Name: Esclarecimento ótico e imagem latente do tecido Immunolabeled do rim (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Aprenda a técnica de clareamento óptico e imagem de tecido renal immunolabelado para análise tridimensional de estruturas multicelulares. Este método acessível permite visualizar e quantificar arquitetura tecidual em órgãos transparentes.

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O T. S. é apoiado por concessões da Fundação de pesquisa alemão de DFG (332853055), Else Kröner-Fresenius-Stiftung (2015_A197), e a faculdade médica do RWTH AIX-lo-Chapelle (programa do Returner de RWTH). V. G. P. é apoiado por bolsas de pesquisa da Deutsche Gesellschaft Fur Nephrologie, da Fundação Alexander von Humboldt, e do Conselho Nacional de saúde e pesquisa médica da Austrália. D. H. E é apoiado por Fondation LeDucq. R. K. é apoiado por subvenções do DFG (KR-4073/3-1, SCHN1188/5-1, SFB/TRR57, SFB/TRR219), o estado de Northrhinewestfalia (MIWF-NRW) e o Centro Interdisciplinar de pesquisa clínica na Universidade RWTH Aachen (O3-11).

Nota: Todos os procedimentos experimentais aqui descritos foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) da Oregon Health and Science University, Portland, Oregon, EUA, e autoridades locais relevantes em Aachen, Alemanha.
1. perfusão aórtica abdominal retrógrada e fixação de rins de rato
<ol><li>Prepare soluções no mesmo dia ou noite antes e armazene em uma geladeira durante a noite. Aqueça as soluções à temperatura ambiente (RT) antes de usar.</li>
	<li>
Fazer um novo lote de 3% paraformaldeído (PFA) em 1x fosfato-tampão salina (PBS). Cerca de 50-100 mL de PFA é necessário por mouse.
	<ol>
<li>Para fazer 1 L de 3% de PFA: pesar 30 g de PFA e adicionar 800 mL de água destilada na capa de fumos. Mexa e aqueça a 50-60 ° c. Não aqueça acima de 70 ° c. Cuidado: o PFA é tóxico. Prepare o PFA na capa de fumos.</li>
		<li>Adicione lentamente várias gotas de NaOH 2N. Aguarde alguns minutos até PFA entra na solução ou adicionar mais algumas gotas. Alguns pedaços pequenos não se dissolverão.</li>
		<li>Retire a solução do calor. Adicionar 50 mL de PBS 20x. Chill no gelo para RT.</li>
		<li>Ajuste o pH a 7.3-7.4 com HCl. adicionar água destilada a 1 L.</li>
		<li>Remova todas as partículas não dissolvidas filtrando 1X PBS e 3% PFA com filtro de 0,22 μm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicionar 1.000 unidades de heparina a 1 L de 1X PBS. Transferência 1X PBS contendo heparina e 3% PFA em 1X PBS em separado 50 mL seringas de plástico. Nota: Se disponível, a bomba pressão-controlada ajustou-se em 80-100 mmHg ou a pressão hidrostática (método do gotejamento, a altura das soluções da perfusão: 160-200 cm acima do animal) pode ser usado para a perfusão do rim.</li>
	<li>Conecte o PBS, PFA e uma agulha de borboleta de 21 G Blunted a uma torneira de três vias. Certifique-se de que não há bolhas de ar em todo o sistema.</li>
	<li>Rotule um tubo cônico de 15 mL e dispense 10 mL de PFA nele.</li>
	<li>Profundamente anestesiam um macho ou fêmea C57BL/6 mouse 12-24 semanas de idade usando 120 mg/kg de peso corporal cetamina e 16 mg/kg de peso corporal xilazina. O animal deve ser verificado para a ausência completa de responsividade por beliscar os reflexos antes de prosseguir para a cirurgia (por exemplo, reflexo de pinça do dedo do pé).</li>
	<li>Uma vez que o animal atingiu um plano cirúrgico de anestesia, colocá-lo em suas costas o microscópio de dissecação. Abra cirùrgica o abdômen com uma incisão abdominal do midline usando uma tesoura de funcionamento e exponha a aorta abdominal.</li>
	<li>Aperte a aorta abdominal direita acima da ramificação para a artéria ilíaca com um hemostato curvo. Em seguida, aperte a aorta abdominal logo abaixo das artérias renais com um micro serrefine. Faça uma pequena incisão (1 mm) na aorta abdominal entre as duas braçadeiras com tesouras de Vannas. Insira a agulha borboleta na incisão lentamente e tenha cuidado para não rasgar a aorta abdominal aberta.</li>
	<li>Ligate a artéria renal direita com uma sutura de seda 5-0 e remova o rim direito para a outra análise se somente um rim é necessário para a perfusão e a fixação.</li>
	<li>Retire o micro serrefine, transecto a veia portal com as tesouras dos Vannas, e perfuse imediatamente com 50 mL de PBS que contem a heparina, a seguir interruptor e perfuse com 50 mL de PFA de 3%. Nota: A pressão elevada da perfusão através da aorta abdominal é exigida para abrir túbulos renais para a melhor difusão do anticorpo através do tecido. A perfusão através do coração não pode abrir túbulos renais.</li>
	<li>Colete o rim perfundidos com cuidado e evite perfurar ou espremer o tecido.</li>
	<li>Retire a cápsula e corte o rim em fatias coronais de 1 mm de espessura. Use uma matriz de segmentaçãode dados (tabela de materiais) para padronizar a espessura da fatia. Nota: Alternativamente, considere usar um vibratome.</li>
	<li>Mergulhe as fatias renais com a PFA preparada no tubo cônico de 15 mL rotulado.</li>
	<li>Dispense 10 mL de PFA para outro tubo cônico de 15 mL rotulado. Lave o torneira de três vias e a agulha de borboleta com PBS antes de passar para o próximo mouse.</li>
	<li>Realize a pós-fixação durante a noite em RT protegida da luz.</li>
</ol>2. preparação do tecido e imunocoloração
<ol><li>Após a pós-fixação, lave a fatia de rim duas vezes com 1x tampãode lavagem (tabela de materiais) para 1 h em um rocker horizontal em RT.</li>
	<li>Realize a recuperação do antígeno. Aqueça acima 300 mL da solução de desmascaramento do antígeno 1x (Tcapaz dos materiais) em um copo de 500 mL a 92-98 ° c. Coloque a fatia na gaveta de incorporação permeável ao amortecedor aquecido com agitação para 1 h em 92-98 ° c. Retire o copo do fogo e deixe esfriar a RT. Nota: Alguns vendedores testam seus anticorpos para a aplicação immunohistochemistry e incluirão um método sugerido da recuperação do antígeno na folha de dados. Portanto, alguns resumos podem exigir um buffer mais básico (por exemplo, pH 9).</li>
	<li>Transfira a fatia em 10 mL de tampão de lavagem 1X com 0,1% Triton X-100 e rock durante a noite no RT. Lave as fatias 2x com 10 mL de tampão de lavagem 1X fresco para 1 h no dia seguinte.</li>
	<li>Diluir o anticorpo primário em 500 μL de diluente de anticorpo normal (tabela de materiais). Comece com uma concentração de 1:50-1:100. Balanç delicadamente a fatia do rim no anticorpo preliminar diluído para 4 d em 37 ° c. Nota: Desde que cada anticorpo tem propriedades originais, a temperatura durante a incubação do anticorpo e as diluições do anticorpo precisam de ser aperfeiçoadas para pontas de prova individuais. Para controles secundários do anticorpo-somente, incubar o tecido do rim no diluente sem anticorpo preliminar. Em vez de diluente de anticorpo comercial, 1X PBS com 0,1% Triton X-100 e 0, 1% de azida sódica pode ser usado.</li>
	<li>Lave a fatia de rim em 10 mL de 1x tampão de lavagem durante a noite em RT com uma mudança de tampão de lavagem após 8 h.</li>
	<li>Diluir os anticorpos secundários (por exemplo, 1:100 para os anticorpos secundários de Alexa fluor) em 500 μL de diluente de anticorpo normal. Incubar as fatias renais em anticorpo secundário diluído durante 4 dias a 37 ° c. A partir deste passo em diante, proteja as fatias de rim da luz.</li>
	<li>Lave as fatias de rim em 10 mL de 1x tampão de lavagem durante a noite em RT com uma mudança de tampão de lavagem após 8 h.</li>
</ol>3. esclarecimento do tecido
<ol><li>Transfira a fatia de rim para 5 mL de etanol de alto grau 100% (tabela de materiais) para 2 h em RT com balanço suave (com uma mudança para o etanol fresco após 1 h). Esta etapa é para a desidratação do tecido. Nota: O etanol de alto grau é necessário para alcançar uma alta translucidez tecidual na próxima etapa. O metanol ou o tetrahidrofurano são reagentes alternativos da desidratação com potencial elevado do delipidation.</li>
	<li>Mergulhe a fatia de rim em 2 mL de ECi (tabela de materiais) com balanço suave em RT (com uma mudança para ECI fresca após 2 h) durante a noite. Nota: O ponto de congelação/fusão de ECi é de 6-8 ° c. Portanto, não armazene amostras na geladeira. Conduza a imersão em um exaustor corretamente ventilado e evite o contato direto com a roupa e a pele (o ECi é um composto não-tóxico do alimento e da administração de droga-aprovado mas tem um odor forte). Use tubos Eppendorf regulares ou vasos de vidro (sem vasos de poliestireno).</li>
	<li>O translucidez do tecido pode ser conseguido após a imersão do ECI e quando as fatias do rim estão prontas para a imagem latente.</li>
</ol>4. ConfocalImaging e análise de imagem
Nota: Para a imagem latente, outras técnicas da microscopia podem ser usadas contanto que a solução de harmonização do índice refração for compatível com a lente objetiva. Este protocolo usa um microscópio confocal invertido.
<ol><li>Adicionar 600-1000 μL de ECi no prato inferior de vidro (tabela de materiais). Nota: Evite o uso de pratos de cultura de células regulares, porque ECi é um solvente orgânico que irá dissolver os pratos de plástico. Da mesma forma, ECi pode atacar peças plásticas/anéis de isolamento em lentes objetivas. Refira os relatórios apropriados para uma vista geral de pratos compatíveis da imagem latente30 e câmaras 3-D impressas auto-feitas28.</li>
	<li>Transfira a fatia translúcida do rim no prato. Coloque uma lamínula redonda na fatia do rim para aplicar a pressão de luz em direção ao fundo de vidro. Selar o prato com película de parafina (tabela de materiais) para evitar fugas de IPI. Nota: Órgãos inteiros ou várias fatias de tecido de espessura milímetro podem requerer uma borda (cimento dentário ou elastômero de silicone; ver tabela de materiais) ao redor do tecido para fazer um pool de IPI para a amostra.</li>
	<li>Coloc o prato na plataforma da imagem latente do microscópio.</li>
	<li>Pegue vários z-Stacks e realizar costura. Comece com um tamanho z-Step de 5 μm. Nota: Considere usar a distância de trabalho longa (> 5 milímetros) e os objetivos numéricos elevados da abertura (> 0.9) para a imagem latente de fatias ou de órgãos muito grossos do tecido. Após a imagem, transfira o tecido de volta para o etanol e armazene em tampão de lavagem ou PBS com 0, 2% de azida sódica.</li>
	<li>Analise a imagem usando renderização 3-D com software (tabela de materiais).</li>
</ol>

<ol><li>Oh, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mesoscale+connectome+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A mesoscale connectome of the mouse brain.</a> Nature. 508 (7495), 207-214 (2014).</li>
<li>Zhai, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-D+reconstruction+of+the+mouse+nephron%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">3-D reconstruction of the mouse nephron.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 17 (1), 77-88 (2006).</li>
<li>Nyengaard, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereologic+methods+and+their+application+in+kidney+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Stereologic methods and their application in kidney research.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).</li>
<li>Puelles, V. G., Bertram, J. F., Moeller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+podocyte+depletion%3A+theoretical+and+practical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Quantifying podocyte depletion: theoretical and practical considerations.</a> Cell and Tissue Research. 369 (1), 229-236 (2017).</li>
<li>Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((We+can+see+clearly+now%3A+optical+clearing+and+kidney+morphometrics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Nephrology+and+Hypertension%22%5BJournal%5D)">We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).</li>
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<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+Tissue+Clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li>
<li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeeDB%3A+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li>
<li>Kuwajima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClearT%3A+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScaleS%3A+an+optical+clearing+palette+for+biological+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging.</a> Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li>
<li>Lee, E., Sun, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACT-PRESTO%3A+Biological+Tissue+Clearing+and+Immunolabeling+Methods+for+Volume+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).</li>
<li>Klingberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+Automated+Evaluation+of+Total+Glomerular+Number+and+Capillary+Tuft+Size+in+Nephritic+Kidneys+Using+Lightsheet+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).</li>
<li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultramicroscopy%3A+3-D+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultramicroscopy: 3-D visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-D+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3-DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">3-D imaging of solvent-cleared organs using 3-DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li>
<li>Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+clearing+and+dehydration+of+GFP+expressing+mouse+brains%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains.</a> PloS One. 7 (3), e33916(2012).</li>
<li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iDISCO%3A+a+simple%2C+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li>
<li>Pan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shrinkage-mediated+imaging+of+entire+organs+and+organisms+using+uDISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO.</a> Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).</li>
<li>Schwarz, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent-protein+stabilization+and+high-resolution+imaging+of+cleared%2C+intact+mouse+brains%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains.</a> PLoS ONE. 10 (5), e0124650(2015).</li>
<li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+PEGASOS+method%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method.</a> Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).</li>
<li>Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%2C2%27-thiodiethanol%3A+a+new+water+soluble+mounting+medium+for+high+resolution+optical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">2,2'-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy.</a> Microscopy Research and Technique. 70 (1), 1-9 (2007).</li>
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<li>Saritas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+CUL3-mediated+ubiquitination+causes+proximal+tubule+injury+and+kidney+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Disruption of CUL3-mediated ubiquitination causes proximal tubule injury and kidney fibrosis.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4596(2019).</li>
<li>Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+imaging+of+the+functioning+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Multiphoton imaging of the functioning kidney.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 22 (7), 1297-1304 (2011).</li>
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<li>Kim, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+electrotransport+selectively+enhances+the+transport+of+highly+electromobile+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), E6274-E6283 (2015).</li>
<li>Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C., Gentleman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+of+acrylamide+sodium+dodecyl+sulphate+%28SDS%29-based+tissue+clearing+%28FASTClear%29%3A+a+novel+protocol+of+tissue+clearing+for+3-D+visualization+of+human+brain+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology+and+Applied+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for 3-D visualization of human brain tissues.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).</li>
<li>Xu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+free-of-acrylamide+clearing+tissue+%28FACT%29-an+optimized+new+protocol+for+rapid%2C+high-resolution+imaging+of+3-D+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of 3-D brain tissue.</a> Scientific Reports. 7 (1), 9895(2017).</li>
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<li>Matryba, P., Bozycki, L., Pawlowska, M., Kaczmarek, L., Stefaniuk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+perfusion-based+CUBIC+protocol+for+the+efficient+whole-body+clearing+and+imaging+of+rat+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Optimized perfusion-based CUBIC protocol for the efficient whole-body clearing and imaging of rat organs.</a> Journal of Biophotonics. 11 (5), e201700248(2018).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Técnicas de compensação óptica receberam ampla atenção para visualização 3-D e quantificação de microanatomia em vários órgãos. Aqui, o método solvente-baseado do esclarecimento (ECI) foi combinado com o Immunolabeling para a imagem latente 3-D de túbulos inteiros em fatias do rim. Este método é simples, barato e rápido. No entanto, outras questões de pesquisa podem ser melhor respondidas com outros protocolos de compensação5. Também é importante ter em mente que os métodos baseados em solvente ca...

O crescente interesse em estudar órgãos inteiros ou grandes estruturas multicelulares levou ao desenvolvimento de métodos de compensação óptica que envolvem imagens de tecido transparente em três dimensões. Até recentemente, os melhores métodos para estimar o número de células, o comprimento ou o volume de estruturas inteiras foram a estereologia ou o corte Serial exaustivo, que se baseia na amostragem sistêmica do tecido para posterior análise em duas dimensões1, 2. º , 3. no entanto, estes métodos são demorados e necessitam de um elevado nível de formação e especialização4. Os métodos de compensação óptica superam esses problemas equilibrando o índice de refração ao longo de uma amostra para tornar o tecido translúcido para imagens 3-D5,6,7.
Vários métodos de compensação óptica foram desenvolvidos, que se enquadram em duas categorias principais: métodos à base de solvente e aquosa. Métodos de base aquosa podem ser divididos emimersão simples8,9, hiperhidratação10,11e hidrogel incorporando12,13. Os métodos à base de solvente desidratam o tecido, removem os lipídios e normalizam o índice de refração para um valor em torno de 1,55. As limitações da maioria dos métodos baseados em solventes são a têmpera de fluorescência endógena de proteínas de repórter comumente usadas, como GFP, toxicidade por solventes, capacidade de dissolver colas usadas em algumas câmaras de imagem ou lentes objetivas, e encolhimento de tecido durante desidratação14,15,16,17,18,19,20,21. Entretanto, os métodos solvente-baseados são simples, tempo-eficientes, e podem trabalhar em um número de tipos diferentes do tecido.
Os métodos de base aquosa dependem da imersão do tecido em soluções aquosas que possuem índices de refração na faixa de 1,38-1,528,11,12,22,23,24 . Estes métodos foram desenvolvidos para preservar a emissão de proteínas de repórter fluorescente endógena e prevenir o encolhimento induzido por desidratação, mas as limitações da maioria dos métodos de compensação à base de aquosa incluem uma duração mais longa do protocolo, expansão tecidual e modificação protéica (ou seja, desnaturação parcial de proteínas por ureia em protocolos hiperhidratantes como SCALea2)7,11,23,25. SCALeS abordou a expansão tecidual através da combinação de ureia com sorbitol, que contrapesos por desidratação a expansão tecidual induzida por ureia, e preservou a ultraestrutura tecidual avaliada pela microscopia eletrônica10. O encolhimento ou a expansão tecidual afetam os tamanhos absolutos das estruturas, as distâncias entre objetos ou a densidade celular por volume; assim, a mensuração das alterações de tamanho na compensação do tecido pode ajudar a interpretar os resultados obtidos7,26.
Em geral, um protocolo para compensação óptica consiste em várias etapas, incluindo pré-tratamento, permeabilização, imunolabeling (se necessário), correspondência de índice de refração e imagem com microscopia de luz avançada (por exemplo, dois fótons, confocal ou microscopia de fluorescência da luz-folha). A maioria das abordagens de compensação foram desenvolvidas para visualizar o tecido neuronal, e estudos emergentes validou sua aplicação em outros órgãos5. Esta ferramenta abrangente tem sido demonstrada anteriormente para permitir a análise confiável e eficiente de estruturas renais, incluindo glomérulos27,28, imune infiltrados28, vasculatura28, e segmentos túbulo 29, e é uma aproximação ideal para melhorar a compreensão da remodelação da função glomerular e do túbulo na saúde e na doença.
Resumido aqui é um método baseado em solvente que combina imunocoloração de túbulos renais; clareira óptica com produtos químicos de etilo (ECi), não tóxico e pronto a utilizar; e a imagem latente da microscopia confocal que permite a visualização e a quantificação completas do túbulo. Este método é simples, combina o antígeno-recuperação de fatias do rim com mancha de anticorpos comerciais, e não exige o equipamento especializado, que o faz acessível à maioria de laboratórios.

<table><tbody><tr><td>0,22 &micro; m filtro</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-761-112</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cônico de 15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>Agulha borboleta de 21 G</td><td>Braun</td><td>Venofix</td><td></td></tr><tr><td>Torneira de 3 vias</td><td>Fisher Scientific</td><td>K420163-4503</td><td></td></tr><tr><td>Software de análise 3D</td><td>Bitplane AG</td><td>IMARIS</td><td></td></tr><tr><td>Software de análise 3D</td><td>Cellprofiler</td><td></td><td>software livre de código aberto</td></tr><tr><td>5-0 sutura de seda</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-50</td><td></td></tr><tr><td>Seringas de plástico de 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-57</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonal Anti-BrdU</td><td>Roche</td><td>11296736001</td><td></td></tr><tr><td>Diluente de anticorpos</td><td>Dako</td><td>S0809</td><td></td></tr><tr><td>CD31-647</td><td>BioLegend</td><td>102516</td><td></td></tr><tr><td>Solução de recuperação de antígeno à base de citrato</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-3300</td><td></td></tr><tr><td>Hemostático curvo</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-14</td><td></td></tr><tr><td>Dako Wash Buffer</td><td>Agilent</td><td>S3006</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação</td><td>Motic</td><td>DSK-500</td><td></td></tr><tr><td>de incorporação</td><td>Carl Roth</td><td>E478.1</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td></td><td></td>100983</tr><tr><td>Cinamato de etila</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>112372</td><td></td></tr><tr><td>Filme flexível / Parafilm M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-AQP2</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-9882</td><td></td></tr><tr><td>Cobaia anti-NKCC2</td><td>N / A</td><td>N / A</td><td>DOI: 10.1681 / ASN.2012040404</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Carl Roth</td><td>P074.1</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sagent Pharmaceuticals</td><td>401-02</td><td></td></tr><tr><td>Hemostat</td><td>Agnthos</td><td>312-471-140</td><td></td></tr><tr><td>Horizontal rocker</td><td>Labnet</td><td>S2035-E</td><td></td></tr><tr><td>Placa de imagem</td><td>Ibidi</td><td>81218</td><td></td></tr><tr><td>Cetamina</td><td>MWI Saúde Animal</td><td>501090</td><td></td></tr><tr><td>Micro serrefine</td><td>Fine Science Tools</td><td>18052-03</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de operação</td><td>Merit</td><td>97-272</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>O4042-500</td><td></td></tr><tr><td>Coelho anti-foshoThr53-NCC</td><td>PhosphoSolutions</td><td>p1311-53</td><td></td></tr><tr><td>Elastômero de silicone</td><td>World Precision Instruments Kwik-Sil</td><td>KWIK-SIL</td><td></td></tr><tr><td>Azida de</td> <td>sódioSigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Cortador de tecidos</td><td>Zivic Instruments</td><td>HSRA001-1</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Acros Organics</td><td>AC215682500</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Vannas</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Lancer</td><td>Series 1000</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>MWI Animal Health</td><td>AnaSed Inj SA (Xylazine)</td><td></td></tr></tbody></table>

esclarecimento ótico e imagem latente do tecido immunolabeled do rim

Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

As técnicas óticas do esclarecimento rendem o tecido transparente equilibrando o índice refração durante todo uma amostra para a imagem latente tridimensional (3-D) subseqüente. Eles receberam grande atenção em todas as áreas de pesquisa para o potencial de analisar estruturas multicelulares microscópicas que se estendem por distâncias macroscópicas. Dado que os túbulos do rim, a vasculatura, os nervos, e os glomérulos estendem em muitos sentidos, que foram capturados somente parcialmente por técnicas bidimensionais tradicionais até agora, o esclarecimento do tecido igualmente abriu muitas áreas novas da pesquisa do rim. A lista de métodos de compensação óptica está crescendo rapidamente, mas continua a ser difícil para iniciantes neste campo escolher o melhor método para uma determinada questão de pesquisa. Fornecido aqui é um método simples que combina a rotulagem do anticorpo de fatias grossas do rim do rato; compensação óptica com cinetato de etilo químico barato, não tóxico e pronto a usar; e imagem latente confocal. Este protocolo descreve como perfuse rins e usa uma etapa do antígeno-recuperação para aumentar o anticorpo-emperramento sem exigir o equipamento especializado. Sua aplicação é apresentada em estruturas multicelulares diferentes da imagem latente dentro do rim, e como pesquisar defeitos a penetração pobre do anticorpo no tecido é endereçada. Discutimos também as dificuldades potenciais de fluoróforos endógenos de imagem e adquirindo amostras muito grandes e como superá-las. Este protocolo simples fornece uma ferramenta easy-to-setup e detalhada para estudar o tecido em três dimensões.

Os rins são órgãos complexos compostos por 43 diferentes tipos de células31. A maioria dessas células formam grandes estruturas multicelulares, como glomérulos e túbulos, e sua função é altamente dependente de interações entre si. As técnicas histológicas clássicas de 2-D capturam parcialmente estas grandes estruturas e podem faltar mudanças focais dentro das estruturas intactas31. Assim, a análise 3-D usando técnicas de compensação óptica ajuda a entender como elas funcion...

A combinação da rotulagem do anticorpo, do esclarecimento ótico, e da microscopia de luz avançada permite a análise tridimensional de estruturas ou de órgãos completos. Descrito aqui é um método simples para combinar o Immunolabeling de fatias de rim grossas, o esclarecimento ótico com cinnamate do Ethyl, e a imagem latente confocal que permite o visualização e a quantificação de estruturas tridimensionais do rim.

Esclarecimento ótico e imagem latente do tecido Immunolabeled do rim

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...

O crescente interesse em estudar grandes estruturas multicelulares levou ao desenvolvimento desta técnica de compensação óptica que permite uma visualização tridimensional e quantificação de grandes estruturas dentro de órgãos transparentes. Este protocolo fornece uma ferramenta simples, barata, fácil de configurar e abrangente para investigar tecidos em três dimensões. A natureza multicamadas de uma doença nem sempre pode ser simulada por técnicas bidimensionais tradicionais.A análise tridimensional do tecido pode ajudar a diagnosticar e monitorar melhor a doença. Este método não se restringe ao tecido renal e pode ser aplicado a qualquer tecido normal e doente. Este protocolo simples é fácil de seguir para qualquer cientista com alguma experiência em manejo animal.É importante testar diferentes anticorpos em caso de rotulagem de anticorpos pobres, e realizar controles secundários de anticorpos. Comece preparando heparina contendo PBS e 3,0% paraformaldeído em 1X PBS de acordo com as instruções do manuscrito e transferindo as soluções para seringas plásticas separadas de 50 mL. Paraformaldeído é tóxico e deve ser preparado no capô da fumaça.Coletar e profuser o rim de acordo com as instruções do manuscrito. Em seguida, remova a cápsula e corte o rim em fatias coronais de um mm de espessura. Mergulhe as fatias renais com a solução preparada paraformaldeído em um tubo cônico de 15 mL.Após a fixação, lave a fatia de rim duas vezes com tampão de lavagem 1X por uma hora em um roqueiro horizontal e, em seguida, proceda com a recuperação de antígeno. Aqueça 300 mL de solução de unmasking de antígeno 1X em um béquer de 500 mL. Em seguida, inclua uma fatia de rim em uma fita de incorporação permeável ao tampão aquecido e mexa-a por uma hora a 92 a 98 graus Celsius.É importante manter a temperatura estável entre 92 e 98 graus Celsius para esta etapa de recuperação de antígenos. Em seguida, transfira a fatia em 10 mL de tampão de lavagem 1X com 0,1% Triton X-100 e arrase durante a noite. No dia seguinte, lave a fatia duas vezes com 10 mL de tampão de lavagem 1X fresco por uma hora.Diluir o anticorpo primário em 500 microliters de anticorpos normais diluídos. Balance suavemente a fatia de rim em anticorpo primário diluído por quatro dias a 37 graus Celsius. Após a incubação, lave a fatia de rim em 10 mL de tampão de lavagem de 1X durante a noite em temperatura ambiente, alterando o buffer uma vez após oito horas.Diluir os anticorpos secundários em 500 microliters de anticorpos normais diluídos e incubar com a fatia de rim por quatro dias a 37 graus Celsius. Por favor, note que a partir deste passo em frente, a fatia de rim deve ser protegida da luz. Após a incubação com anticorpos secundários, lave a fatia de rim em 10 mL de tampão de lavagem de 1X durante a temperatura ambiente.Para desidratar a fatia renal, transfira-a para cinco mL de alto grau 100% etanol e abale-a por duas horas em temperatura ambiente, refrescando o etanol após uma hora. Mergulhe a fatia de rim em dois mL de cinnamate etílico e arrase suavemente durante a noite. Quando estiver pronto para a imagem do tecido, adicione 600 a 1000 microliters de cinnamate etílico em um prato de fundo de vidro e transfira a fatia de rim para o prato.Coloque um deslizamento de cobertura redonda na fatia de rim e sele o prato com filme de parafina. Coloque o prato sobre a plataforma de imagem do microscópio e imagem do tecido de acordo com as instruções do manuscrito. Este protocolo tem sido usado para realizar com sucesso a análise 3D no tecido renal e avaliar funções e interações celulares.O método pode causar a extinção de repórteres fluorescentes, mas outras proteínas fluorescentes fortes podem resistir à extinção do sinal. Profusão de aoórtica abdominal pode melhorar a difusão de anticorpos. Em alguns casos, a má penetração de anticorpos resulta em um sinal superficial.Isso pode ser corrigido com maiores concentrações ou reposição de anticorpos. O parto intravascular deve ser considerado se o antígeno de interesse for expresso na vasculatura renal. No entanto, anticorpos que visam proteínas na membrana apical das células epiteliais do túbulo não cruzam a barreira de filtração glomerular e causam sinais inespecíficos.O tecido pode ser rotulado com os anticorpos para detectar uma população celular específica ou para visualizar segmentos de túbulos inteiros. Além disso, a colocalização de proteínas em 3D pode ser alcançada combinando múltiplos anticorpos. É importante lembrar que a rotulagem de anticorpos pode ser melhorada com boa profusão renal, uso de passo de recuperação de antígeno e alta concentração de anticorpos.Algumas proteínas fortes dos repórteres podem resistir à extinção do sinal fluorescente seguindo este protocolo. Para testar isso, pule as etapas de recuperação de antígenos e rotulagem de anticorpos. Essa técnica respeita a natureza tridimensional das estruturas e abre muitas novas áreas para a pesquisa.Elimina as suposições e interferências necessárias associadas à análise bidimensional tradicional.

optical-clearing-and-imaging-of-immunolabeled-kidney-tissue

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Fonte: Behera, R. K., et al. Um método baseado em fluorescência para estudar a regulação gênica bacteriana em tecidos infectados. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra um método para preparar tecido renal de camundongos infectado, colorir DNA e detectar expressão gênica bacteriana usando repórteres fluorescentes duplos. O vermelho marca todas as bactérias, e o verde destaca células sensíveis a infecções.

Imagem por fluorescência da colonização bacteriana em tecido renal de camundongos

Este vídeo demonstra um ensaio para a coloração de toda a montagem de rins murinos usando um método de limpeza de tecido chamado CUBIC (coquetéis de imagem cérebro/corpo claros e desobstruídos e análise computacional) e coloração imunofluorescente. O rim é submetido à limpeza do tecido, em que o rim é deslipidado, descolorido e tratado com uma solução correspondente ao índice de refração para tornar o tecido transparente para uma imagem tridimensional ideal. O tecido é corado com anticorpos...

Uma técnica de coloração de órgãos de montagem total para imagens tridimensionais do rim

ACT-PRESTO (clareza técnica de pressão ativo relacionado transferência eficiente e estável de macromoléculas em órgãos) permite o rápido e eficiente, mas barato compensação tecido e penetração anticorpo rápida nos tecidos foi afastada pelo difusão passiva ou parto assistido à pressão. Usando este método, uma vasta gama de tecidos pode ser apagada, por immunolabeled anticorpos múltiplos, e o volume-fotografada.

ACT-PRESTO: Clearing tecido biológico e Métodos imunomarcação for Imaging Volume

Aqui, descrevemos uma abordagem de microscopia de folha clara para visualizar o infiltrado de leucócitos CD45 + cardíacos em um modelo murino de miocardite fulminante asséptica, que é induzida pelo tratamento de toxina diftônica intratraqueal de ratos CD11c.DTR.

Visualização Quantitativa de Infiltrado de Leucócitos em um Modelo Murino de Miocardite Fulminante por Microscopia de Folha de Luz

Descrevemos um protocolo para microdisseção a laser de subsegmentos do rim humano, incluindo o glomerulus, túbulo proximal, membro ascendente espesso, coletor de duto e interstício. O RNA é então isolado dos compartimentos obtidos e o sequenciamento de RNA é realizado para determinar alterações na assinatura transcriômica dentro de cada subsegmento.

Aplicação de microdisseção a laser para descobrir transcrição regional em tecido renal humano

O objetivo deste protocolo é isolar regiões de marca-passo intactas da pelve renal do rato usando seção de vibratome. Essas seções podem então ser usadas para imagens in situ Ca2+ para elucidar propriedades transitórias ca2+ de células marcapassos e outras células intersticiais em fatias de vibratome.

Isolando e Imagens Ao Vivo, Regiões de Marcapasso Intacta da Pelve Renal do Rato por Vibratome Sectioning

Aqui apresentamos um protocolo para adaptar o método CLARITY dos tecidos cerebrais para retinas de montagem inteira para melhorar a qualidade da coloração imunohistoquímica padrão e imagens de alta resolução de neurônios retinais e suas estruturas subcelulares.

Imunostaining de Retinas de Monte Inteiro com o Método de Limpeza tecidual CLARITY

Identificar o tipo de célula responsável pela secreção de citocinas é necessário para entender a patobiologia da doença renal. Aqui, descrevemos um método para corar quantitativamente o tecido renal em busca de citocinas produzidas por células epiteliais ou intersticiais renais usando brefeldina A, um inibidor de secreção e marcadores específicos do tipo de célula.

Identificação da fonte de proteínas secretadas no rim por injeção de Brefeldin A

Aqui, apresentamos um protocolo utilizando microscopia de 2 fótons em ratos Wistar Fromter de Munique com glomérulos superficiais para quantificar os efeitos da obstrução ureteral prolongada na dinâmica e função glomerular.

Usando a microscopia de 2-fótons para quantificar os efeitos da obstrução ureteral unilateral crônica nos processos glomerulares

O presente protocolo descreve um método de clareamento tecidual e coloração imunofluorescente de montagem completa para imagens renais tridimensionais (3D). Esta técnica pode oferecer perspectivas macroscópicas na patologia renal, levando a novas descobertas biológicas.

Coloração tridimensional de rim inteiro com CUBIC

Este estudo apresenta um conjunto fácil de usar, completo e simples de métodos para marcar e analisar glomérulos de rins de camundongos eliminados pela CUBIC. Dados como número e volume de glomérulos podem ser obtidos de forma fácil e confiável usando isotiocianato de fluoresceína (FITC)-Dextran, microscopia de fluorescência de folha de luz (LSFM) ou microscopia confocal comum e software como Imaris.

Um método eficiente e rápido para rotular e analisar glomérulos de camundongos

Aprenda a técnica de clareamento óptico e imagem de tecido renal immunolabelado para análise tridimensional de estruturas multicelulares. Este método acessível permite visualizar e quantificar arquitetura tecidual em órgãos transparentes.

Esclarecimento ótico e imagem latente do tecido Immunolabeled do rim

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