Name: Design, síntese e propriedades fotoquímicas de compostos de Caged clicáveis (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Aprenda a sintetizar compostos de caged clicáveis com propriedades fotoquímicas para aplicações em neurociência e biologia celular. Este método prático permite adicionar solubilidade e capacidade de direcionamento celular sem comprometer a fotossensibilidade.

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Este trabalho foi apoiado pelo JSPS KAKENHI Grant Number JP16H01282 (TF), um Grant-in-Aid para pesquisa científica em áreas inovadoras "dinamismo da memória", e JP19H05778 (TF), "MolMovies".

1. síntese do grupo de enjaulamento modular pabhc para compostos Caged clicáveis28,41
<ol><li>
Preparação de (6-Bromo-7-hidroxicoumarin-4-YL) cloreto de metilo (BHC-CH2CL)
	<ol>
<li>Coloque 4-bromoresorcinol (9,742 g, 51,5 mmol) em um balão de fundo redondo de 100 mL equipado com uma barra de agitador.</li>
		<li>Adicionar conc. H2so4 (98%, 30 ml) ao balão e agitar a mistura para dissolver.</li>
		<li>Adicionar etil 4-cloracetoacetato (10 mL, 74 mmol) Dropwise.</li>
		<li>Continuar mexendo a mistura à temperatura ambiente durante 5 dias.</li>
		<li>Separadamente, Coloque cubos de gelo esmagados (~ 200 mL) num balão de 500 mL de Erlenmeyer.</li>
		<li>Despeje a mistura de reação no gelo e mexa vigorosamente durante 30 min até que um precipitado finamente em pó seja obtido.</li>
		<li>Colete o precipitado através de filtração a vácuo. Lave o precipitado castanho claro com água cinco vezes.</li>
		<li>Seque o precipitado vácuo durante a noite para produzir BhcCH2CL como um pó castanho claro (13,57 g, 46,9 mmol).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação de (6-Bromo-7-hydroxycoumarin-4-YL) metanol (BhcCH2Oh)
	<ol>
<li>Coloque o BhcCH2CL preparado (1,1440 g, 3,95 mmol) e 1 M HCl (300 ml) em um balão de fundo redondo de 1 L equipado com um condensador Dimroth. Agitar a mistura a 140 ° c durante 5 dias. Após este tempo, arrefecer a mistura à temperatura ambiente.</li>
		<li>Retire a água da reacção por evaporação rotativa vácuo para produzir BhcCH2Oh (1) como um pó castanho claro (1, 359 g, 3,82 mmol, 97% rendimento). Nota: o uso de 250 mL de HCl de 1 M por 1 g de BhcCH2CL dá um resultado satisfatório.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação de paBhcCH2Oh (2) através da reação de Mannich
	<ol>
<li>Coloque paraformaldeído (446,4 mg, 14,9 mmol) num balão de fundo redondo de 50 mL. Adicionar etanol anidro (5 mL) e N-metilpropargylamina (1,25 ml, 14,8 mmol) ao balão.</li>
		<li>Mexa a mistura à temperatura ambiente durante 1 h uma atmosfera de ar.</li>
		<li>Adicionar BhcCH2Oh (1) (1,367 g, 5, 4 mmol) ao balão. Aqueça a mistura a 80 ° c com um aparelho de aquecedor de blocos e continue mexendo a mistura a 80 ° c durante 2 h uma atmosfera de ar.</li>
		<li>Pare o aquecedor do bloco e resfrie a mistura de reação à temperatura ambiente.</li>
		<li>Colete o precipitado castanho-amarelo claro resultante por filtração a vácuo. Lave o precipitado duas vezes com uma pequena quantidade de etanol anidro (1 mL cada vez).</li>
		<li>Retire o excesso de etanol vácuo para produzir paBhcCH2Oh (2) (1,393 g, 3,96 mmol).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparação de compostos de Caged clicáveis
Nota: os seguintes procedimentos podem ser aplicados à preparação de outros compostos Caged clicáveis que contêm grupos funcionais do hydroxyl, do amino, e do carboxilato.
<ol><li>
Procedimento geral 1: preparação de uma amina Caged clicável
	<ol>
<li>Coloque paBhcCH2Oh (2) (709,6 mg, 2, 2 mmol) e n,n '-carbonilo diimidazol (CDI, 397,6 mg, 2,45 mmol) em um balão de fundo redondo de 30 ml. Adicionar CH2CL2 (6 ml) e agitar a solução à temperatura ambiente durante 1 h.</li>
		<li>Adicionar 4-dimethylaminopyridine (4-DMAP, 324,8 mg, 2,66 mmol) e tert-butil (6-aminohexyl) carbamato (533,1 mg, 2,46 mmol). Agitar a solução à temperatura ambiente durante 3 h.</li>
		<li>Retire o solvente e outros materiais voláteis utilizando um evaporador rotativo vácuo. Purify o resíduo diretamente usando a cromatografia da coluna do flash do gel de silicone.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Procedimento geral 2: preparação de um álcool enjaulado clicável
	<ol>
<li>Coloque paclitaxel (PTX, 48,7 mg, 0, 57 mmol) num balão de fundo redondo de 30 mL equipado com uma torneira de três vias e um balão ar. Adicionar ch seco2CL2 (1 ml), 4-DMAP (17,1 mg, 0,14 mmol), e 4-Nitrophenyl cloroformato (26,0 mg, 0,13 mmol).</li>
		<li>Mexa a solução em temperatura ambiente para 2,5 h uma atmosfera ar.</li>
		<li>Adicionar 4-DMAP (15,7 mg, 0,13 mmol) e paBhcCH2Oh (2) (39,1 mg, 0,111 mmol) para a solução. Continuar mexendo a mistura à temperatura ambiente durante 17 h.</li>
		<li>Adicionar CHCl3 (10 ml) e 15% aquosa NaHCO3 (5 ml) para a mistura. Agitar a mistura vigorosamente durante aproximadamente 3 min. Retire a camada aquosa com uma pipeta.</li>
		<li>Adicionar 0,5 M de ácido cítrico (5 mL) ao frasco contendo a camada orgânica. Mexa a mistura e retire a camada aquosa como acima.</li>
		<li>Separe a camada orgânica usando uma coluna de separação de fase. Retire os solventes com um evaporador rotativo vácuo. Purify o produto usando a cromatografia de coluna do flash do gel de silicone padrão.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Procedimento geral 3: preparação de um ácido carboxílico Caged clicável
	<ol>
<li>Dissolva o ácido aracidônico (33,0 μL, 0,100 mmol), paBhcCH2Oh (2) (39,6 mg, 0,112 mmol) e 4-DMAP (14,1 mg, 0,115 mmol) em ch seco2CL2 (2 ml). Adicionar n,n ʹ-diisopropylcarbodiimide (Dipc, 17,0 μl, 0,110 mmol) e agitar a solução à temperatura ambiente durante 140 min.</li>
		<li>Retire o solvente vácuo. Purify o resíduo diretamente usando a cromatografia da coluna do flash do gel de silicone.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. instalação de uma unidade funcional nos compostos Caged clicáveis
<ol><li>Dissolva o sulfato de cobre (II) pentahidratado (249 mg) em água trocada de íon (IEW, 10 mL) para dar uma solução de 0,1 M CuSO4 .</li>
	<li>Dissolver 2 ʹ-paBhcmoc-PTX (8,0 mg, 6,5 μmol), Tris (3-hidroxipropyltriazolylmethyl) Amine (THPTA, 17,5 mg, 40,3 μmol), l-ascorbato de sódio (162,4 MGS, 0,825 mmol), e 15-chloro-3, 6, 9-trioxapentadecyl azida (3,1 MGS, 11 μmol) em um solvente misturado de 0,1 M fosfato tampão (2,5 mL, pH 7,2) e sulfóxido de dimetil (DMSO, 0,5 mL).</li>
	<li>Adicione a solução de 0,1 M CuSO4 (81,2 μL, 8,1 μmol) à mistura de reacção. Mexa a mistura à temperatura ambiente durante 80 min. Monitore o progresso da reação usando a cromatografia líquida de capacidade elevada (HPLC).</li>
	<li>Dissolva os precipitados adicionando uma solução de acetonitrila/água de 75% (3,5 mL). Aplique a solução resultante diretamente ao sistema semi-preparative da HPLC para purificar o produto desejado. Nota: a solubilização da mistura de reacção pela adição de tert-butanol pode acelerar a progressão da reacção.</li>
</ol>4. reação uncaging photolytic dos compostos Caged
<ol><li>Preparação das soluções de ações
	<ol>
<li>Dissolva o composto Caged desejado (5 μmol) no DMSO (500 μL) para preparar uma solução de estoque de 10 mM. Dispense uma alíquota de cada solução (10 μL) num tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e guarde-a num congelador (− 20 ° c) até um pouco antes da utilização.</li>
		<li>6 mm K3[Fe (C2O4)3] (100 ml): dissolver O ferrioxalato de potássio recristalizado (0,295 g, 0,675 mmol) em 80 ml de água. Adicionar 0,5 M H2so4 (10 ml) e uma quantidade apropriada de iew para compensar o volume para 100 ml. Nota: o ferrioxalato de potássio deve ser purificado através de recristalização a partir de água quente e armazenado no escuro. O ferrioxalato de potássio recrystallized é obtido como o trihidrato; Portanto, sua fórmula é K3[Fe (C2o4)3] · 3h2o e um peso de fórmula de 491,24 deve ser considerado durante a preparação da solução de estoque. Verifique a pureza da solução de 6 mM medindo a sua absorção a 510 nm. Se a absorvência é < 0.02, é apropriado para o uso no experimento.</li>
		<li>0,1% tampão-Phen (30 mL): dissolver NaOAc · 3H2O (7,35 g), 1, 10-phenanthroline (Phen) · H2O (30 MGS), e conc. h2assim4 (0,9 ml) em iew (20 ml). Adicione IEW para compensar o volume para 30 mL. Nota: a solução contém 1,8 M NaOAc, 0,54 M H2so4e 0,1% 1, 10-phenanthroline.</li>
	</ol></li>
	<li>Medição do número de fótons utilizando actinometria de ferrioxalato
	<ol>
<li>Coloque 6 mM K3[Fe (C2O4)3] (V1 L) em uma cubeta de quartzo. Irradiar a solução com 350 nm de luz para 5 s.</li>
		<li>Transfira a solução irradiada a uma cubeta de Pyrex com um comprimento do trajeto de l [cm].</li>
		<li>Adicionar 0,1% tampão-Phen (V2 L) à solução de amostra irradiada e misturar bem com pipetagem. Medir a absorvância da amostra em 510 nm. Calcule a variação média de absorção por unidade de tempo (ΔA510 [s− 1]).</li>
		<li>Calcule o número de moles gerados FE2 + íons por unidade de tempo de acordo com a seguinte equação: NFE2 + [mol s− 1] = ((v1 + v2) [l] × ΔA510 [s− 1])/(l [cm] × ε510 [l mol− 1 cm− 1]), onde (v1 + v2) é o volume da amostra para a medição de absorção, l é o comprimento do trajeto óptico da cubeta, e ε510 é a absortividade molar do FE2 +- complexo de Phen em 510 nanômetro. Nota: nas condições experimentais típicas, os valores de v1 = 2,0 × 10− 3 l, v2 = 0,33 × 10− 3 l, l = 1,0 cm e ε510 = 1,1 × 104 l mol− 1 foram utilizados cm− 1 .</li>
		<li>Calcule o número de moles de fótons que atingem a amostra (I0) usando a seguinte fórmula: I0 [Einstein cm− 2 s− 1] = NFE2 +/Φ350 onde Φ 350 é a eficiência quântica da fotorredução do ferrioxalate em 350 nm. Nota: embora a eficiência quântica do actinômetro de ferrioxalato de potássio em 350 nm não seja relatada, o valor relatado de 1,2542 a 358 nm foi empregado.</li>
	</ol></li>
	<li>Medições de eficiência quântica a 350 nm
	<ol>
<li>Diluir a solução de amostra (DMSO, 10 μL) com tampão K-MOPS (pH 7,2, 10 mL) para dar uma solução de 10 μM em K-MOPS contendo 0,1% DMSO. Nota: o tampão de K-MOPS consistiu no KCl de 100 milímetros e no ácido propanesulfonic de 10 milímetros 3-(N-morpholino) (MOPS) titulado ao pH 7,2 com Koh.</li>
		<li>Transfira uma alíquota da solução (V1 L) para a mesma cubeta usada na leva do actinometer químico. Irradiar a solução de exemplo usando a mesma configuração descrita na etapa 4.2.1.</li>
		<li>Retire uma alíquota (50 μL) da solução irradiada periodicamente e analise o uso de HPLC.</li>
		<li>Determine o tempo de irradiação, em segundos, em que 90% do material inicial reagiu (t90%) por parcelas de encaixe do desaparecimento dependente do tempo do material de partida. Nota: a absorvância da amostra irradiada deve ser mantida a < 0,1 para que a filtração interna da radiação possa ser ignorada. É desejável que o consumo fotolítico do material de partida possa ser aproximado por decaimento único-exponencial para que não haja efeito secundário indesejado que interfere no processo de fotolise.</li>
		<li>Calcule o rendimento quântico do desaparecimento (Φdis) usando a seguinte equação28: Φdis = 1/(t90% × I0 × σ350) onde t90% [s] é o tempo de irradiação em que 90% do material de partida foi consumido , I0 [Einstein cm− 2 s− 1] é o número de moles de fótons, e σ350 [cm 2 mol− 1] é o coeficiente de extinção Decádico da amostra em 350 nm. Nota: σ350 [cm2 mol− 1] = 103ε350 [M− 1 cm− 1].</li>
	</ol></li>
</ol>5. segmentação de um composto de Caged clicável com um ligante halotag
Nota: antes da utilização, manter as células HeLa no meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, glicose baixa, piruvato de sódio, l-glutamina) suplementado com soro bovino fetal a 10% (FBS) contendo 1% de antibióticos (sulfato de estreptomicina, penicilina G e anfotericina) em 37 ° c e 5% CO2.
<ol><li>Remova o meio e Trypsinize as pilhas tratando com o ácido do trypsin-ethylenediaminetetraacético (EDTA, 1 mL) em 37 ° c por 1 minuto. Adicionar DMEM (4 mL) às células e re-suspender as células por pipetagem suavemente. Semente aproximadamente 5 × 105 pilhas por o prato em pratos inferiores de vidro de 35 milímetros em DMEM (2 ml) 24 h antes do transfection.</li>
	<li>Para quatro pratos, em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, diluir o DNA plasmídeo (pcDNA3-Halo-EGFR, 14 μg) no meio sérico reduzido (700 μL). Separadamente, diluir o reagente de lipofecção (5 μL) no meio sérico reduzido (150 μL) em cada um dos quatro tubos e permitir-lhes estar à temperatura ambiente durante 5 min.</li>
	<li>Adicione uma porção do DNA plasmídeo diluído (150 μL) a cada uma das amostras de reagente de lipofecção diluídas. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min.</li>
	<li>Depois de manter as células a 37 ° c e 5% CO2 para 24 h, aspirar o DMEM e enxaguar as células com tampão fosfato salina (PBS, 2 ml). Adicione o meio sérico reduzido (1,5 mL).</li>
	<li>Adicione o complexo do reagente do plasmídeo-lipofection (150 μL) a cada prato. Manter as células a 37 ° c e 5% CO2 para 48 h.</li>
	<li>Aspirar o meio, adicionar uma porção de DMEM recém-preparados (1 mL) contendo 2 μM de paBhc-hex-FITC/Halo, e incubar as células a 37 ° c e 5% CO2 por 30 min.</li>
	<li>Aspirar o meio contendo o composto enjaulado e enxaguar as células duas vezes com PBS + (1 mL por enxaguamento) para remover quaisquer compostos não acoplados. Adicione o meio sérico reduzido (500 μL) e incubar as células a 37 ° c e 5% CO2 por 30 min para remover os compostos que entraram nas células. Nota: o PBS + é soro fisiológico com tampão fosfato suplementado com 2 mM de CaCl2 e 1 mm MgCl2.</li>
	<li>Retire o meio e enxague as células duas vezes com PBS + (1 mL). Adicione uma porção de um meio (1 mL) que não contenha fenol vermelho. Grave imagens de fluorescência por microscopia de fluorescência confocal de varredura a laser.</li>
</ol>6. modulação fotomediada de uma localização da quinase usando um composto Caged clicável
Nota: antes da utilização, manter as células CHO-K1 no meio do presunto F-12 suplementado com 10% FBS a 37 ° c e 5% CO2.
<ol><li>Prepare uma solução de trabalho de 100 × (1 mM) de paBhc-AA (5) em DMSO. Nota: uma solução conservada em estoque de 10 milímetros do composto é preparada e armazenada em um congelador (-20 ° c).</li>
	<li>Semente aproximadamente 5 × 105 pilhas por o prato em pratos inferiores de vidro de 35 milímetros em DMEM (2 ml) 24 h antes do transfection.</li>
	<li>Transfect CHO-K1 células com uma codificação plasmídeo para GFP-DGKγ 48 h antes dos experimentos uncaging. Nota: a transfecção é realizada de acordo com as etapas 5.2 – 5.5.</li>
	<li>Substitua o meio por um meio sérico reduzido (2 mL). Adicionar a solução de trabalho 100 × paBhc-AA (20 μL) e incubar as células a 37 ° c e 5% CO2 para entre 5 min e 1 h. Nota: o tempo de carregamento depende do composto empregado.</li>
	<li>Coloque as células na fase objetiva de um microscópio fluorescente invertido equipado com um iluminador de fluorescência de fonte de luz dupla.</li>
	<li>Tome uma imagem fluorescente cada 10 s. irradie as pilhas com a luz 330-385 nanômetro através de um objetivo do microscópio para um momento apropriado. Alternativamente, irradiar as células com luz de 405 nm usando uma lâmpada xe através de fibras de quartzo flexíveis.</li>
	<li>Continue a gravar imagens fluorescentes por 10 min.</li>
</ol>

Não temos nada a revelar.

Nós desenvolvemos previamente os compostos Caged de BHC de várias moléculas biologicamente ativas que exibem eficiências fotolítica elevadas28,45,46,47. Com o objetivo de ampliar o repertório de grupos de enjaulamento BHC, também foram relatadas plataformas de compostos modulares com Caged que podem ser facilmente modificados pela introdução de várias unidades funcionais32,40,41. O presente protocolo, portanto, representa um método para a síntese de um precursor clicável de grupos de enjaulamento BHC que podem ser modificados através da ciclização de huisgen de cobre (I) catalisada. A síntese do precursor clicável, paBhcCH2Oh (2), foi alcançada através de uma sequência de reação de quatro etapas a partir do 4-bromoresorcinol disponível comercialmente (Figura 1a). A vantagem do presente protocolo é que não são necessárias etapas de purificação laboriosas (por exemplo, separações cromatográficas de coluna).
Como precursor clicável paBhcCH2Oh (2) pode ser usado para mascarar vários grupos funcionais, compostos Caged clicáveis de aminas, álcoois e ácidos carboxílicos foram sintetizados usando 2 como o precursor (Figura 1b). As aminas foram modificadas como seus carbamatos enquanto os álcoois foram modificados como seus carbonatos. Nos procedimentos gerais 1 e 2, o CDI foi utilizado para a preparação de carbamatos clicáveis, enquanto o cloroformato 4-nitrofenil foi utilizado para a preparação de carbonatos. Como indicado pelo mecanismo de reação, ambos os reagentes podem ser utilizados para a preparação de carbamatos e carbonatos. Deve-se notar também que o rendimento do composto Caged desejado depende da estrutura química da molécula a ser enjaulada. Outros exemplos podem ser vistos em nossos relatórios anteriores28,30,33,48.
A modificação do clique foi executada então usando uma modificação ligeira do procedimento relatado49. A adição de tris (triazolylmethyl) amina-baseou ligantes é necessário para obter os produtos desejados em bons aos rendimentos elevados. Uma vez que uma variedade de azidas estão prontamente disponíveis tanto de fontes comerciais e de procedimentos de literatura, podemos preparar vários compostos de Caged modulares com propriedades adicionais, como solubilidade em água e capacidade de segmentação celular (Figura 2).
O rendimento quântico da fotólise foi então medido de acordo com um procedimento relatado28,50. A Figura 3 mostra que o consumo fotolítico de 2 ʹ-GLC-paBhcmoc-PTX e a liberação de PTX foram aproximados por decaimento único-exponencial e aumento, respectivamente, sugerindo não haver filtração interna da radiação ou efeitos secundários indesejados. Foram observados melhores rendimentos quânticos de fotolise (φ) e eficiências de Fotolise (εφ) para os compostos de Caged de pabhc clicáveis em comparação com os compostos previamente notificados de BHC (tabela 1)41, 43. uma vez que as eficiências de fotolise (εφ) de compostos Caged BHC são mais de 100 vezes superiores às dos compostos Caged de 2-nitrobenzilo-tipo48, a melhoria acentuada devido à presença de grupos de enjaulamento de pabhc é claramente uma vantagem para este sistema.
Como um experimento de prova de conceito, uma fração hidrófila foi introduzida em 2 ʹ-pabhcmoc-PTX (4) e um ligante de segmentação celular foi introduzido no composto 3 (Figura 2). A solubilidade em água de 2 ʹ-GLC-paBhcmoc-PTX foi 650 vezes maior que a do PTX-mãe (tabela 1). A segmentação celular seletiva foi conseguida usando um sistema do Tag-Probe, e o pabhcmoc-hex-FITC/halo (8) que carrega o ligante de halotag foi alvejado com sucesso à membrana de pilha de pilhas mamífero cultivadas que expressam a proteína de fusão de halotag/EGFR ( Figura 4). A modulação foto-negociada da localização Subcellular de uma quinase foi conseguida igualmente usando um composto enjaulado clicável 5 (Figura 5).
Em conclusão, demonstramos com sucesso um método para a preparação de plataformas clicáveis para compostos foto-Caged de moléculas biologicamente interessantes que podem ser facilmente modificadas com propriedades adicionais, como solubilidade em água e um celular capacidade de segmentação. Uma vez que o grupo de enjaulamento de pabhc pode ser usado para preparar todas as moléculas com grupos funcionais modificáveis, a aplicação do protocolo atual não é limitada às moléculas descritas nisto. Usando uma plataforma modular, a saber o grupo de enjaulamento de pabhc, os compostos Caged desejados podem facilmente ser preparados, e suas propriedades físicas e químicas podem ser moduladas através da modificação do clique.

Os compostos Caged são moléculas sintéticas projetadas cujas as funções originais são mascaradas temporally por grupos protegendo foto-removíveis covalentemente Unidos. Curiosamente, os compostos Caged de moléculas biologicamente relevantes proporcionam um método indispensável para o controle espaciotemporal da fisiologia celular1,2,3,4,5 ,6. Em 1977, Engels e Schlaeger relataram o éster 2-nitrobenzílico do acampamento como uma membrana permeável e derivado fotolábil do acampamento7. No ano seguinte, Kaplan relatou o éster etílico 1-(2-nitrofenil) de ATP (NPE-ATP) e nomeou este composto "Caged" ATP8. Desde então, uma variedade de grupos de proteção fotoquimicamente removíveis, como 2-nitrobenzyls, p-hidroxifenacyls9, 2-(2-Nitrophenyl) Ethyls10,11, 7-nitroindolin-1-YLS12, 13, e (cumarina-4-YL) os methyls14,15,16 foram usados para a preparação de compostos Caged.
A síntese de compostos Caged com propriedades adicionais desejáveis tais como a permeabilidade da membrana, a solubilidade da água, e a habilidade de segmentação celular seria esperada facilitar aplicações biológicas da pilha. Uma vez que as propriedades físicas e fotoquímicas dessas moléculas dependem principalmente da estrutura química dos grupos de proteção fotoquimicamente removíveis usados para prepará-los, um repertório diversificado de grupos de foto-caging é necessário. Entretanto, a diversidade estrutural de grupos de enjaulamento atualmente disponíveis que exibem eficiências elevadas do fotólise é limitada. Isso pode ser um obstáculo para aumentar o uso de compostos enjaulados.
Para abordar esse problema, o repertório de grupos de foto-caging foi expandido pela modificação química de grupos de proteção fotororemovable existentes ou o projeto de novos cromossomos fotolabile com propriedades fotofísicas e fotoquímicas superiores. Exemplos incluem nitrodibenzofurano (ndbf)17, [3-(4, 5-dimetoxi-2-nitrofenil)- -2-butilo] (dmnpb)18,19, umafotogaiola de 2-nitrobenzilo sensível ao cálcio20,coumarinylmethyls substituídos (DEAC45021 , Deadccm22, 7-azetidinyl-4-methylcoumarin23, e estiril cumarinas24), derivados de cianina (cyet-Pan)25, e derivados de bodipy26,27.
Além, nós desenvolvemos previamente o grupo (de 6-Bromo-7-hydroxycoumarin-4-YL) methyl (BHC) e sintetizamos com sucesso vários compostos Caged dos neurotransmissores28, segundos mensageiros29,30, e oligonucleotídeos31,32,33 exibindo grandes secções transversais de excitação de um e dois fótons. Se as propriedades adicionais podem ser instaladas facilmente nos grupos de enjaulamento sem comprometer sua fotossensibilidade, a seguir o repertório de compostos Caged pode ser expandido34,35,36, 37,38,39. Nós projetamos conseqüentemente os compostos Caged modulares que compreendem três porções, a saber o grupo de BHC como um núcleo foto-responsivo, punhos químicos para a instalação de funcionalidades adicionais, e as moléculas que devem ser mascaradas40, 41.
Assim, este artigo fornece um método prático para a preparação de compostos Caged de moléculas biologicamente relevantes. O presente protocolo descreve métodos para a elaboração de uma plataforma clicável para grupos de foto-caging, a introdução de funcionalidades adicionais para ampliar o repertório de compostos enjaulados, a mensuração de seus físicos e fotoquímicos Propriedades e a segmentação seletiva do tipo de célula de um composto de Caged clicável para um aplicativo celular adicional.

<table><tbody><tr><td>acetonitrila, EP</td><td>Nacalai</td><td>00404-75</td><td></td></tr><tr><td>acetonitrila, super desidratado</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>010-22905</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico, 100X</td><td>Thermo Fisher</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>4-bromoresorcinol</td><td>TCI Chemicals</td><td>B0654</td><td></td></tr><tr><td>N,N'-carbonildiimidazol</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>034-10491</td><td></td></tr> sulfato pentahidratado do <tr>cobre de <td>Kanto</td><td>07278-71</td> do <td>clorofórmio</td> 07278-71<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>, diclorometano de 99.9%</td><td>FUJIFILM Wako</td></tr><tr><td>, desidratado</td><td>Kanto</td><td>11338-05</td><td></td></tr><tr><td>N, N'-Diisopropylcarbodiimide (DIPC)</td> <td>Produtos químicos</td><td>D0254</td><td></td></tr><tr><td>4-dimethylaminopyridine</td><td>TCI produtos químicos</td><td>D1450</td><td></td></tr><tr><td>dimetilsulfóxido, desidratado -super-Kanto</td><td></td> <td>10380-05</td><td></td></tr><tr><td>DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Sigma</td><td>D6046-500ML</td><td></td></tr><tr><td>iluminador de fluorescência de fonte de luz dupla, IX2-RFAW</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (99.5)</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>054-07225</td><td></td></tr><tr><td>Etil 4-Cloroacetoacetato</td><td>TCI Chemicals</td><td>C0911</td><td></td></tr><tr><td>Presunto F-12 com L-Glutamina e Fenol Vermelho</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>087-08335</td><td></td></tr><tr><td>ácido clorídrico</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>087-01076</td><td></td></tr><tr><td>microscópio fluorescente invertido IX-71</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ISOLUTE Separador de Fase, 15 mL</td><td>Biotage</td><td>120-1906-D</td><td></td></tr><tr><td>L-(+)-Ácido Ascórbico Sal de Sódio</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>196-01252</td><td></td></tr><tr><td>microscopia confocal de fluorescência de varredura a laser, FLUOVIEW FV1200 / IX-81</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Reagente de transfecção</td><td>Thermo Fisher</td><td>11668027</td><td>reagente de lipofecção</td></tr><tr><td>3-(N-morfolino) ácido propanossulfônico</td><td>Dojindo</td><td>345-01804</td><td>MOPS</td></tr><tr><td>4-nitrofenilcloroformiato (4-NPC)</td> <td>TCI Chemicals</td><td>C1400</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Medium de soro reduzido, sem vermelho de fenol</td> O meio de <td>soro reduzido de 11058021 Thermo Fisher</td><td></td><td>não contém vermelho de fenol</td></tr><tr><td>1,10-fenantrolina monohidratada</td><td>Nacalai</td><td>26707-02</td><td></td></tr><tr><td>Reator fotoquímico com lâmpadas RPR 350 nm</td><td></td> Trioxalatoferrato de potássio Rayonet <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>FUJIFILM Acetato de sódio</td><td>Wako W01SRM19-5000</td><td></td></tr><tr><td> Trihidrato</td><td>Nacalai</td><td>31115-05</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de Sódio</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>199-05985</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Sulfúrico, 96-98%</td> <td>FUJIFILM Wako</td><td>190-04675</td><td></td></tr><tr><td>Tris (3-hidroxipropiltriazolilmetil) amina (THPTA)</td> <td>ALDRICH</td><td>762342-100MG</td><td></td></tr><tr><td>citrato tri-sódico di-hidratado</td><td>Nacalai</td><td>31404-15</td><td></td></tr><tr><td>Luz de xenônio fonte, MAX-303</td><td>Asahi Spectra</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

design, síntese e propriedades fotoquímicas de compostos de caged clicáveis

Design, Synthesis, and Photochemical Properties of Clickable Caged Compounds

Os compostos Caged permitem a manipulação foto-negociada da fisiologia da pilha com definição armazenamento elevada. No entanto, a limitada diversidade estrutural dos grupos de enjaulamento atualmente disponíveis e as dificuldades na modificação sintética sem sacrificar suas eficiências de fotolise são obstáculos para ampliar o repertório de compostos enjaulados para células ao vivo Aplicativos. Como a modificação química dos grupos de caging foto-tipo cumarina é uma abordagem promissora para a preparação de compostos enjaulados com diversas propriedades físicas e químicas, nós relatamos um método para a síntese de compostos Caged clicáveis que podem ser modificados facilmente com várias unidades funcionais através do cobre (I)-catalisada Huisgen ciclização. A molécula modular da plataforma contem um grupo (de 6-Bromo-7-hydroxycoumarin-4-YL) methyl (BHC) como um grupo foto-caging, que exiba uma eficiência elevada da fotolise comparada àquelas dos 2-nitrobenzyls convencionais. Os procedimentos gerais para a preparação de compostos Caged clicáveis que contêm aminas, álcoois, e carboxilatos são apresentados. As propriedades adicionais tais como a solubilidade da água e a habilidade de segmentação da pilha podem prontamente ser incorporadas em compostos Caged clicáveis. Além disso, as propriedades físicas e fotoquímicas, incluindo a produtividade quântica de fotólise, foram mensuradas e foram encontradas como superiores àquelas dos compostos Caged BHC correspondentes. O protocolo descrito poderia, portanto, ser considerado uma solução potencial para a falta de diversidade estrutural nos compostos de Caged disponíveis.

Os compostos Caged clicáveis de algumas moléculas biologicamente interessantes, incluindo o ácido araquidônico e o paclitaxel, foram sintetizados com sucesso (Figura 1)28,41. Propriedades adicionais, como a solubilidade em água e a capacidade de segmentação celular, foram introduzidas em paBhcmoc-PTX através da ciclização de Huisgen de cobre (I) catalisada (reação "click") (Figura 2). Estes ptxs enjaulados clicáveis foram então photolyzed para produzir seus ptxs do pai em cima da irradiação em 350 nanômetro (Figura 3), e as propriedades físicas e fotoquímica dos compostos Caged clicáveis são resumidas na tabela 1. Os rendimentos quânticos de compostos enjaulados clicáveis 2 ʹ-GLC-paBhcmoc-PTX (φdis 0,14) e pabhc-AA (φdis 0, 83) foram mais do dobro dos compostos convencionais de Caged BHC 2 ʹ-bhcmoc-PTX (φdis 0, 40) e BHC-AA (Φdis 0, 38)43. Além, um solubility de água melhorado foi observado para 2 ʹ-GLC-paBhcmoc-PTX, que contem uma fração da glicose.
Em experimentos de células ao vivo, o direcionamento de paBhc-hex-FITC/Halo para as células de mamíferos cultivadas transientemente expressando uma proteína de fusão de uma proteína HaloTag e receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR) foi conseguido com sucesso. A fluorescência verde da fração fluoresceina de paBhc-hex-FITC/Halo foi observada na membrana celular (Figura 4). A modulação foto-negociada da localização Subcellular de uma quinase foi conseguida usando um composto Caged de paBhc. O translocação do diacilglicerol quinase γ (dgkγ) foi relatado para ser ativado na presença de ácido araquidônico (AA)44. As pilhas de CHO-K1 que expressam transientemente GFP-DGKγ foram tratadas com o AA ou o paBhc-AA (5). A adição de AA causou a modulação da localização subcelular de DGKγ (Figura 5a, B). Alterações semelhantes na localização de DGKγ foram observadas para as células tratadas com paBhc-AA após exposição à luz UV (Figura 5C, D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig01.jpg"> Figura 1: preparação dos compostos Caged clicáveis. A) reagentes e condições: a. etil 4-cloracetoacetato/conc. H2assim4/RT/7 dias/91% rendimento, b. 1 M HCL/refluxo/3 dias/97% rendimento. c. N-methylpropargylamine/HCHO/EtOH, em seguida, adicione (1) e aqueça no refluxo para 17 h/79% rendimento. (B) Sínteses da amina Caged clicável, PTX e ácido araquidônico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig01large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig02.jpg"> Figura 2: instalação de unidades funcionais em compostos de Caged clicáveis. (A) síntese de um PTX Caged hidrossolúvel através da ciclização de huisgen catalisada por cobre (I). (B) estruturas de compostos enjaulados clicáveis que contenham o ligante halotag para segmentação celular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig02large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig03.jpg"> Figura 3: fotólise de 2 ʹ-GLC-paBhcmoc-PTX (6). Amostras (10 μM) em solução de K-MOPS (pH 7,2) foram irradiadas a 350 nm. (A) traços típicos da HPLC para a fotólise de 6 (medido em 254 nanômetro). As amostras foram analisadas no tempo de irradiação especificado. (B) curso de tempo para a fotólise de 6. Círculos azuis mostram o consumo de 6. A linha sólida mostra a curva de mínimos quadrados adequada para um exponencial de decomposição simples para 6. Os quadrados vermelhos mostram o rendimento de PTX. As barras de erro representam o desvio padrão (± SD). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig03large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig04.jpg"> Figura 4: imagens de fluorescência de células de mamíferos cultivadas incubadas com paBhc-hex-FITC/halo (8). As células transfectadas com pcDNA3-Halo-EGFR foram incubadas com uma solução de 2 μM de composto 8 a 37 ° c por 30 min. As imagens foram obtidas após a lavagem repetida com PBS +. Células HEK293T tratadas simuladas (A: imagem de contraste de interferência diferencial (DIC) e imagem D: fluorescência). Células HEK293T (b e e) ecélulas HeLa (c e F) que expressam transientemente Halo-EGFR(b e c: imagens DIC e e e f: imagens de fluorescência ). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig04large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig05.jpg"> Figura 5: imagens de fluorescência após irradiação UV das células CHO-K1 incubadas com ácido araquidônico BHC Caged. As pilhas de CHO-K1 foram transfected com uma proteína de fusão DGKγ-EGFP. (A) uma imagem de fluorescência das células transfectadas. (B) 100 s após a adição de uma solução de 10 μm de ácido aracidônico. (C) as células foram incubadas com uma solução de 10 ΜM de pabhc-AA (5) a 37 ° c por 5 min. (D) 100 s após irradiação UV de 20 s (330 – 385 nm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig05large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Compostos</td>
			<td>λMax (nm)um
</td>
			<td>εMax (M-1 cm-1)b
</td>
			<td>φdisc
</td>
			<td>εφdisd
</td>
			<td>Solubilidade (μM)e
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ptx</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1,0</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 '-bhcmoc-PTX</td>
			<td>340</td>
			<td>10500</td>
			<td>0, 40</td>
			<td>400</td>
			<td>55</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 '-paBhcmoc-PTX</td>
			<td>359</td>
			<td>9300</td>
			<td>0, 59</td>
			<td>670</td>
			<td>8,3</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 '-GLC-Bhcmoc-PTX</td>
			<td>373</td>
			<td>12300</td>
			<td>0,14</td>
			<td>1280</td>
			<td>650</td>
		</tr>
<tr>
<td>BHC-AA</td>
			<td>341</td>
			<td>10800</td>
			<td>0, 38</td>
			<td>390</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>paBhc-AA</td>
			<td>366</td>
			<td>10300</td>
			<td>0, 83</td>
			<td>750</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: propriedades físicas e fotoquímicas dos compostos de Caged clicáveis. a. absorção máxima (nm), b. absortividade molar a λmáx (M− 1 cm− 1), c. Quantum rendimento do desaparecimento dos materiais de partida em 350 nm, d. O produto da absortividade molar e o rendimento quântico do desaparecimento em 350 nm, e. A concentração da solução saturada em K-MOPS (pH 7,2) (μg mL− 1).

Um protocolo para a síntese e a medida das propriedades fotoquímica de compostos Caged modulares com as metades clicáveis é apresentado.

Design, síntese e propriedades fotoquímicas de compostos de Caged clicáveis

Caged compounds enable the photo-mediated manipulation of the cell physiology with high spatiotemporal resolution. However, the limited structural ...

O objetivo geral deste procedimento é fornecer um método prático para a preparação de compostos fotocagados com propriedades adicionais, como solubilidade da água ou capacidade de segmentação celular. Usando um procedimento sintético simples, esta técnica pode ser usada para expandir o laboratório sobre compostos enjaulados e para fazer compostos enjaulados com propriedades adicionais sem comprometer sua fotosensibilidade. Esta síntese pode ser realizada em um laboratório padrão, pois nossos compostos enjaulados clicáveis são estáveis à foto-irradiação quando dissolvidos em solventes orgânicos não nucleofílicos, como diclorometano ou sulfoxida de dimetil.Demonstrando o procedimento com Hirona Sasaki estarão Akinobu Suzuki, um pós-doutor, Hanami Aoki e Rei Watahiki, estudantes de pós-graduação do laboratório. Comece adicionando 709,6 miligramas de metanol paBhc e 397,6 miligramas de n-carbonyldiimidazole em um frasco de fundo redondo de 30 mililitros. Adicione seis mililitros secos de diclorometano ao frasco e mexa a solução à temperatura ambiente por uma hora.No final da incubação, adicione 342,8 miligramas de 4-Dimethylaminopyridina e 552 microliters de tert-butil seis-amino hexyl carbamate, e mexa a solução em temperatura ambiente por mais três horas. Em seguida, use um evaporador rotativo sob vácuo para remover o solvente e outros materiais voláteis, e use cromatografia de coluna flash de gel de sílica para purificar o resíduo diretamente. Para instalar uma unidade funcional no composto da gaiola clicável, dissolva 249 miligramas de cobre dois pentahidratos de sulfato em 10 mililitros de água trocada por íons para dar uma solução de sulfato de cobre molar 0,1.Dissolver oito miligramas de dois paclitaxel mock paBhc prime, 7,5 miligramas de tris (3-hidroxipropyltriazolylme)amine, 162,4 miligramas de sódio-l-ascorbate, e 3,1 miligramas de 15-cloro-3, 6, 9-trioxypentildecil azide em um solvente misto de 2,5 mililitros de 0,1 tampão de fosfato molar e 0,5 mililitros de sulfóxido de dimetil. Em seguida, adicione 81,2 microliters de solução de sulfato de cobre molar 0.1 à mistura de reação e mexa a mistura à temperatura ambiente por 80 minutos, monitorando o progresso da reação com HPLC. No final da reação, resolva os precipitantes com 3,5 mililitros de uma solução de água de nitríl de acetil de 75% e aplique a solução resultante diretamente ao sistema HPLC semi-preparatório para purificar o produto desejado.Para medições de eficiência quântica, sob lâmpadas fluorescentes cobertas com filtro de corte de luz UV, diluir a solução de estoque de amostra em 10 microliters de sulfóxido de dimetila com 10 mililitros de tampão KMOPS. Transfira uma alíquota da solução para o mesmo tubo de ensaio usado na reação fotográfica do actinômetro químico. Irradie a solução amostral com luz de 350 nanômetros por cinco segundos, removendo 50 alíquotas de microliter da solução irradiada periodicamente para análise do HPLC.Em seguida, determine o tempo de irradiação em segundos em que 90% do material inicial reagiu apropriadamente parcelas do desaparecimento dependente do tempo do material inicial. Para o alvo de ligadura HaloTag de um composto enjaulado clicável, colde a população celular-alvo de interesse com um reagente de dissociação celular apropriada e suspenda as células em 2,5 vezes 10 para as quintas células por mililitro de concentração de DMEM. Em seguida, semente aproximadamente 10 a quinta células por prato em pratos de fundo de vidro de 35 mililitros para uma incubação durante a noite a 37 graus celsius e 5% de dióxido de carbono.Na manhã seguinte, diluir 14 microgramas do DNA do PC três halo epidérmico fator de crescimento receptor plasma DNA plasmá-lo em um tubo micro centrífugo de 1,5 mililitro contendo 700 microliters de meio soro reduzido. Em seguida, adicione cinco microliters do reagente de lipofecção em 150 microliters de meio soro reduzido para cada um dos quatro tubos e deixe os tubos ficarem em temperatura ambiente por cinco minutos. No final da incubação, adicione 150 microliters de DNA de plasma diluído a cada uma das amostras de reagente de lipofecção diluída e incubar as amostras à temperatura ambiente por mais cinco minutos.Ao final da incubação, enxágue as células com dois mililitros de PBS por prato e adicione 1,5 mililitros de meio soro reduzido a cada cultura. Adicione 150 microliters do complexo de reagentes lipofectivos plasmídeos a cada prato e devolva as células à incubadora de cultura celular por 48 horas. No final da incubação, aspire os supernacantes e adicione um mililitro de DMEM recém-preparado complementado com dois micromolar paBhc hex fitzi halo para cada prato.Após 30 minutos a 37 graus celsius, aspire o meio contendo o composto enjaulado e enxágue as células duas vezes com um mililitro de PBS mais para remover quaisquer compostos não ligados. Adicione 500 microliters de meio soro reduzido a cada prato e devolva as células à incubadora de cultura celular por mais 30 minutos para remover os compostos que entraram nas células. No final da incubação, enxágue as células duas vezes com um mililitro de PBS mais por prato e adicione um mililitro de médio sem fenol vermelho a cada cultura.Em seguida, registosas de floresnce por meio da microscopia de florescóptero confocal a laser. Para modulação foto-mediada da localização da quinase usando um composto enjaulado clicável, semente aproximadamente cinco vezes 10 para a quinta célula TOC-A-um em dois mililitros de Ham's F12 médio por 35 mililitros de vidro prato inferior. No dia seguinte, transfemine as células com a codificação plasmida para GFP diacylglycerol quinase gamma por 48 horas como apenas demonstrado.Após o término da transfecção, substitua o supernatante de transfecção por dois mililitros de meio soro reduzido. Adicione 20 microliters de 100 vezes paBhcAA solução de trabalho às células para uma incubação de cinco a 60 minutos a 37 graus celsius e 5% de dióxido de carbono. No final da incubação, coloque o prato na etapa objetiva de um microscópio fluorescente invertido equipado com um iluminador de fluorescência de fonte de luz dupla.Imagem as células a cada 10 segundos durante 10 minutos enquanto irradia as células nos pontos de tempo experimentais apropriados e comprimentos de onda de acordo com o protocolo experimental. Usando este método como demonstrado, compostos enjaulados clicáveis de algumas moléculas biologicamente interessantes, incluindo paclitaxel e ácido aracidonico, podem ser sintetizados com sucesso. Propriedades adicionais, como a solubilidade da água e a capacidade de segmentação celular podem ser introduzidas no paclitaxel mock paBhc através da reação de clique de ciclização catalisada de cobre.Estes paclitaxels enjaulados clicáveis podem então ser fotolysed para produzir seus compostos-mãe após a irradiação a 350 nanômetros. As propriedades físicas e fotoquímicas dos compostos enjaulados clicáveis são resumidas na tabela. Em experimentos de células vivas, o alvo do auréola paBhc hex fitzi para células de mamíferos cultivadas transitenariamente expressando uma proteína HaloTagged e receptor de fator de crescimento epidérmico induz um sinal de floresnce verde do fluoresceína moiety PAHBHC hex fitzi halo na membrana celular.Além disso, o tratamento de células CHO-K1 que expressam transitóriamente gcyl gliceol quinase glicerol glicera com ácido aracidonico causa modulação da localização subcelular do glicerol glicerol diacyl glicease gamma. Alterações semelhantes na localização de gama glicerol glicerol diacyl também são observadas em células tratadas paBhc-AA após a exposição à luz UV. Ao realizar os experimentos de caging em soluções aquosas aumentando o meio de cultura, certifique-se de sempre trabalhar sob lâmpada fluorescente com filtro de comprimento de onda curta tampado.Após este procedimento, você pode estudar compostos enjaulados que foram abundantes para uso em experimentos biológicos devido à falta de solubilidade da água, permeabilidade da membrana ou capacidade de segmentação celular.

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