Name: Usando células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem para a geração de células T específicas de antígeno tumoral (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Aprenda a gerar células T CD8αβ+ específicas de antígeno tumoral a partir de células-tronco pluripotentes induzidas usando o sistema de co-cultura OP9/DLL1. Este método avança terapias celulares e medicina regenerativa.

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Agradecemos alan B. Hoofring e Erina H. Ele para assistência gráfica. Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Pesquisa Intramural do Instituto Nacional do Câncer (ZIA BC010763) e pela Intramural NCI Cancer Moonshot Initiative for Cell-based Cancer Immunotherapy.

1. Culturing IPSCs humanos (hiPSCs) em fibroblastos embrionários do rato (MEF)
Nota: Métodos alternativos para cultivar hiPSCs também podem ser usados, incluindo, mas não limitado a: semeadura em uma placa de 6 poços pré-revestida com gelatina, uma mistura de proteína gelatinosa, laminina recombinante 511, ou qualquer outra matriz extracelular usada na expansão hiPSC, e culto usando meios definidos especialmente formulados para a cultura de células-tronco pluripotentes humanas.
<ol><li>
Culturing MEF
	<ol>
<li>Cubra uma placa de Petri de cultura celular de 10 cm com 4 mL de 0,1% de gelatina e incubada por 30 min a 37 °C.</li>
		<li>Descongele um frasco de 4 x 106 MEF irradiado rapidamente em 10 mL de 37 °C mef media (DMEM + 10% FBS + 1x penicilina-estreptomicina + 1x L-suplemento de glutamamina). Centrífuga a 300 x g por 5 min a 4 °C. Assaa o supernatant e resuspende a pelota da pilha em 9 mL de meios de MEF.</li>
		<li>Retire o prato revestido de gelatina da incubadora. Aspirate gelatina e adicionar 7 mL de mídia MEF. Placa 3 mL de suspensão mef (do passo 1.1.2) para o prato revestido de gelatina. Rock o prato lado a lado e frente-a-trás para garantir até mesmo a distribuição de MEF sobre o prato. Incubar a 37 °C para 8-36 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Passagem hiPSC no MEF NOTA: Os dados foram gerados usando o MART-1 iPSC derivado do melanoma cultivado a longo prazo TIL, que reconhece especificamente o peptídeo MART-1 no contexto do HLA-A*02:01, como descrito anteriormente18.<ol>
<li>HiPSCs da passagem quando as colônias estão entre 0.8 - 1.2 milímetros no diâmetro. Antes da passagem, verifique as colônias hiPSC em um microscópio estéreo e remova quaisquer áreas de diferenciação da cultura usando a borda de plástico de uma ponta de 200 μL.</li>
		<li>Aspirate passou a mídia e adicionar 10 mL hiPSC media (mídia cultura ES humana [Tabela de Materiais] + 10 ng/mL fator de crescimento fibroblasto básico humano [hbFGF]) complementado com inibidor de 10 μM ROCK.</li>
		<li>Segure o prato de cultura celular em uma mão e rolar uma ferramenta de passagem de céluladescartável em todo o prato em uma direção. Aplique pressão suficiente para que toda a lâmina de rolo toque o prato de cultura e mantenha uma pressão uniforme durante a ação de rolamento.</li>
		<li>Gire o prato de cultura 90° e repita o passo 1.2.3. Veja a placa no microscópio para confirmar visualmente o corte adequado das colônias, que devem aparecer quadriculadas. Desapego cortar colônias por rubor mecânico suave usando uma pipeta de 200 μL. Nota: O destacamento de colônias cortadas por rubor mecânico deve ser feito imediatamente após o corte de colônias com o rolo, porque depois de 3 min as colônias cortadas começarão a recolocar-se no prato, e se tornará difícil separar colônias de tamanho homogêneo por rubor.</li>
		<li>Transfira 350 - 600 grupos de colônias cortadas para um novo prato de 10 cm de MEF (banhado 8 - 36 h antes da passaging hiPSC) com 10 mL de mídia hiPSC fresco complementado com inibidor de 10 μM ROCK. Incubar a 37 °C. NOTA: 600 aglomerados representa aproximadamente 1,0 x 106 MART-1 iPSC e renderá 0,5-1,0 x 106 células DP no dia 35. No entanto, os números esperados variam dependendo da potência da linha celular inicial e condições de cultura.</li>
		<li>No dia seguinte, aspirate mídia gasta e adicionar 10 mL de mídia hiPSC fresco. Mude a mídia hiPSC a cada 1 a 2 dias, dependendo da taxa de crescimento do hiPSC.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparação de células OP9/DLL1 para co-cultura com hiPSCs
<ol><li>Células OP9/DLL1 cultura em mídia OP9 [α-mínimo meio essencial (α-MEM) + 20% de soro bovino fetal (FBS) + 1x penicilina-estreptomicina] em 37 °C. Quando as células OP9/DLL1 atingem a confluência, aspirate e stão lavando uma vez com 5 mL de magnésio 1x, cálcio e fenol sem vermelho soro de fosfato amortecida salina (PBS).</li>
	<li>Aspirate PBS e adicionar 2 mL de 0,05% Trypsin-EDTA.  Incubar por 5 min a 37 °C. Em seguida, adicione 4 mL de mídia OP9 e mecanicamente dissociar a camada celular por pipetting para fazer uma suspensão de célula única.</li>
	<li>Transfira a suspensão celular em um tubo cônico de 50 mL através de um filtro de célula strainer de 100 μm para evitar aglomerados celulares. Centrífuga a 300 x g por 5 min a 4 °C. Aspirar o supernatant e resuspender em 12 mL de mídia OP9.</li>
	<li>Adicione 8 mL de mídia OP9 para cada um dos seis novos 10 cm de cultura de células placas de Petri. Placa 2 mL de suspensão celular OP9/DLL1 do passo 2.3 para cada novo prato de 10 cm. Rock o prato lado a lado, em seguida, frente-a-trás para garantir até mesmo a distribuição de OP9/ DLL1 sobre o prato.</li>
	<li>Incubar a 37 °C. Repita a passagem a cada 2 - 3 dias quando as células atingem a confluência. Nota: É importante fazer bastante estoque congelado de pilhas OP9/DLL1 e descongelar um estoque novo cada 4-6 semanas.</li>
</ol>3. Diferenciação in vitro de hiPSCs em CD8αβ+ Células T Positivas Únicas (SP)
<ol><li>Prepare pratos OP9/DLL1 gelatinizados uma semana antes da co-cultura com hiPSCs. Para preparar a solução de gelatina de 0,1%, adicione 5 mL de temperatura ambiente (RT) solução de gelatina de estoque de tecido de grau para 500 mL de PBS.
	<ol>
<li>Casaco 3 novas placas de 10 cm de cultura celular Petri, adicionando 4 mL por prato de 0,1% de gelatina.  Incubar 30 min a 37 °C.</li>
		<li>Aspirate gelatina e adicionar 8 mL de mídia OP9 para cada prato. Passar um prato de confluente de OP9/DLL1 (como feito na seção 2 acima) para três pratos pré-revestidos de gelatina.</li>
	</ol></li>
	<li>Após 4 dias, adicione 10 mL de mídia OP9 para cada prato de 10 cm de OP9/DLL1 em gelatina, para um total de 20 mL de mídia por prato.</li>
	<li>Após 7 a 8 dias, comece a co-cultura hiPSC em pratos de confluente op9/DLL1 (dia de diferenciação 0).
	<ol>
<li>A Aspirate gastou mídia de prato de 10 cm de cofluentes em mef. Adicione 10 mL de mídia OP9. Corte e desapara as colônias hiPSC usando uma ferramenta de passaging de células descartáveis, como feito nos passos 1.2.3 e 1.2.4.</li>
		<li>Transfira 350 - 600 grupos de colônias cortadas em um prato OP9/DLL1 pré-gelatinizado de 10 cm (passo 3.1) com 10 mL de mídia OP9 fresca usando uma pipeta de 200 μL. Rock o prato de cultura lado a lado, em seguida, frente-a-trás para garantir até mesmo a distribuição de colônias. NOTA: Alternativamente, podem ser utilizados corpos embrionários hiPSC pré-formados (EBs) ou suspensão de pequeno aglomeração.  No entanto, o uso de uma ferramenta de passaging de células descartáveis ou sistema de formação de EB é preferível produzir grupos hiPSC de tamanho uniforme.</li>
	</ol></li>
	<li>No dia 1, aspirate passou a mídia e substituir por 20 mL de mídia OP9 fresco. hiPSC grupos co-cultivada s OP9/DLL1 para 1 dia aparecerá como pequenas colônias de monocamadas redondas (Figura 1).</li>
	<li>No dia 5, aspirar 10 mL de mídia gasta e adicionar 10 mL de mídia OP9 fresco. colônias hiPSC começará a se diferenciar em mesoderm primitivo, que é caracterizado por um centro escuro multicamadas.</li>
	<li>No dia 9, aspirar 10 mL de mídia gasta e adicionar 10 mL de mídia OP9 fresco. Neste ponto, as estruturas centrais multicamadas evoluirão para formas semelhantes a cúpulas, e uma área periférica semelhante à rede começará a se tornar evidente.</li>
	<li>No dia 13, colhem células progenitoras hematopoiéticas (HPCs) (Figura 1). estruturas derivadas de hiPSC no dia 13 são caracterizadas por um organóide central escuro cercado por uma rede de áreas semelhantes a cúpulas, representativas de zonas hematopoiéticas (HZs) anteriormente relatadas para encerrar progenitores hematopoiéticos derivados de células-tronco embrionárias humanas 21. NOTA: A presença das estruturas semelhantes a cúpulaindica um processo bem-sucedido, mesmo na ausência de centros escuros. A incapacidade de produzir HPCs pode ser devido à má qualidade do OP9/DLL1, qualidade do lote FBS, confluência de aglomerados iPSC semeados em OP9/DLL1 (350-600 aglomerados é ideal), e / ou variações na potência das linhas iPSC para produzir precursores hematopoietic.<ol>
<li>Aspirate passou a mídia e lavar 1x com 5 mL de 1x fenol vermelho-livre Hanks' solução de sal equilibrado modificado com cálcio e magnésio (HBSS).</li>
		<li>Aspirate HBSS e adicionar 250 μL de 5000 Unidades/mL colagem IV em 10 mL de HBSS. Incubar a 37 °C por 45 min. Aspirate HBSS com collagenase IV e lavar uma vez com 5 mL de PBS.</li>
		<li>Aspirate PBS e adicionar 5 mL de 0,25% Trypsin-EDTA. Incubar a 37 °C por 20 min. Em seguida, adicione 4 mL de mídia OP9 e dissociar a camada celular por pipetting para fazer uma suspensão de célula única.</li>
		<li>Transfira a suspensão celular em um tubo cônico de 50 mL através de um filtro de célula strainer de 100 μm.  Centrífuga a 300 x g por 5 min a 4 °C. Aspirar o supernatant e resuspender em 10 mL de mídia OP9.</li>
		<li>Suspensão de células de placa em uma nova placa de Petri de cultura celular gelatinizada de 10 cm (ver etapas 3.1.1 e 3.1.2). Incubar a 37 °C por 45 min. Em seguida, coletar células não-aderentes por pipetting suave.</li>
		<li>Transfira a suspensão celular coletada em um tubo cônico de 50 mL através de um filtro de células de 100 μm.  Centrífuga a 300 x g por 5 min a 4 °C. Aspirar o supernatant e resuspender em 10 mL de meios de diferenciação [mídia OP9 com 5 ng/mL fator de células-tronco humanas (hSCF), 5 ng/mL humano Flt3 ligand (hFLT3L), e 5 ng/mL interleucina humana 7 (hIL-7)].</li>
		<li>Placa a suspensão celular em um novo 10 cm OP9/DLL1 prato de confluente.</li>
	</ol></li>
	<li>No dia 16, passar as celas.
	<ol>
<li>Mecanicamente destacar as células não-aderentes por tubulação suave e filtro através de um filtro de células de 100 μm. Centrífuga a 300 x g por 5 min a 4 °C. Assaa o supernatant e resuspende em 10 meios da diferenciação do mL.</li>
		<li>Placa a suspensão celular em um novo 10 cm OP9/DLL1 prato de confluente.</li>
	</ol></li>
	<li>Continue a passar células não aderentes a cada 5-7 dias depois, repetindo passo 3.8.</li>
	<li>No dia 35, enriquecer CD4+CD8+ duplo positivo (DP) população e estimular a produzir cd8αβ+ sp células T (Figura 2).
	<ol>
<li>Mecanicamente destacar células não-aderentes por pipetting suave e filtro através de um filtro de célula sitios de 100 μm para remover grupos celulares. Enriqueça a população de cd4+ células pelo isolamento de contas magnéticas CD4 de acordo com o protocolo do fabricante. NOTA: A justificativa para o uso de contas magnéticas CD4 é remover as células CD4-CD8- DN da cultura, como estas foram demonstradas para causar matança direta de células CD4+CD8+ DP após a estimulação22.</li>
		<li>Conte células enriquecidas cd4 vivas usando um hemocytometer Neubauer e tinudura azul Trypan.  Suspender na mídia OP9 na concentração total 0,5 x 106 células/mL. Aliquot 1 mL da suspensão celular (0,5 x 106 células) em cada poço de uma cultura de tecido plana inferior 24 placa bem de confluent OP9/DLL1.</li>
		<li>Adicione 100 UI interleucina humana 2 (hIL-2), 5 ng/mL hIL-7, 500 ng/mL anticorpo Anti-humano CD3, e 2 μg/mL anticorpo CD28 anti-humano, em seguida, cultura em 37 °C.</li>
		<li>No dia 4 - 7 após a estimulação, coletar células para análise molecular (Figura 3) ou co-cultura com células de apresentação de antígeno pulsado pelo peptídeo (APCs).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Medindo especificidade de antígeno de células CD8αβ+ SP T derivadas hiPSC
Nota: O tipo de APCs a serem usados para este experiement é dependente da limitação de MHC de pilhas de T hiPSC-derivadas. Aqui, a linha celular T2 é usada, que é um híbrido de linhas de células linfoboblastóides T e B. As células T2 expressam HLA-A*02:0123, que é reconhecido pelas células JKF6 das quais mart1-iPSC foi derivado18. Esta linha celular T2 pode ser expandida em RPMI 1640 + 20% FBS + 1x penicilina-estreptomicina e é passagen quando as células atingem uma densidade de 5 x 105 células/mL.
<ol><li>Conte ao vivo HLA-A*02:01+ T-B híbrido linfoblastoide t2 células usando um hemocytometer Neubauer e tine azul Trypan. Incubar APCs em 24 placa de cultura de tecido bem com 1 μg/mL MART-1 peptídeo para 2 h a 37 °C. Nota: A concentração ideal do peptídeo é variável, dependendo da linha celular e da especificidade do antígeno.</li>
	<li>Colete APCs e lave 2x com 10 mL de PBS para remover qualquer peptídeo extra.</li>
	<li>Conte APCs e suspenda em 2 - 5 x 105 células/mL na mídia OP9 com 100 IU IL-2 e 5 ng/mL IL-7. Aliquot 100 μL de suspensão celular (2-5 x 104 células) em cada poço de uma placa de 96 poços de ligação u ultra-baixa ou diretamente em uma placa ELISpot pré-revestida.</li>
	<li>Classificar as células T CD8αβ+ SP derivadas de hiPSC (1 semana após estimulação anti-humana de anticorpos CD3/CD28) usando um classificador celular e suspenda em 1 x 106 células/mL na mídia OP9 com 100 IU IL-2 e 5 ng/mL IL-7. Aliquot 100 μL de suspensão celular (1 x 105 células) em cada poço de APCs e cultura para 16 - 20 h a 37 °C.</li>
	<li>Após 16 - 20 h, analise o perfil de secreção de citocina pelo ensaio elispot por protocolo do fabricante (Figura 4).</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm divulgações.

A co-cultura das células estromais de urina OP9 é um sistema bem estabelecido para a geração in vitro de linfócitos (ou seja, células NK, B e T) de HSPCs e células-tronco pluripotentes. A sinalização de entalhe é necessária para induzir o compromisso de linhagem T e pode ser realizada pela expressão ectópica de Notch ligand DLL1 ou DLL4, que têm eficácia comparável para a geração de células T1. Portanto, o sistema de cocultura OP9/DLL1 tornou-se um método amplamente utilizado para a produção de células T in vitro.  Além disso, este método é aplicável para uso com vários tipos e fontes de células humanas, incluindo sangue do cordão umbilical, HSPCs de medula óssea e ESCs.  No entanto, a geração de células T a partir dessas fontes é limitada por recuperação insuficiente de células de origem ou por diferenciação ineficiente para as células T1. Além disso, um produto de célulaS T com uma única recombinação TCR não pode ser gerado a partir dessas fontes de repertório aberto. Usando técnicas de medicina regenerativa, ou seja, induzida stemipotente stemipotente (iPSC) tecnologia, pode ser possível produzir um grande número de células T específicas de antígeno para uso em terapêutica baseada em células15.
hiPSCs são semelhantes aos ESCs pluripotentes em sua capacidade de auto-renovação, expansão ilimitada e potencial para diferenciar qualquer tipo de célula somática no corpo; no entanto, eles não têm as preocupações éticas em torno do uso de produtos de origem embrionária para aplicações clínicas. Além disso, hiPSCs podem ser produzidos a partir de qualquer célula somática, permitindo o desenvolvimento de produtos celulares para medicina personalizada. Em relatórios anteriores, hiPSCs foram produzidos a partir de células T humanas usando células mononucleares periféricas inteiras, células CD3+ ou linfócitos citotóxicos isolados (CTLs) como fonte18,19,22, 26.Quando os hiPSCs são gerados a partir de uma fonte de células T (T-iPSCs), o rearranjo original do gene TCR é herdado. Portanto, as células T derivadas do T-iPSC paciente podem fornecer um modelo para o tratamento personalizado do ACT, visando os antígenos distintos do câncer de um paciente.
A diferenciação das células-tronco pluripotentes humanas nas células de linhagem T é dividida em duas etapas: a geração de células progenitoras hematopoiéticas (HPCs)27 e sua diferenciação adicional nas células de linhagem T21. Ambas as etapas podem ser realizadas usando o sistema de co-cultura OP9/DLL1. É importante ressaltar que a qualidade das células-alimentadorope OP9/DLL1 é fundamental para o sucesso da diferenciação de células T. Como as células OP9/DLL1 não são uma linha celular homogênea imortalizada, a qualidade da FBS e as condições culturais são fundamentais para manter sua expansão sem perder a capacidade de suportar a diferenciação de hiPSC. Portanto, recomenda-se pré-avaliar o lote de FBS e passagem consistentemente quando o contato citoplasmiccélula célula-célula começa a ocorrer, a fim de evitar a diferenciação celular e senescência. Um ponto a levar em consideração é que o contato célula-célula pode parecer indistinguível do fundo, dependendo do contraste de fase e ampliação do microscópio. Em nossa experiência, a maioria dos pratos OP9/DLL1 parecerá ser 80% de confluentes quando estiverem prontos para passar.
Tem sido demonstrado que as células de linhagem T rediferenciadas geradas a partir de T-iPSCs por OP9/DLL1 co-cultura podem produzir células T CD8+ SP após estimulação18,19. No entanto, as células T CD8+ SP regeneradas adquirem o homodimer22,28,que é um coreceptor ineficaz para a sinalização de TCR29.  Além disso, essas células T CD8+ SP regeneradas têm mostrado uma citotoxicidade forte independente do TCR, tornando essas células desfavoráveis para uso clínico30. Este protocolo descreve um método recente envolvendo estimulação de células CD4+CD8+ DP purificadas purificadas purificadas para gerar células T CD8αβ+ SP com fenótipo mais convencional e citotoxicidade específica de antígeno melhorada22. Embora a perda de especificidade de antígeno devido ao rearranjo alélico TCRα secundário ocorra na fase de DP após a cultura prolongada de longo prazo, isso pode ser superado pela edição do genoma em T-iPSCs31.  Em nossa experiência, as células DP derivadas de hiPSC começam a aparecer no dia 30 - 35 de cultura, e essas células DP recém-geradas ainda não foram submetidas ao rearranjo tcrα secundário. Portanto, a maioria das células DP no dia 35 retêm especificidade de antígeno e podem ser usadas para gerar células T CD8αβ+ SP específicas por antígeno.
Antes da estimulação anti-CD3 humano e anti-CD28 no dia 35, as células CD4-CD8- DN devem ser removidas da cultura, pois estas foram demonstradas para causar morte direta de células CD4+CD8+ DP após estimulação22. Usando enriquecimento de contas magnéticas CD4 (passo 3.10) enriquecerá tanto para DP quanto para CD4+CD8- células médias únicas positivas (ISP)1,que nos mostraram não ter efeitos negativos22. Alternativamente, a classificação celular ativada por fluorescência por citometria de fluxo pode ser realizada para isolar as células DP. Entretanto, a separação magnética do grânulo é preferida porque evita o esforço mecânico induzido pela citometria do fluxo.
A geração de células T CD8αβ+ SP de células-tronco pluripotentes humanas sem seleção agonista mediada pela ativação foi posteriormente demonstrada pelo uso da cultura de células estromais de urina 3D32. No entanto, a seleção fisiológica positiva depende da interação do TCR com complexos auto-peptídeos-MHC, que são exclusivamente processados e apresentados por células epiteliais cortical thymic33. Além disso, a afinidade tcr para peptídeos de seleção tem sido mostrado para determinar as capacidades funcionais subseqüentes de células T CD8αβ+ SP34.  Atualmente, não há nenhuma evidência para sugerir que um sistema de co-cultura baseado em células estromals notch pode fornecer o peptídeo de seleção definida e complexo de MHC necessário para a seleção fisiológica positiva.
Tem sido relatado anteriormente em um modelo de urina que as células de linhagem T geradas a partir de hiPSCs derivados de células T específicos de antígeno tumoral usando OP9/DLL1 sozinho não conseguem experimentar maturação convencional. No entanto, células T imaturas derivadas do iPSC geradas pelo sistema OP9/DLL1 podem amadurecer em células T ingênuas por mais educação fisiológica de tímico em um sistema de cultura 3D 28,35. Portanto, o protocolo apresentado aqui para produzir células T imaturas derivadas do iPSC geradas pelo sistema OP9/DLL1 é vital para novas tentativas de gerar células T pós-ténmicas específicas de antígeno humano real capazes de persistência in vivo a longo prazo eficiência para tratar tumores vascularizados estabelecidos.

Além de vantagens fisiológicas, as células T têm muitas aplicações terapêuticas potenciais. A geração e expansão das células T in vitro podem ser usadas para modelagem de doenças e validação terapêutica, bem como uma fonte de tratamento para estados de imunodeficiência hereditária e adquirida (ou seja, imunodeficiências virais e linfodepletion secundário para quimioterapia ou transplante) e para a erradicação do câncer. Esta última qualidade levou ao desenvolvimento de transferência de células T adotivas (ACT) para o tratamento de pacientes com câncer avançado1.
Act consiste em reintegrar o tumor de um paciente, extraindo linfócitos infiltrados tumorais (TILs), expandindo TILs ex vivo, em seguida, reinfundindo as células expandidas para o paciente2. Tem se mostrado uma modalidade de tratamento eficaz para alguns pacientes com câncer metastático.  Infelizmente, nem todos os pacientes respondem a esta terapia. Relatórios anteriores mostraram que o estado de diferenciação das células transferidas3,4,5,6,7,8,9, uso de grandes números de células T altamente enriquecidas com antígeno de câncer10,e persistência das células T após a transferência11,12 estão todos correlacionados com respostas mais duráveis13,14. Portanto, quando act não consegue provocar uma resposta anti-tumoral, pode em parte ser devido a um baixo rendimento de células T específicas de antígeno do câncer, expansão ineficiente ex vivo levando à exaustão e perda de clones reativos, ou falta de persistência após a transferência4 . Foi postulado que esses obstáculos podem ser superados pela geração de um grande número de células T menos diferenciadas de câncer específicas de antígeno in vitro15,16.
As células-tronco/progenitoras hematopoiéticas (HSPCs) são uma fonte convencional para a geração de células T in vitro, embora este método seja limitado pelo pequeno número de células capazes de ser recuperadas de um único doador1. Células-tronco embrionárias (ESCs) também foram mostrados para produzir células T, mas com baixo rendimento17, tornando-o ineficiente para aplicações clínicas. Além disso, uma vez que as células de linhagem T experimentam recombinação genética estocástica de seus receptores de células T (TCRs) em estágios iniciais de desenvolvimento, não é possível usar HSPCs ou ESCs para gerar uma população pura de células T específicas de antígeno sem mais genômica modificações como a transdução do gene TCR.
Uma abordagem para superar essas ressalvas é reprogramar TILs para células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (hiPSCs), que podem fornecer uma fonte ilimitada para a geração de células T in vitro. Tem sido demonstrado que os TILs específicos de antígeno do câncer podem ser reprogramados em hiPSCs e rediferenciados na linhagem de células T, que retém o mesmo rearranjo do gene do receptor de células T (TCR) que a célula T original18,19.  Este detalhe é importante para act porque tumores individuais do paciente têm perfis mutational originais, e muito poucos antígenos do cancro foram mostrados para ser compartilhados entre pacientes20. Portanto, o uso de TILs específicos de antígeno do câncer como fonte para a geração in vitro de células T derivadas de hiPSC pode fornecer uma nova estratégia para o tratamento personalizado de pacientes com câncer metastático.
Apresentado aqui em detalhes é um protocolo para diferenciar células de linhagem T derivadas de hiPSC em células T cd8αβ+ únicas positivas (SP) positivas usando o sistema de cocultura OP9/DLL1. Este método é uma ferramenta poderosa para a diferenciação in vitro de células T de hiPSCs, progenitores hematopoiéticos e células-tronco embrionárias, bem como suas aplicações adicionais em medicina regenerativa e terapias baseadas em células.

<table><tbody><tr><td>Prato de 10 cm</td><td>Corning, Inc.&nbsp;</td><td></td><td></td>353003</tr><tr><td>Anti-CD3, BD</td><td>Biosciences</td> Cat<td># 561812, RRID:AB_1089628</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD34, BD</td><td>Biosciences</td> Cat<td># 348791, RRID:AB_400381</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD4, Biolegend</td><td></td><td>Cat# 344612, RRID:AB_2028479</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD43, BD</td><td>Biosciences</td> Cat<td># 560198, RRID:AB_1645460</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD7, humano</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 555361, RRID:AB_395764</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD8a,</td><td>BD Biosciences</td> humano <td>Cat# 555369, RRID:AB_398595</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD8b, BD</td><td>Biosciences</td> humano <td>Cat# 641057, RRID:AB_1645747</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TCRb, BD</td><td>Biosciences</td> humano <td>Cat# 555548, RRID:AB_395932</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo monoclonal humano CD28 (15E8), grau funcional puro</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>130-093-375</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonal humano CD3 (OKT3), grau funcional puro</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>130-093-387</td><td></td></tr><tr><td>Microesferas CD4,</td><td>Miltenyl Biotec</td> humano <td>130-045-101</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células 100 um</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-549</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS)</td><td>Gemini</td><td>100-500</td><td></td></tr><tr><td>Flt-3 ligante</td><td>R & D Systems</td><td>427-FL</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Gelatina 2%&nbsp;</td><td>SIGMA-Aldritch</td><td>G1393-100ML</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050-061</td><td>Suplemento de L-Glutamina</td></tr><tr><td>HBSS Mg+Ca+ Fenol-Vermelho Livre</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Interleucina-2</td><td>R& D Systems</td><td>202-IL</td><td></td></tr><tr><td>Interleucina-7</td><td>R& D Systems</td><td>407-ML</td><td></td></tr><tr><td>iTAG MHC Tetramer HLA-A*0201 Mart1 Tetramer -ELAGIGILTV</td><td>MBL</td><td>Cat#TB-0009-2</td><td></td></tr><tr><td>Mart1-hiPSC</td><td>Vizcardo et al., Cell Stem Cell 2013</td><td>RIKEN-IMS</td><td></td></tr><tr><td>Melan-A, MART 1 (26-35)</td><td>InnoPep</td><td>3146-0100</td><td></td></tr><tr><td>MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>&alpha; MEM em pó</td><td>Gibco</td><td>61100061</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblastos Embrionários de Camundongo (MEF)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C57BL/6 MEF MITC-TREATED 4M CADA; A34962</td><td></td></tr><tr><td>OP9 / N-DLL1</td><td>Centro de Biorrecursos Riken</td><td>Cat # RCB2927; RRID: CVCL_B220</td><td>OP9 / DLL1</td></tr><tr><td>Penicilina / estreptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato pH 7,4 (1x)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Primate ES Cell Medium</td><td>Reprocell</td><td>RCHEMD001</td><td>Meio de cultura ESC humano</td></tr><tr><td>Inibidor de Rhok (dicloridrato de Y-27632)</td> <td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Fator de Células-Tronco (SCF)</td><td>R& D Systems</td><td>455-MC</td><td></td></tr><tr><td>StemPro</td><td>EZPassage</td><td>23181-010</td><td></td></tr><tr><td>T2-tumor</td><td>ATCC</td><td>T2 (174 x CEM. T2) (ATCC&reg; CRL-1992&comércio;)&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenol&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%), vermelho de fenol&nbsp;</td>Placa de fundo <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>U de 96 poços</td><td>Corning, Inc.&nbsp;</td><td>3799</td><td></td></tr></tbody></table>

usando células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem para a geração de células t específicas de antígeno tumoral

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

A geração e expansão das células T funcionais in vitro pode levar a uma ampla gama de aplicações clínicas. Um desses usos é para o tratamento de pacientes com câncer avançado. A transferência de células T adotivas (ACT) de células T altamente enriquecidas do tumor específicas tem sido mostrada para causar regressão durável de câncer metastático em alguns pacientes. No entanto, durante a expansão, essas células podem ficar esgotadas ou senescentes, limitando sua função efetiva e persistência in vivo. A tecnologia induzida de células-tronco pluripotentes (iPSC) pode superar esses obstáculos levando à geração in vitro de um grande número de células T específicas de antígeno tumoral menos diferenciada. O iPSC humano (hiPSC) tem a capacidade de diferenciar-se em qualquer tipo de célula somática, incluindo linfócitos, que retêm o rearranjo genômico original do receptor de células T (TCR) quando uma célula T é usada como célula de partida. Portanto, a reprogramação de células T específicas de antígeno tumor humano para hiPSC seguida de redifferentiação à linhagem de células T tem o potencial de produzir células T específicas de antígeno tumoral rejuvenescido. Descrito aqui é um método para gerar células T CD8αβ+ únicas positivas (SP) positivas (SP) do hiPSC usando o sistema de cocultura OP9/DLL1. Este método é uma ferramenta poderosa para a geração in vitro da linhagem da pilha de T e facilitará o desenvolvimento de pilhas de T derivadas in vitro para o uso na medicina regenerativa e nas terapias pilha-baseadas.

Após 13 dias hiPSCs co-culturing com OP9/DLL1, CD34+CD43+ células progenitoras hematopoiéticas apareceram (Figura 1). Após mais 22 dias de cultura sobre OP9/DLL1 não gelatinizado na presença de hSCF, hFLT3L e hIL-7, progenitores hematopoiéticos diferenciados em CD3+CD7+CD4+CD8+ células de linhagem T duplo-positivas (DP), maioria dos quais expressou TCR específico para o epitope MART-1 (tetramer) (Figura 2).
Já foi demonstrado anteriormente que as células T CD8+ SP podem ser induzidas a partir de células T CD4+CD8+ DP por sinalização TCR via peptídeo agonista ou estimulação tcr orientada por anticorpos24,25. Portanto, no dia 35 da cultura, as células T CD4+CD8+ DP derivadas de hiPSC foram estimuladas com anticorpos CD3 anti-humanos e CD28 anti-humanos na presença de hIL-7 e hIL-2.  Quatro dias após a estimulação, o número de células CD3+CD8αβ+ SP aumentou dramaticamente e permaneceu específico para o epítopo MART-1, confirmando a preservação de sua especificidade antígeno herdada (Figura 3).
Para determinar as propriedades funcionais das células T CD8αβ+ SP derivadas de hiPSC, foi analisada a ativação e secreção de interferon gama (IFN-γ). Após a estimulação com anticorpos CD3 anti-humanos e CD28 anti-humanos por 1 semana, as células T CD8αβ+ SP derivadas de hiPSC foram isoladas usando um classificador celular e co-cultivadas com linha celular T2 expressando HLA-A*02:01 com ou sem peptídeo MART1 cognado por 16 - 20 h. O ensaio elispot revelou que as células CD8αβ+ SP T derivadas de hiPSC secretam quantidades mais elevadas de IFN-γ em comparação com as células T CD8αα+ SP, quando cultivadas na presença do peptídeo MART-1. A expressão ifn-γ foi nula apenas para células T e APCs, demonstrando que as células T derivadas de T-iPSC humanas são específicas de antígeno e funcionais(Figura 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59997/59997fig1.jpg"> Figura 1:Geração de células progenitoras hematopoiéticas derivadas de hiPSC. A) Visão geral esquemática da diferenciação de hiPSCs para linhagem hematopoiética usando co-cultura OP9/DLL1. (B) Aparência de estruturas derivadas de hiPSC nos dias 1 (canto superior esquerdo), 3 (canto superior direito), 7 (canto inferior esquerdo) e 13 (canto inferior direito). Barras de escala = 100 μm. (C)Análise citométrica de fluxo de CD34 derivado hiPSC+CD43+ células progenitoras hematopoiéticas no dia 13. Os dados são representativos de seis experimentos independentes (n = 1 a 2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59997/59997fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59997/59997fig2.jpg"> Figura 2: diferenciação hiPSC em Mart1+ CD4+CD8αβ+ DP Células T. (A)Visão geral esquemática da diferenciação da linhagem hematopoiética derivada do hiPSC para células T imaturas usando co-cultura OP9/DLL1. (B) Análise citométrica de fluxo de CD4 vs CD8α, CD3 vs CD8β e expressão tetramer MART-1 em células T derivadas de hiPSC no dia 35. Fechado em linfócitos, células individuais, PI negativo. Os dados são representativos de três experimentos independentes (n = 3 - 8). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59997/59997fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59997/59997fig3.jpg"> Figura 3: Indução de Fenótipo de células T CD8αβ+ SP. Análise citométrica do fluxo de CD4- células T derivadas de hiPSC 4 dias após a estimulação anti-CD3 humana e anti-CD28 humana. Fechado em linfócitos, células individuais, PI negativo (n = 4).   <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59997/59997fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59997/59997fig4.jpg"> Figura 4:Especificidade do antígeno das células T CD8αβ+ SPderivadas da hiPSC. Secreção IFN-γ pelo ensaio elispot de cd8αβ+ SP derivado sp, CD8αα+ SP, e células T em massa após 20 h co-cultura com ou sem células T2 pulsadas (ou não) com peptídeo MART-1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59997/59997fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>

Este artigo descreve um método para gerar células-tronco pluripotentes induzidas por antígeno funcional do tumor derivadas de CD8αβ+ únicas células T positivas usando o sistema de cocultura OP9/DLL1.

Usando células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem para a geração de células T específicas de antígeno tumoral

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Apresentamos um método para gerar células-tronco pluripotentes induzidas por células-tronco derivadas do tumor cd8 alfa beta beta uni-positivo T usando o sistema de co-cultura OP9-Delta-1. Este método é uma poderosa ferramenta para a geração de células T in vitro e facilitará o desenvolvimento de células T derivadas in vitro para uso em medicina regenerativa e terapias baseadas em células. Também pode ser adaptado para a geração de outros linfócitos, como células NK.Ao executar essa técnica, é importante pré-avaliar o lote de células FBS e passagem OP9-Delta-1 de forma consistente quando o contato citoplasmático célula-celular começar a prevenir a diferenciação celular e a senescência. Demonstrando o procedimento será a Dra. Comece verificando colônias de iPSC humanos em um microscópio estéreo e remova quaisquer áreas de diferenciação da cultura com a borda plástica de uma ponta de pipeta de 200 microliter.Quando as colônias atingirem 0,8 a 1,2 milímetros de diâmetro, passagem os iPSCs humanos. Aspire a mídia gasta, e adicione 10 mililitros de mídia iPSC humana suplementada com inibidor ROCK de 10 micromolar. Enrole uma ferramenta de troca de celular descartável por todo o prato em uma direção, certificando-se de manter a pressão uniforme e que toda a lâmina de rolo toca o prato da cultura.Gire o prato de cultura 90 graus, e repita o rolamento. Confirme visualmente o corte adequado das colônias com um microscópio. Eles devem parecer quadrimestados.Em seguida, desprendem as colônias cortadas por uma suave descarga mecânica com uma pipeta de 200 microliter. Estimar visualmente o número de aglomerados de colônias, e transferir entre 350 e 600 aglomerados para um novo prato de 10 centímetros de fibroblastos embrionários de camundongos com 10 mililitros de mídia iPSC humana fresca complementada com inibidor de ROCK. Incubar o prato durante a noite a 37 graus Celsius.No dia seguinte, aspire a mídia gasta, e adicione 10 mililitros de mídia iPSC humana fresca. Mude a mídia a cada um ou dois dias, dependendo da taxa de crescimento celular. Cultura as células OP9-Delta-1 em mídia OP9 a 37 graus Celsius.Quando atingirem a confluência, aspirem a mídia e lavem as células uma vez com cinco mililitros de 1x magnésio, cálcio e PBS sem fenol. Aspire o PBS, adicione dois mililitros de 05% de trippsina-EDTA, e incuba as células por cinco minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, adicione quatro mililitros de mídia OP9 e dissociar mecanicamente a camada celular por pipetação.Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 50 mililitros através de um coador de células de 100 micrômetros, e centrífuga a 300 vezes g a quatro graus Celsius por cinco minutos. Aspire o supernasce, e resuspense as células em 12 mililitros de mídia OP9. Adicione oito mililitros de mídia OP9 a cada um dos seis novos pratos de cultura celular, e placa dois mililitros da suspensão celular OP9-delta-1 em cada prato.Balance o prato de um lado para o outro e frente para trás para garantir a distribuição uniforme das células. Incubar as células a 37 graus Celsius, e repetir a passagem quando as células atingirem a confluência. Prepare pratos OP9-Delta-1 gelatinizados uma semana antes da co-cultura com iPSCs humanos.Adicione quatro mililitros de gelatina de 0,1% a três novos pratos de cultura celular, e incuba-os por 30 minutos a 37 graus Celsius. Após a incubação, aspire a gelatina e adicione oito mililitros de mídia OP9 a cada prato. Passagem um prato confluente de células OP9-Delta-1 para três pratos revestidos de gelatina.Após quatro dias, adicione 10 mililitros de mídia OP9 a cada prato de células, para um total de 20 mililitros de mídia por prato. Inicie a co-cultura iPSC humana em pratos confluentes OP9-Delta-1 de sete a oito dias após a passagem das células. Aspire a mídia de um prato confluente de iPSCs humanos, e adicione 10 mililitros de mídia OP9.Corte e desprende colônias celulares usando uma ferramenta descartável de passagem celular, e transfira 350 a 600 aglomerados de colônias cortadas para um prato OP9-Delta-1 pré-gelatinizado com 10 mililitros de mídia OP9 fresca. Arrase o prato de cultura lado a lado e frente a frente para trás para garantir até mesmo a distribuição das colônias. No dia seguinte, aspire a mídia gasta, e substitua-a por 20 mililitros de mídia OP9 fresca.Os aglomerados humanos iPSC co-cultivados no OP9-Delta-1 por um dia devem aparecer como pequenas colônias de monocamadas redondas. No quinto dia, aspire 10 mililitros de mídia gasta, e adicione 10 mililitros de mídia OP9 fresca. As colônias começarão a se diferenciar em mesodermia primitiva, que é caracterizada por um centro escuro multicamadas.Repita este processo no nono dia, momento em que as estruturas do centro multicamadas evoluirão para formas semelhantes a cúpulas. Colher as células progenitoras hematopoiéticas no dia 13, momento em que as estruturas são compostas de um organoide central escuro cercado por uma rede de áreas semelhantes a cúpulas. Aspire a mídia, e lave as células uma vez com cinco mililitros de 1x solução de sal balanceado hanks sem fenol com cálcio e magnésio, ou HBSS.Após a lavagem, adicione 250 microliters de 5.000 unidades por mililitro colagenase IV a 10 mililitros de HBSS. Adicione a mistura às células e incuba-as a 37 graus Celsius por 45 minutos. Aspire a mistura HBSS-collagenase e lave as células uma vez com cinco mililitros de PBS.Depois de lavar com PBS, adicione cinco mililitros de 0,25% trypsin-EDTA, e incuba as células a 37 graus Celsius por 20 minutos. Em seguida, adicione quatro mililitros de mídia OP9 e dissocia a camada celular por pipetação para fazer uma suspensão de célula única. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 50 mililitros através de um coador de 100 micrômetros e centrifugar o tubo a 300 vezes g e quatro graus Celsius por cinco minutos.Aspire o supernasce, e resuspense as células em 10 mililitros de mídia OP9. Plaque a suspensão celular em um novo prato de cultura celular gelatinizada de 10 centímetros, e incuba-os a 37 graus Celsius por 45 minutos. Em seguida, colete quaisquer células não aderentes por pipetação suave.Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 50 mililitros através de um coador e centrífuga como descrito anteriormente. Em seguida, aspire o supernasce, e resuspense as células em 10 mililitros de mídia de diferenciação. Coloque a suspensão da célula em um novo prato confluente OP9-Delta-1.Passe as células no dia 16 de acordo com as instruções do manuscrito, e continue a passar as células não aderentes a cada cinco ou sete dias depois. Após 35 dias de diferenciação, enriqueça a população celular CD4 positivo pelo isolamento de contas magnéticas CD4 de acordo com o protocolo do fabricante. Em seguida, resuspenque as células em mídia OP9, e placa um mililitro de suspensão celular em cada poço de uma cultura tecidual, fundo plano, placa de 24 poços de confluente OP9-Delta-1.Estimule as células adicionando 100 unidades internacionais de IL-2 humanos, cinco nanogramas de IL-7 humanos, 500 nanogramas de anticorpos CD3 anti-humanos, e dois microgramas de anticorpos CD28 anti-humanos para cada poço. Após quatro a sete dias, as células podem ser coletadas para análise suplementar. Após a cultura em OP9-Delta-1 não gelatinizada na presença de fatores de células-tronco humanas, flt3-ligantes humanos e interleucina humana-7, progenitores hematopoiéticos se diferenciam em células de linhagem T CD3, CD7, CD4 e CD8 duplamente positivas, a maioria das quais expressavam receptores de células T específicos para o epítope MART1.Quando o CD4, células T cd8 duplo-positivas foram estimuladas com anticorpos anti-humanos CD3 e CD28 na presença de interleucina humana-7 e 2, o número de células CD3-positivas CD8 alfa beta single-positivo aumentou e permaneceu específico para o epítope MART1, confirmando a preservação de sua especificidade de antígeno herdado. Um ensaio elispot revelou que quando cultivadas na presença de peptídeo MART1, as células T beta alfa beta monopositivos derivadas do iPSC secretam maiores quantidades de gama interferon em comparação com as células T alfa a granel e CD8. Nenhuma expressão gama de interferon foi detectada apenas para células T e células que apresentam antígenos, demonstrando que as células T derivadas do T-iPSC humanos são específicas de antígeno e funcionais.Um passo importante neste método é o enriquecimento de contas magnéticas CD4 para eliminar células CD4-negativas, CD8-negativos duplo-negativos, que podem causar morte direta de células dupla-positivas após a estimulação. Esta técnica é aplicável para uso com várias fontes de células humanas, incluindo células-tronco hematopoiéticas e células-tronco embrionárias. Células T imaturas derivadas do iPSC geradas por este método poderiam ser melhoradas ainda mais para a geração de células T ingênuas específicas do tumor humano maduro para uso terapêutico futuro.Depois de assistir a este vídeo, o espectador deve entender como gerar células T beta alfa beta monopositivos do iPSC usando o sistema de cocultura OP9-Delta-1.

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