Name: Isolação rápida de macrófagos dorsal do gânglio da raiz (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Aprenda a isolar rapidamente macrófagos de gânglios da raiz dorsal usando dissociação mecânica sem enzimas. Este método eficiente preserva a viabilidade celular superior a 80% para análise por citometria de fluxo em estudos neuroimunológicos.

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O estudo foi apoiado por: Fundação para a educação e pesquisa em anestesia (XY); o departamento de anestesia e assistência perioperatória (XY) da UCSF; e 1R01NS100801-01 (GZ). Este estudo foi apoiado em parte pelo laboratório HDFCCC para a análise de células recurso compartilhado recursos através de uma subvenção da NIH (P30CA082103).

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidado e uso de animais da Universidade da Califórnia em São Francisco e foram conduzidos de acordo com o guia NIH para o cuidado e uso de animais de laboratório.
1. colete DRG lombar de camundongos experimentais
<ol><li>Antes de iniciar o experimento, prepare a solução de trabalho do meio de gradiente de densidade (por exemplo, Percoll) misturando 9 volumes do meio com 1 volume de CA+ +/mg+ +-Free 10x HBSS. Mantenha-o no gelo.</li>
	<li>Anestesie o rato com 2,5% Avertin. Confirme que o animal está totalmente anestesiado pela falta de resposta à pinça da pata traseira. Nota: foram utilizados ratos machos e fêmeas com idades compreendidas entre 6-8 semanas.</li>
	<li>Perfuse o rato transcardially com 10 mL de PBS pre-refrigerado 1x.<ol>
<li>Coloc o rato na posição supina com as quatro patas fixadas com a fita dentro de uma capa química das emanações. Levante a pele abaixo da caixa torácica pelo fórceps, e faça uma pequena incisão com tesouras cirúrgicas para expor o fígado e o diafragma.</li>
		<li>Continue a usar tesouras para cortar o diafragma e a caixa torácica, abra a cavidade pleural para expor o coração batendo.</li>
		<li>Corte rapidamente o Apêndice Atrial direito com tesouras da íris. Uma vez que o sangramento é observado, insira uma agulha de 30 G na extremidade posterior do ventrículo esquerdo e injete lentamente 10 mL de PBS pré-refrigerado 1x para perfuse o animal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realize laminectomia dorsal15 no rato colocado na posição prona. Nota: se a cultura da célula for planejada, pulverize o mouse com 70% de etanol antes da incisão e use instrumentos cirúrgicos pré-esterilizados para dissecção.<ol>
<li>Use um bisturi de tamanho 11 para fazer uma incisões profundas laterais longitudinais a partir da região torácica até a região sacral. Retire a pele pela tesoura para expor a camada dorsal do músculo.</li>
		<li>Use Friedman-Pearson Rongeur para descascar fora os tecidos e os músculos conexivos até que os processos Lumbosacral da espinha e os processos transversais bilaterais estejam expostos.</li>
		<li>Use uma mola de Noyes Scissor para abrir com cuidado a coluna espinal dorsal, a seguir mude a um Friedman-Pearson Rongeur para remover os ossos vertebrais para expor a medula espinal com os nervos espinais intactos Unidos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cuidadosamente dissecado DRG lombar ipsilateral e contralateral (L4/L5 DRG em nosso estudo) e colocá-lo em 1 mL de CA+ +/mg+ +-livre de gelo-1x HBSS em um homogeneizador de tecido dounce. Agora os tecidos estão prontos para o passo 2. Nota: aparar o nervo espinhal anexado ao DRG, se possível.</li>
</ol>2. isolar células individuais do mouse lombar DRG
<ol><li>Homogeneizar o tecido DRG com um pilão solto no homogeneizador dounce 20-25 vezes.</li>
	<li>Coloque um filtro de célula de nylon estéril de 70 μm em um tubo cônico estéril de 50 mL. Molhe o filtro da pilha com 800 μL do gelo-frio 1x HBSS, e o fluxo-através é coletado no tubo cônico.</li>
	<li>Colete a suspensão do tecido homogeneizado do homogeneizador usando uma pipeta e passe pelo filtro de células de nylon molhado de 70 μm para o tubo cônico de 50 mL.</li>
	<li>Enxague o homogeneizador duas vezes com 800 μL de gelo-frio 1x HBSS e, em seguida, decantar no mesmo tubo cônico 50 mL com filtro de células para aumentar o rendimento.</li>
	<li>Adicionar 1,5 mL de meio de gradiente de densidade isotónica gelado equilibrado (preparado no passo 1,1) num tubo de poliestireno FACS estéril de 5 mL.</li>
	<li>Transfira o homogeneizar da pilha do tubo cônico de 50 mL (na etapa 2,4) no tubo de FACS, misture bem com o meio do inclinação da densidade pipetando acima e para baixo. Adicione um adicional de 500 μL de 1x HBSS para selar a parte superior.</li>
	<li>Pellet as células por centrifugação em 800 x g por 20 min a 4 ° c.</li>
	<li>Aspirar com cuidado o sobrenadante que contem o mielina no meio sem perturbar a pelota da pilha na parte inferior do tubo de FACS.</li>
	<li>Ressuscitem as células no tampão PBS ou FACS contendo 5% de soro bovino fetal (FBS) para análise de FACS. Nota: pelo menos 50.000 a 100.000 células são esperadas de L4/L5 DRG de um rato.<ol>
<li>Ressuscitem as células DRG mecanicamente isoladas (L4/L5) em 100 μL de PBS contendo 5% de soro bovino fetal e, em seguida, incubar com anticorpo α-mouse CX3CR1-APC (1:2000) no escuro a 4 ° c por 1 h.</li>
		<li>Lave as células com 5 mL de PBS uma vez; Centrifugar as células 360 x g durante 8 min a 4 ° c.</li>
		<li>Aspirar o sobrenadante, em seguida, Ressuspender o pellet celular em 300 μL de PBS para análise de FCAS. Se a classificação de célula é planejada, resuspender as células no buffer FACS em vez disso.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Ji, R. R., Chamessian, A., Zhang, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pain+regulation+by+non-neuronal+cells+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pain regulation by non-neuronal cells and inflammation.</a> Science. 354 (6312), 572-577 (2016).</li>
<li>Inoue, K., Tsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+neuropathic+pain%3A+cellular+and+molecular+mechanisms+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential.</a> Nature Reviews Neurosciences. 19 (3), 138-152 (2018).</li>
<li>Hu, P., McLachlan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+functional+types+of+macrophage+in+dorsal+root+ganglia+and+spinal+nerves+proximal+to+sciatic+and+spinal+nerve+transections+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Distinct functional types of macrophage in dorsal root ganglia and spinal nerves proximal to sciatic and spinal nerve transections in the rat.</a> Experimental Neurology. 184 (2), 590-605 (2003).</li>
<li>Simeoli, R., Montague, K., Jones, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomal+cargo+including+microRNA+regulates+sensory+neuron+to+macrophage+communication+after+nerve+trauma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Exosomal cargo including microRNA regulates sensory neuron to macrophage communication after nerve trauma.</a> Nature Communication. 8 (1), 1778(2017).</li>
<li>Cobos, E. J., Nickerson, C. A., Gao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+differences+in+neuropathic+pain+modalities+revealed+by+correlating+behavior+with+global+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Mechanistic differences in neuropathic pain modalities revealed by correlating behavior with global expression profiling.</a> Cell Reports. 22 (5), 1301-1312 (2018).</li>
<li>Zhang, H., Li, Y., de Carvalho-Barbosa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+Root+Ganglion+Infiltration+by+Macrophages+Contributes+to+Paclitaxel+Chemotherapy-Induced+Peripheral+Neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pain%22%5BJournal%5D)">Dorsal Root Ganglion Infiltration by Macrophages Contributes to Paclitaxel Chemotherapy-Induced Peripheral Neuropathy.</a> The Journal of Pain. 17 (7), 775-786 (2016).</li>
<li>Liu, T., van Rooijen, N., Tracey, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+macrophages+reduces+axonal+degeneration+and+hyperalgesia+following+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Depletion of macrophages reduces axonal degeneration and hyperalgesia following nerve injury.</a> Pain. 86 (1-2), 25-32 (2000).</li>
<li>Peng, J., Gu, N., Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+monocytes+synergistically+promote+the+transition+from+acute+to+chronic+pain+after+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Microglia and monocytes synergistically promote the transition from acute to chronic pain after nerve injury.</a> Nature Communication. 7, 12029(2016).</li>
<li>Barclay, J., Clark, A. K., Ganju, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+cysteine+protease+cathepsin+S+in+neuropathic+hyperalgesia%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Role of the cysteine protease cathepsin S in neuropathic hyperalgesia.</a> Pain. 130 (3), 225-234 (2007).</li>
<li>Lim, H., Lee, H., Noh, K., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IKK%2FNF-kappaB-dependent+satellite+glia+activation+induces+spinal+cord+microglia+activation+and+neuropathic+pain+after+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">IKK/NF-kappaB-dependent satellite glia activation induces spinal cord microglia activation and neuropathic pain after nerve injury.</a> Pain. 158 (9), 1666-1677 (2017).</li>
<li>Rutkowski, M. D., Pahl, J. L., Sweitzer, S., van Rooijen, N., DeLeo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limited+role+of+macrophages+in+generation+of+nerve+injury-induced+mechanical+allodynia%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Limited role of macrophages in generation of nerve injury-induced mechanical allodynia.</a> Physiology and Behavior. (3-4), 225-235 (2000).</li>
<li>Kwon, M. J., Shin, H. Y., Cui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCL2+Mediates+Neuron-Macrophage+Interactions+to+Drive+Proregenerative+Macrophage+Activation+Following+Preconditioning+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">CCL2 Mediates Neuron-Macrophage Interactions to Drive Proregenerative Macrophage Activation Following Preconditioning Injury.</a> Journal of Neuroscience. 35 (48), 15934-15947 (2015).</li>
<li>Zigmond, R. E., Echevarria, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+biology+in+the+peripheral+nervous+system+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Macrophage biology in the peripheral nervous system after injury.</a> Progress in Neurobiology. 173, 102-121 (2019).</li>
<li>Ghasemlou, N., Chiu, I. M., Julien, J. P., Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD11b%2BLy6G-+myeloid+cells+mediate+mechanical+inflammatory+pain+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">CD11b+Ly6G- myeloid cells mediate mechanical inflammatory pain hypersensitivity.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 112 (49), E6808-E6817 (2015).</li>
<li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).</li>
<li>Lin, Y. T., Chen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+Root+Ganglia+Isolation+and+Primary+Culture+to+Study+Neurotransmitter+Release%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release.</a> Journal of Visualized Experiment. (140), (2018).</li>
<li>Burnett, S. H., Kershen, E. J., Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+macrophage+ablation+in+transgenic+mice+expressing+a+Fas-based+suicide+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Conditional macrophage ablation in transgenic mice expressing a Fas-based suicide gene.</a> J Leukoc Biol. 75 (4), 612-623 (2004).</li>
<li>Lopes, D. M., Malek, N., Edye, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+peripheral+not+central+immune+responses+to+pain-inducing+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Sex differences in peripheral not central immune responses to pain-inducing injury.</a> Science Reports. 7 (1), 16460(2017).</li>
<li>Kim, Y. S., Anderson, M., Park, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+Activation+of+Primary+Sensory+Neurons+Contributes+to+Chronic+Pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain.</a> Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).</li>
<li>Vicuna, L., Strochlic, D. E., Latremoliere, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serine+protease+inhibitor+SerpinA3N+attenuates+neuropathic+pain+by+inhibiting+T+cell-derived+leukocyte+elastase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">The serine protease inhibitor SerpinA3N attenuates neuropathic pain by inhibiting T cell-derived leukocyte elastase.</a> Nature Medicine. 21 (5), 518-523 (2015).</li>
</ol>

Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes relacionados a este manuscrito.

Aqui nós introduzimos um método novo para enriquecer eficazmente macrófagos isolados do rato DRG. A abordagem convencional para isolar as células imunes do DRG requer digestão enzimática15,16, queagora é substituída por homogeneização mecânica em nosso protocolo para limitar os danos celulares indesejados e aumentar o rendimento. Portanto, o novo protocolo é muito menos demorado. Mais importante, a digestão da enzima pode estimular os macrófagos e alterar a assin...

Há agora uma evidência considerável que as pilhas imunes contribuem à dor neuropática que segue a lesão periférica do nervo1,2. Células monocíticas periféricas, incluindo macrófagos maduros, são conhecidas por responder a lesões teciduais e infecção sistêmica por meio de fagocitose, apresentação de antígeno e liberação de citocinas. Paralelamente à ativação de microglia induzida por lesão nervosa no Corno dorsal espinhal, os macrófagos nos gânglios da raiz dorsal (DRG) também se expandem significativamente após a lesão nervosa3,4. Notavelmente, háinteresses crescentes para determinar se os macrófagos contribuem para o desenvolvimento da dor neuropática após lesão nervosa periférica, interagindo com neurônios sensoriais no DRG5,6,7, 8 . º , 9 anos de , 10 de , 11. Além disso, estudos recentes também implicam a contribuição dos macrófagos DRG no reparo axonal após lesão nervosa12,13. Outro estudo sugere ainda que as subpopulações de macrófago (i.e., CD11b+Ly6CHi e CD11b+Ly6CLow/- Cells) podem desempenhar um papel diferente na hipersensibilidade mecânica14. Conseqüentemente, ràpida fenotipagem a resposta de macrófagos de DRG no contexto da lesão do nervo pode ajudar-nos a identificar os fatores neuroimune que contribuem à dor neuropática.
Convencionalmente, o protocolo para isolar macrófagos no DRG envolve múltiplas etapas, incluindo a digestão enzimática15,16. A técnica é muitas vezes demorada e pode ser dispendiosa para experimentos em grande escala. Embora a digestão suave com colagenase tipo II (4 mg/ml) e Dispase tipo II (4,7 mg/ml) por 20 min foi recomendado anteriormente15, é concebível que as células após a exposição a esta enzima são propensos a danos celulares ou morte celular, o que pode levar a baixa Rendimento. Além disso, a diferença na qualidade das enzimas de lote para lote pode impactar ainda mais a eficiência deste processo. Mais importante, os macrófagos expostos à digestão enzimática podem ser estimulados involuntàvelmente e, portanto, podem ser muito diferentes do status in vivo. As alterações podem potencialmente complicar o desfecho do estudo funcional.
Aqui nós descrevemos um protocolo enzima-livre para isolar ràpida macrófagos de DRG em 4 ° c usando a dissociação mecânica. As amostras são mantidas no gelo para limitar o stress celular. Como resultado, nossa abordagem oferece uma vantagem para manter a consistência do isolamento, e as células isoladas são presumivelmente mais saudáveis e menos estimuladas. Nós apresentamos mais a evidência para validar a qualidade das pilhas isoladas com análise fluorescência-ativada do Cell Sorting (FACS).

<table><tbody><tr><td>AP20187</td><td>Clontech</td><td>635058</td><td></td></tr><tr><td>&#945;-camundongo CX3CR1-APC anticorpo</td><td>Biolegend</td><td>149007</td><td></td></tr><tr><td>Avertin</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células (70 mm nylon)</td> <td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador de tecidos Dounce</td><td>Wheaton</td><td>357538 ( 1ml)</td><td></td></tr> <tr><td>Tubos FACS (5ml)</td> <td>Falcon</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeur</td><td>FST</td><td>16121-14</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (10x, Ca ++ / Mg ++-livre)</td> <td>Gibco</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Noyes Spring Scissor</td><td>FST</td><td>15012-12</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma</td><td>P4937-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Iodeto de propídio</td><td>Sigma</td><td>Pág. 4864-10ml</td><td></td></tr></tbody></table>

isolação rápida de macrófagos dorsal do gânglio da raiz

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

Há interesses crescentes para estudar as interações moleculares e celulares entre as células imunes e os neurônios sensoriais nos gânglios da raiz dorsal após lesão do nervo periférico. Células monocíticas periféricas, incluindo macrófagos, são conhecidas por responder a uma lesão tecidual por meio de fagocitose, apresentação de antígeno e liberação de citocinas. A evidência emergente implicou a contribuição de macrófagos dorsais do gânglio da raiz ao desenvolvimento neuropática da dor e ao reparo axonal no contexto de ferimento do nervo. Rapidamente fenotipagem (ou "isolação rápida de") a resposta de macrófagos dorsais do gânglio da raiz no contexto da lesão de nervo é desejada identificar os fatores neuroimune desconhecidos. Aqui nós demonstramos como nosso laboratório isola ràpida e eficazmente macrófagos dos gânglios da raiz dorsal usando um protocolo mecânico enzima-livre da dissociação. As amostras são mantidas no gelo por toda parte para limitar o stress celular. Este protocolo é muito menos demorado comparado ao protocolo enzimático padrão e foi usado rotineiramente para nossa análise fluorescência-ativada da classificação de pilha.

Para validar as células isoladas, primeiro escolhemos os camundongos transgênicos de apoptose induzida por macrófago (MAFIA)17. Esta linha expressa um fármaco-inducible FK506-Binding proteína (FKBP)-FAS suicídio gene de fusão e proteína verde fluorescente (eGFP) o controle do promotor do receptor CSF1 (CSF1R), que é especificamente expressa em ambos os macrófagos e microglia. A injeção sistemática do dimerizer da proteína de ligação de FK, AP20187 (AP), induz o apoptose das pilhas que expressam o ...

Aqui nós apresentamos um protocolo mecânico da dissociação para isolar ràpida macrófagos do gânglio dorsal da raiz para o fenotipagem e a análise funcional.

Isolação rápida de macrófagos dorsal do gânglio da raiz

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

Evidências emergentes implicaram a contribuição de macrófagos de gânglios de raiz dorsal para o desenvolvimento da dor neuropática e reparação axonal no contexto de lesão nervosa. Rapidamente, a resposta dos macrófagos de gânglios de raiz dorsal é desejada para identificar os fatores neuroimunes desconhecidos. Aqui demonstramos como nosso laboratório isola rapidamente e efetivamente macrófagos da gânglio raiz dorsal usando um protocolo de dissociação mecânica sem enzimas.Este protocolo é muito menos demorado comparado aos protocolos enzimáticos padrão, e nós o usamos rotineiramente para nossa análise de classificação celular ativada por fluorescência. Antes de iniciar o experimento, prepare a solução de trabalho do meio gradiente de densidade misturando nove volumes do meio com um volume de HBSS 10X sem cálcio e magnésio e mantenha-o no gelo. Confirme se o mouse está totalmente anestesiado pela falta de resposta ao aperto da pata traseira.Comece colocando um rato anestesiado dentro de um capô de fumaça química na posição supina com quatro patas presas com fita adesiva. Use fórceps para levantar a pele abaixo da caixa torácica. E então com uma tesoura cirúrgica, faça uma pequena inc

rapid-isolation-of-dorsal-root-ganglion-macrophages

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo demonstra um protocolo livre de enzimas para isolar macrófagos do gânglio da raiz dorsal (DRG) de camundongos usando uma técnica de dissociação mecânica. Após a homogeneização do tecido DRG recém-coletado, anticorpos contra os receptores de superfície celular nos macrófagos são usados para marcar as células fluorescentemente, seguido pela realização de citometria de fluxo para confirmar a presença de macrófagos na amostra.

Isolamento de macrófagos do gânglio da raiz dorsal de camundongos usando dissociação mecânica

Este vídeo demonstra um método para coletar neurônios dos gânglios da raiz dorsal (DRG). O DRG da coluna vertebral de um rato é isolado, tratado com enzimas e, em seguida, dissociado mecanicamente para obter uma suspensão unicelular. Os neurônios são separados das células gliais usando centrifugação com gradiente de densidade e cultivados em um meio de crescimento.

Uma técnica para colher e dissociar gânglios da raiz dorsal para culturas neuronais

Este vídeo demonstra um protocolo para enriquecer culturas neuronais dos gânglios da raiz dorsal por imunopanning, melhorando assim sua pureza e utilidade para pesquisas neurológicas.

Enriquecimento neuronal dos gânglios da raiz dorsal por imunopanning

Este vídeo demonstra uma técnica para isolar e cultivar células dos gânglios da raiz dorsal (DRG) da coluna vertebral de ratos. Os DRGs excisados da coluna vertebral são tratados com enzimas e dissociados mecanicamente para obter uma suspensão unicelular. As células são cultivadas em um meio contendo inibidores e fatores de crescimento que limitam a proliferação de células gliais e promovem o crescimento neuronal, respectivamente.

Estabelecendo uma cultura de células de gânglios da raiz dorsal primária a partir de uma coluna vertebral de rato

Gânglios da raiz dorsal (DRG) são estruturas que contêm os neurónios sensoriais do sistema nervoso periférico. Quando dissociada, podem ser co-cultivadas com células estaminais do tipo SC, derivadas de tecido adiposo (ASC), proporcionando um valioso modelo para estudar a regeneração de nervos em vitro e mielinização, simulando o ambiente in vivo, no local da lesão.

Dorsal Root Ganglia neurônios e células-tronco diferenciadas adiposo-derivados: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-cultura modelo para estudar a regeneração do nervo periférico

Este protocolo descreve o isolamento de neurônios do gânglio da raiz dorsal (DRG) isolados de ratos e a cultura de neurônios DRG em um sistema estático de cultura de células pré-esticadas para melhorar o alinhamento dos axônios, com subsequente co-cultura de células de Schwann (SCs) para promover a mielinização.

Uma abordagem para reforçar Alinhamento e mielinização do gânglio de raiz dorsal neurônios

Aqui, apresentamos um protocolo para extrusão hidráulica da medula espinhal, bem como identificação e isolamento de gânglios da raiz dorsal (DRGs) específicos no mesmo roedor. Comparado aos métodos padrão de isolamento da medula espinhal, esse método é significativamente mais rápido e reduz o risco de danos aos tecidos.

Extrusão hidráulico da medula espinhal e Isolamento de gânglios das raízes dorsais em roedores

Esforços para entender a função microglial no detalhe tem sido prejudicados pela falta de modelos de cultura microglial que recapitular as propriedades de micróglia maduro na vivo . Este protocolo descreve uma abordagem de isolamento e cultura projetada para manter a sobrevivência robusta de rato maduro altamente ramificados microglia sob condições definidas e médias.

Isolamento e cultura de roedor Microglia para promover uma dinâmica ramificada morfologia em meio livre de soro

Culturas primárias do (DRG) os gânglios das raízes dorsais são frequentemente usadas para estudar as funções fisiológicas ou eventos relacionados à patologia em neurônios sensoriais. Aqui, vamos mostrar o uso de culturas DRG lombares para detectar a liberação de neurotransmissores, depois neuropeptídio FF receptor tipo 2 estimulação com um agonista seletivo.

Isolamento de gânglios das raízes dorsais e cultura primária para estudar a liberação de neurotransmissores

As microglias são consideradas algumas das células mais versáteis do organismo, capazes de adaptação morfológica e funcional. Sua heterogeneidade e multifuncionalidade possibilitam a manutenção da homeostase cerebral, além de estarem ligadas a diversas patologias neurológicas. Aqui, uma técnica para purificar a microglia da medula espinhal é descrita.

Enriquecimento rápido e eficiente da microglia medular de camundongos

Os gânglios da raiz dorsal (DRG) contêm corpos celulares primários de neurônios sensoriais e transmitem sinais sensoriais periféricos para a medula espinhal. Este protocolo descreve um método para dissecação por DRG de camundongos que suporta o isolamento padronizado de gânglios estruturalmente intactos, identificação segmentar anatômica, orientação intuitiva para usuários iniciantes e redução de lesão processual no tecido.

Dissecação e isolamento dos gânglios dorsais da raiz do camundongo

Aprenda a isolar rapidamente macrófagos de gânglios da raiz dorsal usando dissociação mecânica sem enzimas. Este método eficiente preserva a viabilidade celular superior a 80% para análise por citometria de fluxo em estudos neuroimunológicos.

Isolação rápida de macrófagos dorsal do gânglio da raiz

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