Name: Caracterização de transportadores de membrana por expressão heterologous em E. coli e produção de vesículas de membrana (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 16 s
Description: Aprenda a caracterizar transportadores de membrana em E. coli usando vesículas de membrana. Este método simplificado permite quantificar afinidades de substrato e estudar mecanismos de transporte sem reconstituição em lipossomos.

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O suporte para este projeto veio da FACULDADE de Pós-Graduação BGSU e do Escritório de Programas e Pesquisapatrocinados da BGSU.

1. Geração do E. coli Double Knock Out Mutant com Transdução P1
<ol><li>Obter o E. coli single-knockout mutantes cepas ΔPotE e ΔCadB do E. coli Genetic Stock Center<a href="http://cgsc.biology.yale.edu" target="_blank">(http://cgsc.biology.yale.edu).</a> Nota: A cepa ΔPotE é resistente à kanamicina26 e a cepa ΔCadB é resistente à tetraciclina27.</li>
	<li>Construa a cepa de nocaute duplo PotE/CadB (DKO) usando o protocolo de transdução P128.<ol>
<li>Preparação de lysate<ol>
<li>Diluir uma cultura durante a noite de ΔPotE em LB fresco (1:100) complementada com 10-25 mM MgCl2,5 mM CaCl2, e 0,1-0,2% de glicose.</li>
			<li>Crescer a 37 °C para 1-2 h.</li>
			<li>Adicione 40 μL de lysate de fago P1 à cultura e continue crescendo a 37 °C. Monitorpara 1-3 h até que a cultura tenha lysed NOTA: Quando a cultura é lysed, detritos celulares serão visíveis no tubo e a cultura terá uma perda significativa de turbidez.</li>
			<li>Adicione várias gotas de clorofórmio (50-100 μL) ao lysate e vórtice. Centrífuga a 12.000 x g para 2 min para remover detritos celulares e transferir o supernatant para um tubo fresco.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Transdução<ol>
<li>Crescer cepa ΔCadB durante a noite no meio LB.</li>
			<li>Colher as células por centrífuga a 4.000 x g para 2 min e resuspender em 1/5-1/3 o volume de cultura colhida em LB fresco complementado com 100 mM MgSO4 e 5 mM CaCl2.</li>
			<li>Adicione a suspensão celular ΔCadB ao tubo com fago do passo 1.2.1.4 e misture rapidamente.</li>
			<li>Adicione 200 μL de 1 M Na-Citrate (pH5.5), em seguida, adicione 1 mL de LB. Incubate em 37 °C para 1 h para permitir a expressão do marcador resistente aos antibióticos.</li>
			<li>Células de rotação a 4000 x g por 5 min.</li>
			<li>Resuspenda em 100 μL LB supplemeted com 100 mM Na-Citrate (pH 5.5) e vórtice bem para dispersar as células.</li>
			<li>Selecione as cepas recombinantes em placas de ágar LB com 50 μg/mL kanamicinina e 10 μg/mL tetraciclina e, em seguida, confirmar por Polymerase Reação Em Cadeia (PCR) com primers apropriados26,27.</li>
			<li>Verifique os fragmentos de PCR por sequenciamento.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Expressão do Gene alvo (AtBAT1) em E. coli Mutant
<ol><li>Amplificar a sequência completa do gene alvo por PCR e inserir no vetor de entrada Gateway pENTR/D-TOPO29. Nota: Neste caso, atbat1.1 foi amplificado usando primer para a frente 5'CGGCGATCAATTTTGTT e primer reverso 5'GCTAAGAATGTTGGAGATGG, uma desnaturação inicial a 98 °C por 2 min e, em seguida, 30 ciclos de desnaturação a 98 °C por 0,1 min, annealing em 59 °C por 0,3 min, extensão de 72 °C por 0,40 min e extensão final em 72 °C por 10 min. O produto PCR foi purificado usando um kit de limpeza PCR, quantificado usando um espectrômetro. A inserção do produto PCR no vetor Gateway foi feita seguindo as instruções dos manufactrurers.<ol>
<li>Transforme o vetor de entrada em células Top10 E. coli competentes por heatshock e selecione para recombinantes bem-sucedidos na mídia LB com 50 μg/mL kanamicinseguindo protocolos de clonagem molecular padrão30.</li>
		<li>Extraia dna de plasmídeo usando um kit de extração de plasmídeos, seguindo as instruções do fabricante, e seqüência para confirmar a inserção correta.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transfira o gene alvo para o vetor de destino E. coli, pBAD-DEST49 pela clonagem Gateway LR para criar um vetor de expressão29.<ol>
<li>Transforme o vetor de expressão em células Top10 E. coli competentes por heatshock para 30 s e selecione recombinantes bem-sucedidos na mídia LB com 100 μg/mL ampicilina30.</li>
		<li>Extraia dna plasmid30 e seqüência para confirmar a inserção correta.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transforme o vetor de expressão em E. coli ΔpotE740 (del)::kan, ΔcadB2231::Tn10 e selecione em placas LB com ampicilina, kanamicina e tetraciclina30.</li>
	<li>A fim de determinar a concentração ideal de arabinose para a indução, expressar o gene alvo o controle do promotor araBAD na mídia LB com concentrações de gradiente de arabinose como descrito29.</li>
	<li>Coletar as pelotas celulares e avaliar a expressão de proteína por SDS-PAGE e visualização de bandas de proteína, conforme descrito no manual do produto29. Nota: O E. coli ΔpotE740 (del)::kan, ΔcadB2231::Tn10 foi usado como a amostra de controle sem expressão BAT1. E.coli dupla derrubar células mutantes com o vetor pBAD-DEST49 vazio não foi usado como um controle devido à presença do gene ccdB no vetor.</li>
</ol>3. Geração de vesículas de membrana de dentro para fora
<ol><li>Cultura as células mutantes E. coli expressando a proteína alvo, crescendo uma única colônia durante a noite em 5 mL de mídia livre de poliamina (2% glicerol, 6 g de K2HPO4, 3 g de KH2PO4, 0,5 g de NaCl, NH4Cl, 50 mg de tiamina, 0,79 g de fermento completa mídia sintética adenina hemisulfate (10 mg/L), L-Arginine (50 mg/L), L-Aspartic ácido (80 mg/L), L-Histi Monohidrato de cloridrato de águaimorda (20 mg/L), L-Leucine (100 mg/L), cloridrato de L-Lysine (50 mg/L), L-Methionine (20 mg/L), L-Fenilalanina (50 mg/L), L-Threonine (100 mg/L), L-Tryptophan (50 mg/L), L-Tyrosine (50 mg/L), L-Valine (140 mg/L), Uracil (20 mg/L)). Transfira esta cultura para 500 mL de mídia livre de poliamina complementada com 0,0002% arabinose e crescer até que a cultura celular atinja um OD600 de 0,6-0,8 (geralmente ~ 5 h).</li>
	<li>Colete a pelota celular por centrífuga a 2.000 x g por 15 min a 4 °C. Resuspenda a pelota e lave três vezes com 0,1 M tampão de fosfato de potássio, pH 6.6, contendo 10 mM EDTA (Buffer 1). O volume final de células em Buffer 1 após a terceira rotação deve ser de 10 mL.</li>
	<li>Gerar vesículas de membrana de dentro para fora pelo tratamento da imprensa francesa (10.000 p.s.i.) das células intactas usando uma célula de pressão francesa de 35 mL.</li>
	<li>Antes de carregar a amostra na célula de pressão francesa padrão, lubrifique o pistão e os anéis O para facilitar a inserção na célula. Nota:Estas instruções são específicas para o uso da célula de pressão padrão31.<ol><li>Cuidadosamente parafuso o plug de encerramento na extremidade inferior da célula. Certifique-se de que a célula está do lado direito para cima com base nas letras do lado da célula. Insira o pistão na célula e mova-o para a célula, até que a linha máxima de preenchimento no pistão atinja o topo do pistão. Vire a unidade e coloque no estande fornecido entre os três postes.</li>
		<li>Despeje a suspensão celular no corpo da célula. Nota: Temos vindo a utilizar apenas 10 mL, por isso haverá muito espaço deixado na câmara de células de pressão francesa, que tem uma capacidade de 35 mL.</li>
		<li>Monte a célula de pressão padrão na unidade de células de pressão francesa.<ol>
<li>Primeiro verifique se a energia está desligada. No lado esquerdo do painel está o interruptor do seletor da relação. Tem três posições: Para baixo no fim do funcionamento, baixo para usar uma pilha menor da pressão, e elevado para o uso com a pilha francesa padrão da pressão. Se a imprensa francesa foi usada previamente com a pilha menor o pistão não pode inteiramente ser retraído. Definir este interruptor para baixo.</li>
		</ol></li>
		<li>Ligue a máquina com o interruptor no RHS na parte de trás da unidade e ligue o interruptor Pause-Run para a posição de corrida. Isso resultará no pistão sendo totalmente retraído. Mova o interruptor de volta para pausa,e desligue a máquina.</li>
		<li>Solte os parafusos do polegar e mova a braçadeira de segurança que se estende para duas colunas de aço inoxidável para o lado. Ele vai balançar para a direita. Com uma mão segurando a base do plugue de fechamento no lugar, pegar a célula de pressão francesa com as duas mãos, e girá-lo 180 °, de modo que o pistão está agora na posição vertical. Coloque-o na plataforma, e mover a segurança de volta no lugar para que esta braçadeira mantém a célula de pressão francesa na posição.</li>
		<li>Observe que a montagem da Válvula flow no plugue de fechamento precisa ser acessível ao operador e posicionada para que a válvula possa ser girada livremente. Abra a montagem da válvula de fluxo com algumas voltas no sentido horário. Posicione os braços do pistão para que eles sejam orientados em uma posição de duas horas e oito horas. Aperte os parafusos polegares para que a célula de pressão padrão é realizada no lugar.</li>
		<li>Insira o tubo de saída da amostra no plugue de fechamento e conecte um pequeno pedaço de tubulação flexível para que os detritos celulares quebrados possam ser coletados em um tubo de falcão. Costumamos usar um copo cheio de gelo de 300 mL para segurar o tubo de falcão na posição vertical, e para manter os detritos da célula refrigerados.</li>
		<li>Certifique-se de que o interruptor Pause-Run está definido para pausar,e a montagem da válvula está em posição aberta. Ligue a máquina de volta para, adust o interruptor Ratio Selector para alta,e vire a válvula de aumento de pressão no painel frontal para a direita cerca de meia volta.</li>
		<li>O pistão começará a subir a partir da base para deslocar o ar na câmara. Dirijar o ar que sai da tubulação Tygon ligado ao tubo de saída de amostra para o tubo no copo.</li>
		<li>Quando as primeiras gotas de líquido saem, feche a montagem da válvula de fluxo, transformando-o no sentido horário. Isso cria um selo de metal para metal, com a célula de pressão, por isso não apertar demais.</li>
		<li>A frente da imprensa francesa tem um gráfico no painel frontal para gerar a pressão adequada sobre as células biológicas dentro da célula de pressão. Neste caso, aumentar a pressão, transformando a válvula de aumento de pressão no sentido horário, até que o calibre atinge 640 psi. Isso criará uma pressão interna de 10.000 psi.</li>
		<li>Uma vez que a célula atingiu a pressão alvo abrir a montagem da válvula de fluxo ligeiramente, transformando-o no sentido horário. Ajuste a abertura da válvula para permitir uma taxa de fluxo de apenas cerca de 10 gotas por minuto.</li>
		<li>Quando a linha de parada no corpo pistão atinge o topo da célula de fluxo. Mude o interruptor pausado para pausar. Isso é fundamental porque ter o pistão inserido mais longe na célula irá danificar a unidade. Abra a montagem da válvula de fluxo e recolher as quedas restantes.</li>
		<li>Ligue o seletor de proporção para baixoe, em seguida, defina o interruptor pause run para executar. Quando a placa inferior estiver totalmente retraída, defina o interruptor run para pausare desligue a máquina.</li>
		<li>Retire a célula de pressão francesa da imprensa francesa, e desmontar para a limpeza. Armazenar todas as partes secas com uma leve cobertura de glicerol. Retire e substitua quaisquer juntas ou selos com sinais de desgaste.</li>
	</ol></li>
	<li>Remover células ininterruptas e detritos celulares da imprensa francesa eluent por centrífuga a 10.000 x g para 15 min a 4 °C. Descarte a pelota e transfira tubos supernatant para tubos ultracentrífugas.</li>
	<li>Vesículas de membrana de pelota do supernatant resultante por ultracentrífugationat 150,000 g para 1 h a 4 °C.</li>
	<li>Lave as vesículas de membrana uma vez, sem resuspensão, em 1 mM Tris-maleate, pH 5.2 contendo 0,14 M KCl, 2 mM 2-mercaptoethanol e 10% glicerol e resuspender no mesmo buffer (Buffer 2)23 usando um moedor de tecido Dounce. Normalmente, a fração de membrana de 500 mL de cultura seria suspensa em 5 mL de buffer, e uma concentração de 5-10 mg de proteína de membrana / mL usando o ensaio ácido biochinic32.</li>
	<li>Armazenar 100 μL alíquotas de preparação de membrana em -80 °C em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
</ol>4. Blot ocidental e orientação do ensaio do transportador
<ol><li>Lave e resuspenda vesículas do passo 3.7 em 30 mM Tris pH 7.8 + 0.1 mM CoCl2.</li>
	<li>Para 100 amostras μL, adicionar 1 μL de 2 mg/mL carboxypeptidase A em 0,1 M NaCl, 30 mM Tris, 0,2 mM CoCl2 pH 7,8.</li>
	<li>Inscular por 20 min a 20 °C. Pare a digestão adicionando 5 μL de 0,5 M NaEDTA, 0,5 M 2-mercaptoethanol pH 7.5.</li>
	<li>Para inativar totalmente a enzima, incubar a solução para 1 h à temperatura ambiente. Nota: Vesículas sem o tratamento catboxypeptidase A foram utilizados como controle.</li>
	<li>Analise amostras por eletroforese na presença de sulfato dodócia de lítio. Adicionar 5-10 μL de 150 mg/mL de lítio dodecyl sulfato, 450 mg/mL glicerol, 0,1 mg/mL bromehenol azul, 0,4 M Tris pH 7,5 a 100 μL de amostra.</li>
	<li>Realize imunobofinos colocando um filtro nitrocelulose umedecido com 25 mM de sódio-hidrogênio fosfato pSH 7.5 sobre o gel de poliacrilamida. Coloque estes entre dois filtros de celulose umedecido e, finalmente, entre duas almofadas de lavagem de plástico umedecido. Coloque esta montagem entre os eletrodos de uma câmara contendo 25 mM de sódio-hidrogênio fosfato pS7.5 a 2-4 °C.</li>
	<li>Permitir que a eletrotransferência de proteínas prossiga para 3 h a 20 V e 2-3 A.</li>
	<li>Bloqueie a membrana nitrocelulose durante a noite a 2 °C em um buffer de bloqueio de 0,15 M NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5 e 0,5 mg/mL Tween 2033.</li>
	<li>Incubar o filtro nitrocelulose por 2 h com uma diluição de 1:5000 de anticorpo anti-seu (terminal C)-HRP no tampão de bloqueio (20 mL) e lave duas vezes com 50 mL de buffer para um total de 60 min.</li>
	<li>Para visualizar a imunoblota, dissolva 6 mg de 4-cloro-1-naphthol em 20 mL de álcool desnaturado e adicione 80 mL de 15 mM Tris pH 7,5 e 50 μL de 30% H2O2. Banhe o papel de filtro na solução de substrato por 20 min. O reagente reagirá com o anticorpo para formar um precipitado azul na membrana nitrocelulose. Quando a cor suficiente se desenvolveu, lave a membrana com água, e deixe secar.</li>
</ol>5. Ensaio de transporte
<ol><li>Incubar 100 μL alíquotas de vesículas de membrana a 12 °C por 5 min.</li>
	<li>Inicie o transporte adicionando poliaminas radioetiquetadas às vesículas da membrana em uma concentração final de 50 μM (salvo indicação de outra maneira). Faça 3soluções de substrato H (espermidina ou putrescine) em um amortecedor de ensaio consistindo de 10 mM Tris-HCl, 10 mM fosfato de potássio, pH 8.0 e 0,14 M KCl23 (Buffer 3) com modificações dependendo do ensaio.</li>
	<li>Realizar ensaios de transporte para 1 min a 12 °C em tubos de microfúgios de 1,5 mL.</li>
	<li>Após 1 min, transfira as misturas de reação para filtragem de filtragem e filtre através de um filtro de membrana nitrocelulose de 0,45 μm.<ol>
<li>Adicione 3 mL de buffer de ensaio gelado contendo uma concentração 10 vezes maior de poliaminas não rotuladas, seguida por 3 mL de amortecedor de ensaio sem as poliaminas para reduzir a ligação inespecífica.</li>
		<li>Transfira os filtros lavados para frascos de cintilação descartáveis de 20 mL contendo 10 mL de líquido de cintilação e determine a radioatividade usando um contador de cintilação líquida. O contador de cintilação mede a radioatividade na amostra e relata-a como desintegrações por min (dpm).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calcule a captação líquida de poliamina como a diferença entre a captação de 1 min por vesículas incubadas a 12 °C e captação de 0 min por vesículas incubadas no gelo. Nota: A massa de substrato importado para as vesículas é calculada da seguinte forma. Se o volume da amostra no tubo de microfúgio é de 0,2 μL e a concentração inicial de substrato é de 100 μM, então a massa total de substrato no tubo de microfúgio é de 20 x 10-12 M. Devido à atividade específica muito alta de substratos rotulados comercialmente (muitas vezes 2,22 x 109 dpm/mM) a massa do isótopo adicionado pode ser ignorada no cálculo. Então, se a quantidade total de isótopoque foi adicionado ao tubo de microfúgio foi de 100 x 106 dpm e as vesículas tiveram uma captação líquida de 1.000 dpm, então a massa total de substrato supérfluo foi de 1% do número total de toupeiras de substrato ou 2 x 10-13 M.<ol>
<li>Determine Km para o substrato medindo a captação de 10, 25, 50, 250 e 500 μM substrato radioetiquetado em vesículas expressando a proteína alvo. Calcule a cinética Michaelis-Menten usando um método de regressão não linear usando o modelo Michaelis Menton do pacote de software estatístico34.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para os experimentos de competição, adicione 100 μM, 500 μM, 1 mM, 1,5 mM ou 2 mM substrato competitivo não rotulado feito no buffer de ensaio para o tubo de microcentrífuga de 1,5 mL contendo 100 μL de vesículas a 12 °C.<ol>
<li>Adicione poliamina com rótulo de rádio (50 μM) ao tubo de microcentrífuga simultaneamente.</li>
		<li>Medir a radioatividade presa dentro das vesículas, como mencionado acima, repetindo passos 5 a 5,4,2.</li>
		<li>Determine a aparente Km (Km,app)para os substratos competitivos medindo a captação de 10, 25, 50, 250 e 500 μM poliaminas radiorotuladas na presença de 100 μM ou substratos não rotulados superiores e usando um método de regressão não linear para traçar a curva.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

No presente estudo, descrevemos um método para a caracterização de um antiporter, primeiro expressando a proteína em E. coli e, em seguida, gerando vesículas de membrana, de modo que a proteína expressa heterologously pode ser amenizado em um sistema livre de células. Além de equipamentos encontrados na maioria dos laboratórios de biologia molecular, esta estratégia requer o uso de uma imprensa francesa, uma ultracentrífuga e acesso a uma instalação para realizar ensaios de radioisótopos.
<p class="jove_cont...

As proteínas envolvidas no tráfico de metabólitos constituem um nível essencial de regulação fisiológica, mas a grande maioria dos transportadores de membranas vegetais ainda não foi funcionalmente caracterizada. Várias estratégias foram implementadas para caracterizar novas proteínas de transporte. Expressão heterologous em organismos modelo como E. coli e células eucarióticas, como levedura, oócitos xenopus, células de mamíferos, células de insetos e células vegetais têm sido usados para determinar sua atividade de transporte1. As células eucarióticas são favorecidas pela expressão de proteínas eucarióticas, pois a composição celular básica, as vias de transdução de sinal, transcrição e máquinas de tradução são compatíveis com as condições nativas.
O fermento tem sido um organismo modelo importante para a caracterização de novas proteínas de transporte em plantas. A primeira proteína de transporte vegetal que foi expressa com sucesso em levedura(Saccharomyces pombe)foi o transportador hexose HUP1 de Chlorella2. Desde então, muitas proteínas de transporte de plantas têm sido funcionalmente caracterizadas usando um sistema de expressão de levedura. Estes incluem, transportadores de açúcar de plantas (SUC1 e SUC23,VfSUT1 e VfSTP14)e os transportadores de auxina (AUX1 e PIN5). As desvantagens de utilizar levedura para expressar proteínas vegetais podem incluir atividade prejudicada de proteínas localizadas com plastide, pois o fermento não tem essa organela, a segmentação inativa6,e a formação de agregados mal dobrados e a ativação de respostas ao estresse em levedura devido à superexpressão das proteínas da membrana7,8,9.
A expressão heterologous de proteínas do transporte em oocytes de Xenopus foi amplamente utilizada para a caracterização electrophysiological dos transportadores10. As primeiras proteínas de transporte de plantas caracterizadas usando expressão heterologous em oócitos Xenopus foram o canal Arabidopsis potassium KAT110 e o transportador de hexose Arabidopsis STP111. Desde então, os oócitos Xenopus têm sido empregados para caracterizar muitas proteínas de transporte de plantas, como transportadores de membrana plasmática12,transporte de surose vacuolar SUT413 e transportador de malado vacuolar ALMT914. Uma importante limitação dos oócitos Xenopus para ensaios de transporte é que a concentração de metabólitos intracelulares não pode ser manipulada1. Além disso, o conhecimento profissional é necessário para preparar os oócitos Xenopus e a variabilidade dos lotes de oócito é difícil de controlar.
A expressão heterologous no organismo modelo E. coli é um sistema ideal nos termos da caracterização de proteínas novas do transporte da planta. Com um genoma totalmente sequenciado15,as características moleculares e fisiológicas de E. coli são bem conhecidas. Ferramentas e técnicas moleculares estão bem estabelecidas16. Além disso, vetores de expressão diferentes, cepas não patogênicas e mutantes estão disponíveis17,18,19. Além disso, E. coli tem uma alta taxa de crescimento e pode ser facilmente cultivada em condições de laboratório. Muitas proteínas podem ser facilmente expressas e purificadas em quantidades elevadas em E. coli9. Quando as proteínas não podem ser amenizadas diretamente nos sistemas celulares, a reconstituição de proteínas em lipossomos também tem sido uma inovação bem sucedida, embora desafiadora, para a caracterização de proteínas de membrana purificadas. Caracterização funcional das proteínas de transporte mitocondrial de plantas, incluindo transportadores solute, como transportadores de fosfato em soja, milho, arroz e arabidopsia, portador de dicarboxil-tricarboxilato em Arabidopsis foram realizadas usando este sistema modelo20,21. No entanto, proteínas recombinantes da proteína de tomate SICAT9 foram encontradas não funcionais em experimentos de reconstituição, e outros membros da família cat transportador foram encontrados para ser não funcional em xenopus oocyte ensaios22. Assim, são necessárias ferramentas moleculares adicionais para a caracterização dos transportadores de membrana.
Cinco sistemas de transporte de poliamina são encontrados em E. coli23. Eles incluem dois transportadores ABC mediando a captação de espermidina e putrescine, um trocador putrescine/ornithine, um trocador de cadaverina/lysine, um exportador de espermidina e um importador putrescine. O trocador de putrescine PotE foi originalmente caracterizado usando um ensaio vesícula, onde de dentro para fora vesículas foram preparadas por células de lise com uma imprensa francesa e medindo a captação de putrescina radiografada nas vesículas em troca de orníntes24. Os ensaios da vesícula também foram usados para caracterizar um transportador de cálcio, que mediava o transporte de cálcio em resposta a um gradiente de prótons25. Esses experimentos nos levaram a desenvolver uma estratégia para a caracterização de outros trocadores de poliamina. Primeiro criamos uma cepa de e. coli deficiente em trocadores de PotE e CadB. Aqui, demonstramos a caracterização funcional de um antiporter de poliamina vegetal por expressão heterlogous na cepa e. coli modificada, geração de vesículas de membrana usando uma imprensa francesa e ensaios radiografados.

<table><tbody><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>3H-putrescina</td><td>PerkinElmer</td><td>NET185001MC</td><td></td></tr><tr><td>3H-espermidina</td><td>PerkinElmer</td><td>NET522001MC</td><td></td></tr><tr><td>4-cloro-1-naftol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8890</td><td></td></tr><tr><td>14C arginina</td><td>Moravek Inc.</td><td>MC137</td><td></td></tr><tr><td>Arginina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5006</td><td></td></tr><tr><td>Anti-His (C-termo)-HRP anticorpo</td><td>ThermoFisher</td><td>R931-25</td><td>Detecta a etiqueta de poli-histidina C-terminal (6xHis), requer o grupo carboxila livre para detecção</td></tr><tr><td>Arabinose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3256</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensaio de proteína BCA</td><td>ThermoFisher</td><td>23227</td><td>Pierce BCA asay kit.</td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0404</td><td></td></tr><tr><td>Carboxipeptidase B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9584-1mg</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Sorvall</td><td></td><td>SS-34 rotor de ângulo fixo e rotor de ângulo fixo GA-6</td></tr><tr><td>Moedor de tecidos</td><td>Dounce LabGenome</td><td>7777-7</td><td>Homogeneizador de pirex Corning 7777-7 com bico de vazamento.</td></tr><tr><td>Ecoscint-H</td><td>National Diagnostics</td><td>LS275</td><td>coquetel de cintilação</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coletor de filtração</td><td>Hoefer</td><td>FH225V</td><td></td></tr><tr><td>Célula de pressão francesa</td><td>Glen Mills</td><td>FA-080A120</td><td></td></tr><tr><td>GABA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2129</td><td></td></tr><tr><td>Glutamato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6904</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism software</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm" target="_blank">http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm</a></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrogênio</td><td>KROGER</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Potássio</td><td>J.T. Baker</td><td>3040-01</td><td></td></tr><tr><td>Contador de cintilação líquida</td> Filtros de membrana de nitrocelulose <td>Beckman</td><td>LS-6500</td><td></td></tr><tr><td>Maleate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0375</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Merck Millipore</td><td>hawp02500</td><td>0.45 &micro; Kit</td></tr><tr><td>de limpeza de PCR</td><td>M Genscript</td><td></td><td>QuickClean II</td></tr><tr><td>Fosfato de potássio dibásico</td><td>ThermoFisher</td><td>P290-500</td><td></td></tr><tr><td>putrescina</td><td>fluka</td><td>32810</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potássio monobásico</td><td>J.T.Baker</td><td>4008</td><td></td></tr><tr><td>Espermidina</td><td>Sigma-aldrich</td><td>S2501</td><td></td></tr><tr><td>Cepas: E. coli &Delta; potE740(del)::kan, &Delta; cadB2231::Tn10</td><td>Este manuscrito</td><td>está disponível mediante solicitação.</td><td>A deformação é deficiente nos trocadores de poliamina PotE e CadB.</td></tr><tr><td>Produtos de pesquisa</td> <td>Tris-base</td><td>T60040-1000</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga</td><td>Sorvall MTX 150</td><td>46960</td><td>Thermo Fisher S150-AT rotor de ângulo fixo</td></tr><tr><td>Tubos de ultracentrífuga</td><td>ThermoFisher</td><td>45237</td><td>Tubos de centrífuga para rotor S150-AT</td></tr><tr><td>Vetor: pBAD-DEST49 Vetor de</td> expressão <td>ThermoFisher</td><td></td><td>Gateway para E. coli</td></tr></tbody></table>

caracterização de transportadores de membrana por expressão heterologous em e. coli e produção de vesículas de membrana

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Vários métodos foram desenvolvidos para caracterizar funcionalmente novos transportadores de membrana. Poliaminas são onipresentes em todos os organismos, mas trocadores de poliamina em plantas não foram identificados. Aqui, descrevemos um método para caracterizar anticarregadores de poliamina usando vesículas de membrana geradaa a partir da lise das células escherichia coli expressando heterologously um antiporter vegetal. Primeiro, nós heterologously expressou AtBAT1 em uma cepa E. coli deficiente em poliamina e transportadores de câmbio arginina. Vesículas foram produzidas usando uma imprensa francesa, purificada pela ultracentrífugae e utilizadas em um ensaio de filtragem de membrana de substratos rotulados para demonstrar a especificidade do substrato do transportador. Estes ensaios demonstraram que atbat1 é um transportador proton-mediado de arginina, γ-aminobutírico ácido (GABA), putrescine e espermidina. A cepa mutante que foi desenvolvida para o ensaio do AtBAT1 pode ser útil para a análise funcional de outras famílias de trocadores de poliamina vegetal e animal. Nós também supor que esta abordagem pode ser usada para caracterizar muitos outros tipos de antiporters, desde que essas proteínas podem ser expressas na membrana celular bacteriana. E. coli é um bom sistema para a caracterização de novos transportadores, uma vez que existem vários métodos que podem ser empregados para mutgenizar os transportadores nativos.

Os principais passos neste protocolo são resumidos pictoally na Figura 1. Resumidamente, as células De E. coli deficientes em todos os trocadores de poliamina e expressando AtBAT1 são cultivadas, centrífugas, lavadas com um tampão e submetidas a lise celular usando uma imprensa francesa. Lise tende a produzir vesículas que são na sua maioria de dentro para fora e prender o tampão fora das células. Os detritos celulares são removidos por cent...

Descrevemos um método para a caracterização de transportadores de membrana sufrágio movidos a prótons em preparações de vesículas de membrana produzidas pela expressão heterologous em E. coli e lise de células usando uma imprensa francesa.

Caracterização de transportadores de membrana por expressão heterologous em E. coli e produção de vesículas de membrana

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Uma das principais vantagens dessa técnica para caracterizar transportadores de membrana é que você pode determinar a afinidade relativa do transportador para substratos específicos, bem como obter insights sobre o mecanismo de transporte. A caracterização de proteínas de membrana que usam gradientes proteicos para impulsionar o transporte de substratos é particularmente adequada para este ensaio vesículo de dentro para fora que demonstramos aqui. Embora este ensaio exija alguns equipamentos especializados, como uma imprensa francesa e acesso a uma ultracentrifuagem, achamos que pode ser tecnicamente mais fácil do que ensaios que exigem que transportadores de membrana sejam reconstituídos em lipossomos artificiais.A principal vantagem desta técnica é que ela nos permite quantificar as afinidades relativas para diferentes substratos e fazer ensaios de competição para testar o efeito de substratos concorrentes nas grades de transporte. No caso do transportador BAT1 usado para ilustrar este ensaio, também pudemos mostrar ativação substrato do transportador por arginina. Para iniciar este procedimento, cultuam as células mutantes E.coli preparadas que expressam a proteína alvo inoculando uma única colônia em cinco mililitros de poliamina 3 mídia com antibióticos apropriados e cultivando-a durante a noite a 37 graus Celsius.No dia seguinte, transfira essa cultura para 500 mililitros de mídia fresca de poliamina 3 que é suplementada com 0,0002% arabinose e cresça até que a cultura celular atinja um OD600 entre 0,6 e 0,8. Depois disso, centrífuga a 2000 vezes G e a quatro graus Celsius por 15 minutos para coletar a pelota celular. Suspenda a pelota e lave-a três vezes com tampão uma por centrifugação a 2000 vezes G e a quatro graus Celsius por 15 minutos cada vez.O volume final de células em Buffer um após o terceiro giro deve ser de 10 mililitros. Estabeleça uma célula de pressão francesa de 35 mililitros e despeje a suspensão celular no corpo da célula. Ligue a máquina com o interruptor no RHS na parte de trás da unidade e defina o interruptor do seletor de proporção para alto.Ligue o interruptor da bomba. O pistão começará a subir da base para deslocar o ar na câmara. Aumente a pressão girando a válvula de pressão no sentido horário até que o medidor atinja 640 PSI.Isso criará uma pressão interna de 10.000 PSI. Uma vez que a célula tenha atingido a pressão alvo, abra ligeiramente o conjunto da válvula de fluxo girando-a no sentido anti-horário. Ajuste a abertura da válvula para permitir uma vazão de apenas cerca de 10 gotas por minuto.Quando a linha de parada no corpo do pistão atinge a parte superior da célula de fluxo, desligue o interruptor da bomba. Abaixe a placa inferior colocando o interruptor seletor de razão para baixo e, em seguida, ajuste o interruptor da bomba. Quando a placa inferior estiver totalmente retraída, reduza a pressão do sistema a zero, girando a válvula de aumento de pressão totalmente no sentido anti-horário.Desligue o interruptor da bomba e desligue a máquina. Centrifugar a imprensa francesa eluante a 10.000 vezes G e a quatro graus Celsius por 15 minutos para remover células ininterruptas e detritos celulares. Descarte a pelota e transfira o supernatante para tubos ultracentrífugas.Ultracentrificar o supernasce resultante a 150.000 vezes G e a quatro graus Celsius por uma hora para pellet as vesículas da membrana. Lave as vesículas da membrana uma vez sem re-suspensão no tampão dois. Em seguida, use um moedor de tecido Dounce para suspender novamente as vesículas de membrana no tampão dois.Prepare 100 alíquotas de microliter das preparações da membrana em tubos de centrífugas de 1,5 mililitro e armazene-os a menos de 80 Celsius. Primeiro, lave e suspenda as vesículas em 30 mililitros de Tris no pH 7.8, que contém 0,1 milimilito de cloreto de cobalto II. Adicione um microliter de carboxípeptidase A em cloreto de sódio, tris e cloreto de cobalto II a cada amostra de 100 microliter.Incubar a 20 graus Celsius por 20 minutos. Adicione cinco microliters de uma solução contendo EDTA de sódio e 2-Mercaptoetanol em PH 7.5 para parar a digestão. Incubar a solução à temperatura ambiente por uma hora para inativar totalmente a enzima.Em seguida, adicione entre cinco e 10 microliters de uma solução contendo sulfato de dodecil de lítio, glicerol, azul bromofenol e Tris em pH 7,5 a 100 microlitres da amostra e analise amostras por eletroforese. Para realizar a mancha de amino, coloque um filtro de nitrocelulose umedecido com fosfato de hidrogênio de sódio de 25 milimilhas sobre o gel de poliacrilamida. Coloque-os entre dois filtros de celulose umedecidos e, finalmente, entre duas almofadas de limpeza de plástico umedecidas.Coloque esta montagem entre os eletrodos de uma câmara contendo fosfato de hidrogênio de sódio de 25 milimões a uma temperatura entre dois e quatro graus Celsius. Eletrotransmissão as proteínas a 20 volts e a dois ou três amperes por três horas. Bloqueie a membrana de nitrocelulose no bloqueio do buffer durante a noite a dois graus Celsius.No dia seguinte, incubar a nitrocelulose a 20 mililitros de um a 5.000 diluições de anticorpo HRP anti-terminal C e tampão de bloqueio por duas horas e lavar duas vezes com 50 mililitros de tampão por um total de 60 minutos. Para visualizar a mancha de amino, dissolva seis miligramas de 4-Cloro-1-naftol em 20 mililitros de álcool desnatado e adicione 80 mililitros de 15 mililitros Tris e 50 microlitros de 30% de peróxido de hidrogênio. Banhe o papel filtro nesta solução de substrato por 20 minutos.Quando a cor suficiente tiver se desenvolvido, enxágue a membrana com água e deixe secar. Para começar, incubar a alíquota de 100 microliter de vesículas de membrana a 12 graus Celsius por cinco minutos. Adicione o buffer 3 contendo poliaminas radiolabeladas em uma concentração final de 50 micromolar às vesículas de membrana em tubos de microcentrifuuge de 1,5 mililitros para iniciar o transporte.Conduza o ensaio de transporte a 12 graus Celsius por um minuto. Depois disso, transfira as misturas de reação para o coletor de filtragem e filtre-as através de um filtro de membrana nitrocelulose de 0,45 micrômetro. Adicione três mililitros de tampão de ensaio gelado contendo uma concentração dez vezes maior de poliaminas não rotuladas, seguido por três mililitros de tampão de ensaio sem as poliaminas para reduzir a ligação não específica.Transfira os filtros lavados para frascos de cintilação descartáveis de 20 mililitros contendo 10 mililitros de líquido de cintilação e use um contador de cintilação líquida para determinar a radioatividade. Calcule a captação líquida de poliamina conforme descrito no protocolo de texto. Determine o Km para o substrato medindo a absorção de substrato radiolabelado em vesículas expressando a proteína alvo e calcule a cinética Michaelis-Menten usando um método de regressão não linear.Para os experimentos de competição, adicione o substrato competitivo não rotulado feito no tampão de ensaio ao tubo de centrífuga contendo 100 microliters de vesículas a 12 graus Celsius, adicionando simultaneamente 50 micromolar da poliamina radiolabelada. Meça a radioatividade presa dentro das vesículas como descrito anteriormente. Determine um KM pai para os substratos competitivos medindo a absorção de poliaminas radiolabeladas e a presença de 100 micromolar ou substrato não rotulado e use um método de regressão não linear para traçar a curva.Neste estudo, um anti-porter é caracterizado por primeiro expressar a proteína em E.coli e, em seguida, gerar vesículas de membrana para que a proteína heterologosamente expressa possa ser avaliada em um sistema livre de células. Uma mancha ocidental é usada para verificar se o AtBAT1 é translocado para vesícula. Sondar a mancha com um anticorpo anti-seu terminal C revelou uma proteína de construção de fusão que é aproximadamente 72,3 kilodaltons.A digestão das vesículas anteriores ao SDS-PAGE resultou em uma diminuição, mas não uma perda completa do sinal da sonda. A 12 graus Celsius, tomar uma espermidina radiolabeled pelas vesículas é mais alta em um minuto e permaneceu linear durante três minutos. Portanto, o tempo de incubação do ensaio de transporte é fixado em um minuto.Após um minuto, não há absorção líquida de isótopo por vesículas de membrana que foram preparadas e armazenadas em pH 8.0, pois não há gradiente de prótons através da membrana vesícula. Para demonstrar o efeito da dissipação do gradiente artificial de prótons, as vesículas de membrana são incubadas em tampão pH 8.0 por 10 minutos antes da adição de substrato rotulado, levando a uma absorção mínima de substrato radiolabeled. Juntos, esses resultados indicam que a absorção de espermidina impulsionada por prótons deve-se à proteína BAT1.Para determinar a especificidade do substrato da proteína, os valores km são calculados medindo a absorção de substrato radiolabeled em diferentes concentrações. Os valores km para espermidina, putrescina e arginina indicam que essa proteína é um trocador de poliamina e arginina de alta afinidade. A afinidade do transportador para um determinado substrato também pode ser determinada indiretamente usando ensaios de concorrência.Estes ensaios revelam que o GABA é um inibidor competitivo da espermidina. Além disso, medir a absorção de 50 micromolar de espermidina radiolabeled na presença de concentrações variadas de diferentes aminoácidos revela que o AtBAT1 também é capaz de transportar glutamato e alanina em concentrações mililameadas. Ao realizar este procedimento, a integração do transportador de membrana na membrana bacteriana é, obviamente, crítica.A verificação de que a proteína de interesse é integrada à membrana pode ser feita usando anticorpos direcionados contra as etiquetas terminais C. A variação genética dos transportadores humanos pode afetar o transporte de, tanto metabólicos quanto de drogas que são substratos do transportador particular. Assim, a variação allelic pode afetar, tanto, a absorção e a excreção de drogas.Muitas variantes allelic podem ser rapidamente feitas por mutagênese direcionada lateral do gene transportador em um vetor de expressão. Ensaios funcionais dessas variantes podem então ser testados em condições muito controladas usando ensaios de vesícula de dentro para fora. Os transportadores de membrana constituem de 8 a 10 de todas as proteínas e a maioria não foi caracterizada completamente em nenhum dos organismos modelo.Transportadores localizados a membranas organela são particularmente desafiadores para caracterizar pela expressão heteróloga em células eucarióticas. Se o tipo de troca ou transportadores mediados por prótons podem ser localizados nesta membrana E.coli, esses transportadores podem ser caracterizados funcionalmente usando este ensaio in vitro. A qualidade e o rendimento das vesículas são afetados pela taxa de eluição de fragmentos celulares da imprensa francesa.Ao fazer ensaios de transporte de vesículas com isótopos, é importante ter uma configuração experimental que facilite a realização de réplicas experimentais. Há muitas maneiras de fazer isso, mas achamos que será útil para nós mostrar como fizemos isso.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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