça expostas. Use uma seringa de cinco mililitros para alimentar as abelhas com uma solução de sacarose molar até que elas não estejam mais com fome, e coloque as abelhas presas em uma caixa com uma toalha de papel molhada para umidade.Em seguida, coloque cera no interior das tampas de duas placas de petri de 35 mililitros e coloque os fundos das placas sobre a cera. Injete uma sacarose molar entre a tampa e o fundo de cada prato, e coloque uma placa de petri de alimentação na caixa branca com um escorregador de vidro e coloque a outra na caixa preta com um escorregador de vidro. Em seguida, coloque um pequeno pente em cada caixa e carregue um sistema de microinjeção com a mistura RDL CRISPR-Cas9.Para injeção RDL CRISPR-Cas9, injete o ocelli mediano de oito abelhas com 345 nanoliters de mistura RDL de ribonucleoproteína seguida de alimentação com uma sacarose molar antes de liberar as abelhas na caixa experimental preta. Alimente um segundo conjunto de oito abelhas como controles sem quaisquer injeções e solte-as na caixa de controle branca. Em seguida, coloque ambas as caixas em um recipiente de poliestireno com papel molhado, observando as abelhas duas vezes ao dia para garantir que elas tenham comida suficiente e uma boa umidade.48 horas após a injeção, imobilize as abelhas no gelo por 30 segundos e use uma tesoura para decapitar cada inseto. Coloque as cabeças em 4% de paraformaldeído IN PBS sob um microscópio dissecando em um capô de fumaça, e use uma tesoura de íris barraquer para remover cuidadosamente, mas rapidamente, as antenas, os olhos compostos e o exoesqueleto superior. Deixe as cabeças sentarem-se na solução fixada por 10 minutos antes de remover o resto do esqueleto exo da cabeça e de toda a traqueia restante.Em seguida, coloque cada cérebro em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo pelo menos um mililitro de 4% de paraformaldeído durante a noite a quatro a oito graus Celsius. Na manhã seguinte, adicione 3,8 gramas de argrose a 50 mililitros de água destilada em um frasco erlenmeyer e micro-ondas a solução até que a argrose liquifies. Transfira de três a quatro cérebros fixos de abelhas fixas em uma nova placa de petri de 35 milímetros e use papel de tecido para remover o excesso de fixação.Despeje cuidadosamente o líquido sobre o cérebro e oriente as amostras dentro da argrose para que os lobos das antenas estejam voltados para cima. Depois que a argrose se solidificar, use um bisturi para cortar blocos individuais de argrose contendo um único cérebro e encher cada poço de uma placa de 24 poços carregada com uma cesta com um fundo de malha hidrofóbica e 600 microlitres de PBS por poço. Em seguida, use um vibratome para adquirir seções transversais de 70 micrômetros do tecido cerebral de cada bloco de argrose.Colocando as seções de um único cérebro na malha da mesma cesta que são adquiridas. Depois de rotular as seções com anticorpos conjugados fluoróforos, de acordo com os protocolos padrão, incorpore cada slide com seções de um único cérebro usando uma gota de meio de montagem e visualize as amostras por microscopia de fluorescência. Anti-RDL rotula neuropils na seção frontal do tipo selvagem, mas não crispr-Cas9 RDL cérebros de abelhas knockout.Observou-se especificidade semelhante para anticorpos anti-mGlutR1. Nestes representantes, os testes quantitativos de PCR em cérebros de abelhas injetados com RDL CRIPSR-Cas9, a redução relativa da fluoresência correspondeu ao número do DNA guia modificado na amostra. Após a injeção de mGlutR1 CRISPR-Cas9, a modificação relativa do DNA guia foi de aproximadamente 59% no cérebro de abelhas injetadas em comparação com o DNA guia observado no cérebro de abelhas não injetadas.Neste grupo quantitativo de RT-PCR ina separado de abelhas, a redução relativa do RNA RDL mensageiro foi de aproximadamente 59% em comparação com o nível de RNA em abelhas não injetadas, e a redução relativa do mensageiro mGlutR1 RNA em abelhas injetadas foi de aproximadamente 53% Notavelmente, a injeção de RDL CRISPR-Cas9 através do ocelli pode nem sempre atingir um grande número de células cerebrais. Por exemplo, nessas preparações apenas um em cada oito tinha RDL CRISPR-Cas9 em grande número de células cerebrais em comparação com outros cérebros de abelhas. Com o RDL CRISPR-Cas9 concentrado dentro das células do protocerebrum, mas não no lóbulo antenal.Certifique-se de evitar RNA congelado e refrozen. Tome cuidado para não sobreoxiar as abelhas. Aproveite-os imediatamente assim que a parada parar de se mover no frasco.Esta técnica pode ser usada para estudar os efeitos da redução de receptores ionotrótrópicos e metabotrópicos inibitórios no corpo do cogumelo e complexo central no comportamento das abelhas.

anti-rdl-anti-mglutr1-receptors-antibody-testing-honeybee-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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