Processamento de embriões, casca de ovo e cultura fúngica para microscopia eletrônica de varredura

Temos protocolos padronizados de preparação de amostras para embriões de tartarugas pintadas por imagem, cascas de ovos rígidas e culturas fúngicas usando microscopia eletrônica de varredura. Esses métodos abrangentes usam alterações sutis em protocolos conhecidos para processar três tecidos delicados permitindo a diferenciação entre estruturas originais e processamento dos artefatos. Demonstrando o procedimento comigo estará Jessica Gibbons, uma estudante de pós-graduação do meu laboratório.

Antes de coletar ovos de tartaruga de um campo durante a temporada de desova, faça quatro a seis buracos de 0,25 centímetros ao longo das laterais das caixas de plástico e em suas tampas para permitir a aeração. Antes de encher as caixas com uma mistura úmida de vermiculite e mistura de musgo de turfa em uma proporção de um para um. No local do ninho, remova suavemente o solo para descobrir os ovos e limpe a superfície de cada ovo de tartaruga com uma tintura de iodo diluída para proteger contra contaminação microbiana durante a incubação.

Coloque no máximo oito a nove ovos por caixa na mesma orientação e alinhamento que foram colocados, mantendo as embreagens individuais separadas umas das outras. Quando todos os ovos tiverem sido coletados, enterre manualmente os ovos metade na cama e coloque as caixas tampadas dentro de uma incubadora de 30 graus Celsius por 10 a 17 dias para obter estágios embrionários 12, 13 e 18 embriões, respectivamente. Adicione água destilada para molhar parcialmente o meio de cama a cada dois dias para evitar a desidratação, e para manter o nível de umidade para o desenvolvimento normal de embriões.

No estágio apropriado de desenvolvimento, use tesoura pontiaguda para fazer um corte em um lado da casca de ovo dorsal e membrana de gema juntos, verticalmente ao longo eixo do ovo. Em seguida, corte o outro lado do ovo ao longo do eixo curto, e use fórceps para descascar a peça excisada com o lado do embrião para cima. Corte o outro lado lateral da casca de ovo e coloque o pedaço de casca extirpado em PBS.

Usando um estereómico e fórceps, descasque o embrião e a membrana da gema da casca de ovo. Use as fórceps e micro tesouras para remover as membranas embrionárias extras, e use uma colher de embrião para transferir o embrião para uma placa de Petri de PBS fresco. Depois de lavar qualquer sangue e gema, coloque até três embriões por poço de uma placa de 12 poços, contendo 4% de paraformaldeído a quatro graus Celsius por dois a três dias.

Quando as amostras aparecerem brancas, use pastilhas de poliestireno com fundo de malha de poliéster para enxaguar os embriões com três lavagens de cinco minutos em PBS fresco por lavagem. Após a última lavagem, desidrate as amostras em uma série ascendente de etanol por uma hora por concentração. Após a segunda imersão do etanol, seque os embriões em uma série de HMDS para concentrações de etanol por 20 minutos por imersão com as placas de Petri parcialmente cobertas.

Em seguida, coloque os embriões em uma solução final 100% HMDS, completamente ou parcialmente coberta por um capô de fumaça durante a noite. A secagem lenta aumentando gradualmente a concentração de HDMS para etanol é importante para revelar uma excelente estrutura superficial nos embriões. Na manhã seguinte, use fita condutora de carbono de vara dupla para montar cuidadosamente as amostras completamente secas em um pino de alumínio padrão.

Quando todas as amostras tiverem sido montadas, introduza as amostras na câmara do espaçador para revestir os espécimes com uma película muito fina de ouro por 60 a 120 segundos em um sputter de 35 miliamperes. Em seguida, aperte com segurança os parafusos do conjunto para montar os stubs nas placas de derramamento correspondentes. Use a ferramenta de troca de amostras para transferir o suporte de amostra para a câmara amostral do microscópio eletrônico de varredura para imagem.

Para preparar cascas de ovos para a microscopia eletrônica de varredura, coloque as cascas de ovos em água destilada por pelo menos uma hora após a colheita do embrião para eliminar qualquer contaminação de gema ou albumina. Em seguida, seque as cascas de ovos limpas em delicados lenços antiestáticos no capô da fumaça durante a noite. Armazene as cascas de ovos secos em garrafas de espécimes limpas, rotuladas por número e estágio de embrião.

Em seguida, monte, casaco de sputter e imagem os espécimes de casca de ovo como apenas demonstrado para os embriões. Para estabelecer culturas fúngicas de slides, use um bisturi estéril para cortar blocos de meio a três quartos de polegada de ágar de dextrose de batata sólida, e coloque os blocos em slides de microscópio de vidro individuais. Coloque palitos estéreis no fundo de pratos de Petri limpos para levantar slides deles para criar tensão superficial entre a placa e o escorregador.

Coloque cada lâmina nos palitos de dente na placa de Petri. Em seguida, use um laço estéril para transferir fungos do inóculo do espécime para cada um dos quatro lados laterais de um bloco de ágar. Adicione algumas gotas de água destilada estéril à placa de Petri ao redor do escorregador para garantir a umidade para os fungos em crescimento.

Sele parcialmente a placa com filme de parafina e coloque a placa na incubadora de 30 graus Celsius para o período de incubação adequado para as espécies fúngicas. No final da incubação, remova o slide da placa de Petri e use fórceps estéreis para transferir o bloco de ágar firmemente aderido do slide para um recipiente de 3% glutaraldeído para uma incubação durante a noite a quatro graus Celsius. Na manhã seguinte, desidrate as amostras em uma série ascendente de etanol por 15 minutos por concentração.

Após a imersão de 90%, processe as amostras para desidratação final com duas alterações de 30 minutos em 100% de etanol para garantir uma saturação completa antes de colocar as amostras desidratadas na câmara do aparelho de secagem de ponto crítico. Sele a câmara e abra as válvulas para permitir que o dióxido de carbono líquido venta e deixe o etanol ventilar até que o dióxido de carbono líquido encha completamente a câmara. Em seguida, veda e aqueça lentamente a câmara para alcançar um ponto crítico quando a pressão da câmara excede 1.000 libras de pressão por polegada quadrada, a temperatura excede 31 graus Celsius, e o espaço líquido e gasoso de dióxido de carbono está em equilíbrio.

Em seguida, drene lentamente o dióxido de carbono da câmara e da amostra como um gás, para evitar quaisquer efeitos da tensão superficial na amostra, e montar, placa e imagem os espécimes fúngicos como demonstrado. Uma visão de micrografia eletrônica de varredura lateral de um embrião de tartaruga pintado estágio 12 revela como a proeminência maxilar se estende além do mandibular e medialmente limita um poço nasal bem marcado. Cinco arcos faringeais também podem ser observados.

Em um embrião estágio 15, os somites recém-formados são visíveis na região posterior da cauda do embrião, e os botões dianteiros apontam mais cortally do que ventrally. Um crescimento bem definido de uma cordilheira de carapaça também pode ser visualizado ao longo de toda a região do flanco interlimb do embrião. Na fase 18, um focinho de projeção desobatada se formou com um bico inferior ligeiramente virado com um gancho terminal que se encaixa no entalhe central do bico superior.

A mandíbula superior exibe uma aparência entalhada, e um pequeno dente de ovo pode ser visto se formando na ponta da mandíbula superior. A análise ultraestrutural da casca de ovo de Crisemys picta e da membrana da casca da casca de elétrons, revela uma camada externa de casca de ovo calcarinus, firmemente ligada à membrana da casca de fisomosomia interna. A superfície externa da casca de ovo consiste em unidades de conchas mineralizadas bem distintas feitas de nódulos esféricos globulares dispostos em grupos e entre unidades de conchas adjacentes, com uma concentração de pequenas depressões arredondadas ou poros de vários tamanhos.

As metodologias comuns não podem ser generalizadas para que todos os espécimes biológicos alcancem uma qualidade de imagem decente usando SEM. Alterações únicas como demonstrado são essenciais para um tipo específico de tecido. O método de secagem química e de ar também poderia ser usado para outras amostras orgânicas, e a técnica de cultura de slides de acoplamento poderia ser usada para todas as culturas microbianas macias e robustas.