Name: Um modelo de lesão pulmonar aguda autolimitada por instilação unilateral de ácido intra-brônquico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-30T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 s
Description: Aprenda a criar um modelo autolimitado de lesão pulmonar aguda em camundongos por instilação intra-bronquica unilateral de ácido. Este método reprodutível permite estudar a resolução da inflamação em SARA.

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Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Joseph Mizgerd por suas contribuições para o desenvolvimento do método seletivo intra-brônquico e por seus comentários úteis e revisão do manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelos institutos nacionais de saúde concede P01GM095467 (B.D.L.) e K08HL130540 (R.E.A.).

Todos os procedimentos em animais abaixo foram revisados e aprovados pelo Comitê institucional de cuidado e uso de animais do Brigham and Women ' s Hospital (protocolo #2016N000356).
Nota: A técnica estéril foi seguida para todos os procedimentos da sobrevivência. Um campo estéril foi estabelecido para cada cirurgia usando uma toalha de cortina estéril, enquanto os cirurgiões usavam luvas cirúrgicas estéreis, tampas, máscaras e casacos de laboratório limpos. Todos os instrumentos cirúrgicos foram esterilizados usando uma autoclave, e a esterilidade foi mantida usando um esterilizador de cordão.
1. preparação do HCl 0,1 N
<ol><li>Adicionar 11 mL de ddH2o a uma garrafa de vidro âmbar. Adicione lentamente 1 mL de HCl 37% (12 N) para criar um estoque de trabalho de 1 N HCl. Atenção: Certifique-se HCl é adicionado na água. Esta é uma preocupação de segurança, porque a adição de água diretamente para o ácido pode causar ácido para ferver e espirrar para fora da garrafa. Ao manusear HCl concentrado, certifique-se de que o ácido é mantido em uma capa química exalada e o equipamento de proteção pessoal apropriado é usado, incluindo jaleco, luvas e óculos de segurança.</li>
	<li>Adicione lentamente 4 mL do estoque de trabalho previamente diluído do HCl em 35 mL de ddH2o em um tubo cônico de 50 ml para criar um estoque experimental do hcl de 0,1 N.</li>
	<li>Meça o pH do estoque experimental usando uma sonda de pH eletrônica após calibração de dois pontos usando soluções de pH baixo. Titrate a pH 1,1 usando soluções de estoque NaOH ou HCL conforme necessário para que o volume final seja 40 ml. Nota: Medir os baixos valores de pH pode ser difícil. Para garantir uma medição precisa, certifique-se de que a sonda de pH esteja devidamente calibrada usando padrões de pH baixo para evitar a extrapolação da medição.</li>
	<li>Imediatamente antes do experimento, filtre 1 – 2 mL do estoque experimental de HCl através de um filtro estéril de 0,22 μm em um tubo de microcentrífuga estéril.</li>
</ol>2. instilação intra-brônquica seletiva de HCl
<ol><li>
Preparando a área cirúrgica
	<ol>
<li>Induzir anestesia geral entregando uma mistura de cetamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) por injeção intraperitoneal. Certifique-se de que o rato está completamente anestesiado apertando suavemente a ponta da cauda ou do pé traseiro. A falta da resposta da retirada é exigida antes de fazer uma incisão da pele.  Administrar os boluses adicionais da anestesia, se necessário.</li>
		<li>Entregar 0,1 mg/kg de buprenorfina por via subcutânea o Scruff do pescoço. O analgésico pré-operatório fortalecerá o efeito da anestesia e melhorará a dor pré e pós-operatória resultante do procedimento.</li>
		<li>Use tosquiadeiras elétricas para raspar delicadamente a área cirúrgica na superfície ventral do rato, abaixo do queixo na região cervical da garganta, usando cursos para baixo lentos. Remover peles soltas para expor totalmente a pele subjacente.</li>
		<li>Prepare a área cirúrgica por limpando o site raspado com 10% de solução de iodo-povidona. Após a aplicação da solução asséptica, limpe o local usando um cotonete do álcool isopropílico de 70%. Repita este passo 3x.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Isolando a traqueia
	<ol>
<li>Coloc o rato em uma posição supina em uma placa cirúrgica limpa e cubra o rato em um Drape cirúrgico estéril ao manter a exposição da área cirúrgica. Fixe o drapejar no lugar.</li>
		<li>Faça uma incisão longitudinal de 0,5 cm na pele acima da traqueia e das glândulas salivares. Use fórceps serrilhada ligeiramente curvados para puxar com cuidado a pele e separar delicadamente as glândulas salivares para expor os músculos tracheal.</li>
		<li>Usando o fórceps serrilhada para a dissecção sem corte, Empurre delicadamente distante os músculos paratraqueal e arrebata afastado o fáscia que está cercando a traqueia até que os anéis cartilaginosos da traqueia estejam expostos completamente.</li>
		<li>Use fórceps serrilhada inteiramente curvados para levantar a traquéia e para separar o tecido conexivo entre a retro-traquéia e o retro-fáscia. Uma vez que o tecido conjuntivo é destacado, a ponta do fórceps deve deslizar completamente atrás da traquéia.</li>
		<li>Mantenha o fórceps curvo atrás da traquéia e segure uma peça de 10 – 15 cm de 4-0 sutura de seda trançada com as pontas do fórceps. Puxe a sutura atrás da traqueia para que haja um comprimento mesmo em ambos os lados.</li>
		<li>Uma vez que a sutura está no lugar, puxe suavemente os lados da sutura para o posterior do mouse e segure os lados no lugar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Seletivamente canulação o brônquio do do mainstem esquerdo e instilando HCL
	<ol>
<li>Tome um angiocatheter de 24 G x 3/4 "e insira a agulha, chanfro acima, na região anterior da traquéia entre o primeiro e o segundo anéis tracheal. Uma vez que a inserção apropriada é confirmada pela visualização direta da ponta da agulha no lúmen tracheal, libere a sutura e avance a cânula sobre a agulha e na traqueia até que a resistência esteja alcançada, a seguir retire a agulha. Ângulo o sentido da inserção para o brônquio principal esquerdo da haste para a instilação seletiva no pulmão esquerdo.</li>
		<li>Uma vez que a cânula está no lugar, segure firmemente o porto da injeção para impedir que o cateter desloc.</li>
		<li>Usando uma pipeta P200 e pontas estéreis da pipeta P200, incutir 2,5 ml/kg (50 μL para um rato de 20 g) do HCL filtrado estéril de 0,1 N no cateter, seguido por um volume idêntico de ar.</li>
		<li>Retire rapidamente o cateter e levante a placa cirúrgica para um ângulo de 60 ° por 30 s.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fechando a área cirúrgica
	<ol>
<li>Coloque a placa cirúrgica plana e retire a sutura por trás da traquéia.</li>
		<li>Use 4-0 cera revestida de seda trançado sutura para fechar a incisão da pele usando 2 – 3 pontos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. cuidados pós-operatórios
<ol><li>Uma vez que a incisão é fechada, coloque o mouse no lado esquerdo em uma almofada de aquecimento quente até que o mouse se recupere da anestesia. Comece a monitorar o mouse para a dor eo nível de atividade antes de devolvê-lo à habitação normal. Nota: A buprenorfina deve ser administrada a 0,1 mg/kg por via subcutânea a cada 6-12 h durante as primeiras 24 h. Se a dor persistente da descoberta está atual, estenda o regime analgésico até que a dor Subsides.</li>
</ol>4. lavagem broncoalveolar pulmonar inteira (LBA) e imunofenotipagem leucocitária
<ol><li>
Eutanizar o rato administrando 3x a dose de cetamina/xilazina utilizada no passo 2.1.1.
	<ol>
<li>Para diferenciar neutrófilos intersticiais e intravascular, injectar por via intravenosa um anticorpo selecionado fluoróforo Ly6G 5 min antes da eutanásia. Este rótulo deve ser adequado para detecção por citometria de fluxo para distinguir neutrófilos intravasculares de neutrófilos intersticiais e alveolares pulmonares, que serão rotulados durante a preparação do tecido com um fluoróforo diferente (ver abaixo).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloc o rato em uma placa cirúrgica e prenda os incisivos anteriores em torno de um laço da sutura de seda trançado 2-0.</li>
	<li>Siga os passos 2.2.2 – 2.2.6. para preparar a traquéia para a canulação. Nota: Certifique-se que o diafragma não é perfurado para maximizar a pressão inflar trans-alveolar durante o lavage do pulmão; a complacência esquerda do pulmão diminui depois da lesão, que pode exigir uma exigência de pressão trans-alveolar mais elevada para o lavage do pulmão.</li>
	<li>Cannulate a traquéia que segue a etapa 2.3.1, mas não avança o cateter abaixo do Carina; Insira o cateter paralelo à traquéia.</li>
	<li>Com o cateter inserido, amarrar a sutura em torno da traquéia para segurar o cateter no lugar.</li>
	<li>Inquieto e retire duas alíquotas consecutivas de 1 mL de PBS gelada-/-(sem magnésio ou cálcio) com 0,6 mM de EDTA usando uma seringa de 1 cc. Para imunofenotipagem pela citometria de fluxo, remova cada alíquota e retorne a um tubo de 5 ml de poliestireno FACS no gelo.</li>
	<li>Para assegurar a eutanásia, realize uma toracotomia com tesoura cirúrgica seguida de punção cardíaca. Os pulmões podem ser colhidos para processamento posterior.</li>
	<li>Centrifugue o BAL por 10 min a 800 g a 4 ° c para sedimento das células.</li>
	<li>Decantar o sobrenadante em um tubo de microcentrífuga de 2 mL e alíquota em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Armazene em-80 ° c para a análise subseqüente.</li>
	<li>Ressuscito a pelota da pilha em PBS-/-com FBS de 2% para a análise diferencial da leucócito pela citometria do fluxo.</li>
	<li>Para diferenciar neutrófilos intersticiais e intravascular, remover o pulmão esquerdo e direito separadamente e processar os pulmões para citometria de fluxo como em Abdulnour et al. 20146.</li>
	<li>Manchar a suspensão da célula resultante usando anticorpos FACS selecionados, certificando-se de mancha para Ly6G que é conjugada com um fluoróforo diferente do que o anticorpo Ly6G da etapa 4.1.1.</li>
</ol>5. avaliação da permeabilidade da barreira alveolar usando o corante azul de Evan (EBD)
<ol><li>Injectar intravenosamente o corante azul de Evan (40 mg/kg) 30 min antes da eutanásia.</li>
	<li>Eutanizar o rato usando a overdose de cetamina/xilazina (passo 4,1).</li>
	<li>Para medir a integridade da barreira alveolar, siga os passos 4.2 – 4.9 para a coleta de BAL.</li>
	<li>Transfira 100 μL de BALF para uma microplaca de fundo transparente de 96 poços, juntamente com 100 μL de padrões EBD duplicados. Use PBS-/-como um espaço em branco.</li>
	<li>Utilize um leitor de microplacas para medir a absorvância do BALF a 620 nm e 740 nm. Utilizar a absorvância a 740 nm para corrigir a contaminação da heme nas amostras7.</li>
	<li>Para medir a integridade da barreira vascular, perfuse os pulmões lentamente injetando 5 mL de PBS gelo-frio-/-através do ventrículo direito do coração. Retire o pulmão esquerdo.</li>
	<li>Seque o pulmão esquerdo para 72 h a 58 ° c para remover o excesso de água.</li>
	<li>Processe o tecido pulmonar seco como em Radu e Chernoff 20138, e Meça as absorvências a 620 nm e 740 nm.</li>
</ol>6. histologia pulmonar
<ol><li>Cannulate a traquéia seguindo as etapas 4.1 – 4.5.</li>
	<li>A pressão fixar os pulmões a 20 cm H2o, use um suporte de anel e braçadeira para elevar uma seringa de 60 ml equipada com tubos controlados por válvula e preenchido com uma solução de fixação Select (por exemplo, fixador de zinco) para que o menisco da solução fixativa é de 20 cm acima do Pulmões.</li>
	<li>Prenda o tubo ao cateter e abra o valor. Encha lentamente os pulmões com fixador até que parem de inflar.</li>
	<li>Retire o cateter 3/4 do caminho para fora da traquéia. Amarre a traquéia com sutura antes de remover completamente o cateter para minimizar a perda de fixative.</li>
	<li>Retire os pulmões e coração en Bloc. Nota: Certifique-se que os pulmões não são perfurados durante a remoção para reter a pressão infundido fixative.</li>
	<li>Fixar os pulmões por 24 h em 25 ml de fixador à temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave os pulmões fixos para intervalos seqüenciais de 20 minutos em PBS-/-, 30% de etanol e 50% de etanol.</li>
	<li>Após a última lavagem, armazene os pulmões em 70% de etanol para processamento de histologia como em Eickmeier et al. 20139.</li>
</ol>

<ol><li>Baron, R. M., Levy, B. D., et al. Acute Respiratory Distress Syndrome. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBaron%2C+RM+%22Harrison%27s+Principles+of+Internal+Medicine%2C+20e%22">Harrison's Principles of Internal Medicine, 20e</a>. Jameson, J. L. , McGraw-Hill Education. (2018).</li>
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<li>Bonnans, C., Fukunaga, K., Keledjian, R., Petasis, N. A., Levy, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+phosphatidylinositol+3-kinase+by+polyisoprenyl+phosphates+in+neutrophil-mediated+tissue+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Regulation of phosphatidylinositol 3-kinase by polyisoprenyl phosphates in neutrophil-mediated tissue injury.</a> The Journal of Experimental Medicine. 203 (4), 857-863 (2006).</li>
<li>Mandell, L. A., Niederman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspiration+Pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Aspiration Pneumonia.</a> New England Journal of Medicine. 380 (7), 651-663 (2019).</li>
<li>Seki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anti-inflammatory+and+proresolving+mediator+resolvin+E1+protects+mice+from+bacterial+pneumonia+and+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The anti-inflammatory and proresolving mediator resolvin E1 protects mice from bacterial pneumonia and acute lung injury.</a> Journal of Immunology. 184 (2), 836-843 (2010).</li>
<li>Abdulnour, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspirin-triggered+resolvin+D1+is+produced+during+self-resolving+gram-negative+bacterial+pneumonia+and+regulates+host+immune+responses+for+the+resolution+of+lung+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Aspirin-triggered resolvin D1 is produced during self-resolving gram-negative bacterial pneumonia and regulates host immune responses for the resolution of lung inflammation.</a> Mucosal Immunology. 9 (5), 1278-1287 (2016).</li>
<li>Traber, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid-epithelial+cross+talk+coordinates+synthesis+of+the+tissue-protective+cytokine+leukemia+inhibitory+factor+during+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Myeloid-epithelial cross talk coordinates synthesis of the tissue-protective cytokine leukemia inhibitory factor during pneumonia.</a> American journal of physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 313 (3), L548-L558 (2017).</li>
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<li>Peng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+nitric+oxide+synthase+contributes+to+ventilator-induced+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Inducible nitric oxide synthase contributes to ventilator-induced lung injury.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 172 (4), 470-479 (2005).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O método intrabrônquico da instilação descrito aqui usa o canulação seletivo do brônquio esquerdo do do mainstem para incuficar o HCl no pulmão esquerdo, tendo por resultado ferimento de pulmão agudo murino unilateral e self-Limited. Este modelo de lesão pulmonar com ácido murino representa de perto a resposta inflamatória, a histopatologia e a disfunção fisiológica observada na SDRA humana, onde a aspiração ácida gástrica é um fator precipitante ou contribuinte comum4. A exposição da via aérea Murina ao baixo pH HCl resulta em aumento da permeabilidade da barreira alvéolo-capilar, edema alveolar e infiltração profunda de neutrófilos no local da lesão. Estes acontecimentos não são observados no pulmão direito não lesionado. Além disso, este modelo produz respostas inflamatórias rápidas que pico dentro de 24 h após a instilação ácida, e compartilha mudanças na expressão gênica com SDRA humana, como a expressão diferencial de isoformas de fosfolipase D10.
Embora este modelo pré-clínico murino reprodumore muitas das características do Ards nos níveis molecular, celular, e do tecido, não recapitular inteiramente Ards humanos. A definição de SDRA inclui a participação bilateral3do pulmão, visto que o método da instilação descrito aqui resulta pelo projeto na doença de pulmão unilateral. Além disso, os animais não necessitam de ventilação mecânica contínua, imobilidade ou sedação parenteral. Os resultados aqui apresentados (vide supra) e outros6,9,11,12,13demonstram que a lesão pulmonar induzida por ácido unilateral reproduz a maior parte das características patológicas da ARDS, proporcionando a oportunidade única de usar o pulmão direito como controle interno e para estudar a fase de resolução desta doença. Como tal, o modelo discutido aqui modela a patobiologia de Ards, mas igualmente permite a investigação mecanicista de respostas fundamentais do tecido de pulmão aos mecanismos da lesão e da definição que podem ser relevantes para endereçar esta doença importante.
A instilação do HCl representa ferimento de pulmão agudo direto, assim que é aspectos de modelagem da patofisiologia associada com a pneumonite da aspiração. Além, o insulto esquerdo inicial do pulmão neste modelo é gerado usando o HCl estéril um pouco do que índices gastric bactérias-carregados vistos em alguns eventos humanos da aspiração que podem igualmente conduzir à pneumonia14. Nos seres humanos, a aspiração de bactérias patogênicas pode resultar em pneumonia bacteriana secundária que exacerba a resposta inflamatória aguda, prolongando a lesão pulmonar inicial e aumentando a suscetibilidade do paciente para desenvolver SDRA14. Esta limitação potencial foi abordada por investigadores que instilam propositadamente bactérias patogénicas Escherichia coli (E. coli)15 após o HCl estéril. Adicionalmente, este método foi usado para investigar o patógeno-mediado inflamação a pneumonia bacteriana unilateral pode ser induzida por instilação pulmonar seletiva à esquerda de bactérias, como e. coli16,17, Pseudomonas aeruginosa16e Streptococcus pneumoniae18 . O modelo de lesão pulmonar aguda autolimitada descrito aqui também pode ser usado para estudar a lesão pulmonar induzida por ventilador (VILI), uma importante causa de aumento da mortalidade em ARDS humanos19. Modelos experimentais de animais de VILI geralmente envolvem ventilação mecânica em camundongos ingênuos com volumes correntes que são muito mais elevados do que o que é clinicamente utilizado para causar lesão pulmonar (> 15 ml/kg; ver trabalho anterior20,21). Para um modelo mais clinicamente relevante de VILI, a instilação de ácido intrônquico, descrita aqui, pode ser usada primeiro para induzir lesão pulmonar não letal seguida de ventilação mecânica em volumes correntes dentro da faixa clínica (6-12 mL/kg). Este modelo animal hipotético pode permitir que os investigadores estudem a VILI de uma forma clinicamente relevante, uma vez desenvolvida e validada. Juntos, esses modelos murinos destacam a versatilidade do método seletivo de instilação intrabronquial para gerar insultos pulmonares unilaterais que se assemelham intimamente às patologias associadas às doenças pulmonares humanas.
Além de permitir a instilação seletiva de vários agentes nocivos para o pulmão esquerdo, a técnica de instilação intra-brônquica após a traqueostomia não requer treinamento prolongado, tempo de procedimento longo ou equipamento complexo, e em mãos experientes provoca um mínimo de aflição para os animais. Apesar disso, várias questões podem ocorrer durante o procedimento seletivo de instilação de HCl que pode impactar os resultados experimentais. O canulação impróprio do brônquio principal esquerdo da haste pode conduzir à lesão pulmonar bilateral que diminui a sobrevivência de ratos experimentais e confunde o uso do pulmão direito como um controle interno não ferido. Isto pode ser evitado dobrando o cateter suficientemente para o pulmão esquerdo durante o canulação até que a resistência esteja alcangado. Após a injeção do HCl, um bolus do ar deve ser injetado, o cateter removido ràpida, e a placa cirúrgica trouxe ereto a um ângulo de 60 °. Estas etapas são cruciais para assegurar-se de que o ácido alcangue as vias aéreas longe do ponto de origem do pulmão esquerdo e impeça o reflux do ácido no pulmão e na traquéia direitas, que podem causar ferimento proximal. Dentro de 24 h que segue a instilação, a lesão no pulmão esquerdo é difusa com o edema pulmonar extensivo, afetando o pulmão esquerdo longe do ponto de origem e proximal.
Durante o desenvolvimento de método em camundongos adultos de 8-12 semanas de idade, 2,5 mL/kg de HCl intra-brônquica produziu lesão pulmonar aguda substancial ainda subletal; doses mais baixas de HCl não resultam em lesão pulmonar reprodutível e homogênea. Embora não tenhamos realizado este modelo em ratos mais jovens (por exemplo, 3-6 semanas de idade) ou mais velhos (por exemplo, 10-14 meses de idade), prevemos que a dosagem baseada em peso de HCl resultará em um fenótipo de lesão pulmonar semelhante ao observado em camundongos de 8-12 semanas de idade. Recomendamos que os investigadores titular doses de HCL para atingir o grau desejado de lesão pulmonar antes de realizar experimentos com camundongos em extremos de peso.
Este procedimento seletivo da instilação ácida oferece um modelo murino não-letal da inflamação estéril do tecido que reduza a necessidade para o cuidado de suporte, tal como a ventilação mecânica. Com a sobrevivência prolongada de ratos feridos, a inflamação induzida por ácido tem tempo suficiente para se autoresolver. A fase de resolução deste modelo tem sido utilizada para identificar mediadores lipídicos bioativos endógenos regulados temporalmente, denominados mediadores de pró-resolução especializados (SPMs), como lipoxina A4 (LxA4), Maresin 1 (MaR1) e resolvins6 ,11,12,16. Administrar SPMs exógenos a camundongos feridos acelera a resolução de lesão pulmonar induzida por ácido por mecanismos inflamatórios de umedecimento e promovendo a catabíase do tecido pulmonar lesionado. Estes SPMS promovem o afastamento do edema alveolar12, aumentam o macrófagos de neutrófilos apoptóticas por macrófagos recrutados16, e aceleram a re-epithelialization das vias aéreas e dos alvéolos12 para reduzir o vascular vazamento e hipóxia tecidual. Em um modelo de lesão pulmonar induzida por patógenos, o 15-EPI-Resolvin D1 também exibiu ações antimicrobianas através do aumento da fagocitose bacteriana por macrófagos e maior Clearance bacteriano do pulmão infectado16. A investigação desses mecanismos de resolução endógena fornece insights sobre potenciais estratégias terapêuticas novas para pacientes com SDRA5.
Para melhor estudar a regulação espaciotemporal dos mecanismos de resolução, são necessários modelos experimentais in vivo. Os modelos de lesão pulmonar aguda devem incluir respostas inflamatórias agudas relevantes e disfunção orgânica com o engajamento da resolução do hospedeiro promovendo processos moleculares e celulares. Esses mecanismos podem ser quantificados usando índices de resolução estabelecidos22. O método seletivo intrabrônquico da instilação para gerar ferimento pulmonar agudo unilateral provou útil a este respeito para sondar mediadores e vias endógenos da definição. Estudos futuros que aprofundem nossa compreensão desses processos de resolução ativa têm a promessa de levar a agonistas terapêuticos que imitam as bioações dos mediadores lipídicos endógenos para melhorar a resolução da inflamação e mitigar a morbidade e mortalidade de SDRA e outras doenças pulmonares importantes.

A síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA) é uma importante causa de insuficiência respiratória aguda1. É uma doença comum e letal ou incapacitante que ocorre em 10% de todos os pacientes admitidos em unidades de terapia intensiva no mundo inteiro2. De acordo com a definição3de Berlim, a SDRA é definida pelo início agudo da insuficiência respiratória hipoxêmica (< 1 semana) e infiltrados pulmonares bilaterais em radiografias de tórax que não são explicadas pela insuficiência cardíaca4. A patología subjacente é caracterizada por uma resposta inflamatória excessiva. O pulmão pode ser ferido diretamente, como em pneumonia ou com aspiração de ácido gástrico, ou indiretamente, como na sepse ou após transfusões múltiplas de sangue4. Após o insulto inicial, a patogênese da SDRA progride em três fases: fases exsudativas, proliferativas e fibróticas1. Estas fases são caracterizadas por mecanismos imunes e de reparo moleculars e celulares distintos que determinam o prognóstico para pacientes de SDRA. O cuidado de suporte permanece o esteio para pacientes de SDRA; Atualmente, não há tratamentos farmacológicos efetivos para a SDRA, por isso há uma necessidade urgente de novas pesquisas sobre esta condição devastadora4.
A desregulação da resposta imune inata durante a fase exsudativa contribui para o início agudo da SDRA e insuficiência respiratória associada1. A sinalização de mediador pró-inflamatório potente orquestra as respostas imunes iniciais, levando ao rompimento da barreira alvéolo-capilar, edema alveolar difuso e infiltração de neutrófilos no local da lesão tecidual pulmonar4. Na SDRA, os sinais de frenagem ineficazes para inflamação aguda predispõem à insuficiência pulmonar e podem atrasar a catabíase oportuna do tecido pulmonar lesionado5. Para esse fim, a investigação pré-clínica sobre os mecanismos de iniciação e pró-resolução endógena da SDRA pode revelar novas estratégias terapêuticas. Tal investigação requer modelos experimentais in vivo autolimitados de lesão pulmonar aguda que se assemelham intimamente às características da SDRA humana, permitindo a interrogação de mecanismos subjacentes às fases de iniciação e resolução de lesão tecidual.
O modelo murino apresentado aqui produz lesão pulmonar aguda direta que demonstra os processos patobiológicos cardinais de SDRA exsudativa, ou seja, rompimento da barreira alveolar-capilar e infiltração de neutrófilos. O método depende da instilação intra-brônquica seletiva do HCL através do canulação do brônquio esquerdo do do mainstem, localizando a lesão e a resposta inflamatório ao pulmão esquerdo; o pulmão direito não ferido pode ser usado como um controle interno para determinações seleto de ferimento e de inflamação do tecido. Além disso, a lesão pulmonar unilateral é não letal e revela um programa de resolução. Isto oferece uma janela distinta na definição da inflamação do pulmão que pode ser aproveitada para a identificação de mediadores pró-resolvendo endógenos e de mecanismos celulares e para abrir avenidas terapêuticas novas para SDRA que emfatiza a fisiologia da definição e Farmacologia.

<table><tbody><tr><td>10x Fixador de Zinco</td><td>BD Biosciences</td><td>552658</td><td></td></tr><tr><td>2-0 Sutura de Seda Trançada</td><td>Surgical Specialties</td><td>SP118</td><td></td></tr><tr><td>24 G x 3/4" Cateter Descartável Safelet I.V.</td><td>Excel</td><td>26751</td><td></td></tr><tr><td>33 mm, 0.22 &micro; unidade de filtro de seringa</td><td>m Millipore-Sigma</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>4" Longo Serrilhado Ligeira Curva Graefe Fórceps</td><td>Roboz</td><td>RS-5135</td><td></td></tr><tr><td>4" Ponta Longa Serrilhada Curva Completa Graefe Pinça Roboz</td><td></td><td>RS-5137</td><td></td></tr><tr><td>4.5 " Micro Tesoura de Dissecação</td><td>Roboz</td><td>RS-5912</td><td></td></tr><tr><td>6" Crile Wood Needle Holder</td><td>Roboz</td><td>RS-7860</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 60 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse FITC-Ly6G anticorpo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11-9668-82</td><td>Fluoróforo preferido pode ser usado</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-rato PE-Ly6G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-9668-82</td><td>Fluoróforo preferido pode ser usado</td></tr><tr><td>Esterilizador</td><td></td><td></td><td></td>de esferas</tr><tr><td>Betadine Solution Swabstick</td><td>Betadine</td><td>67618-153-01</td><td></td></tr><tr><td>Buprenex</td><td>Reckitt Benckiser</td><td></td><td>NDC: 12496-0757-1, 12496-0757-5</td></tr><tr><td>Microplaca transparente de fundo plano de 96 poços</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12565501</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeccos's Phosphate Buffered Saline (PBS) sem Ca2+ ou Mg+</td><td>life technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Tesouras elétricas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)</td> <td>Millipore-Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Evans Blue Dye</td><td>Millipore-Sigma</td><td>E-2129</td><td></td></tr><tr><td>Almofada</td><td></td><td></td><td></td>de aquecimento</tr><tr><td>Ácido clorídrico, 37%</td> <td>Millipore-Sigma</td><td>258148</td><td></td></tr><tr><td>Cetamina</td><td>Henry-Schein</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de microplacas (640, 720 nm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta</td><td></td><td></td><td></td>P200</tr><tr>Pontas <td></td><td></td><td></td>de<td>pipeta P200</td></tr><tr><td>Sonda</td><td></td><td></td><td></td>de pH</tr><tr><td>Suporte de anel com braçadeira</td><td></td><td></td><td></td>de extensão</tr><tr><td>Almofadas de preparação de álcool estéril</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-363-750</td><td></td></tr><tr><td>Campo Estéril para Rato 8" x 8" com Fenestração Adesiva Oval</td><td>Steris</td><td>88VCSTF</td><td></td></tr><tr><td>Luvas Estéreis de Nitrilo</td><td>Kimberly-Clark</td><td>56890</td><td></td></tr><tr><td>Campo Estéril para Towl</td><td>Sutura de</td> Seda Trançada 4-0 Revestida com Cera Dynarex <td>4410</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Covidien</td><td>SS733</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>AKORN</td><td></td><td>NDC: 59399-111-50</td></tr></tbody></table>

um modelo de lesão pulmonar aguda autolimitada por instilação unilateral de ácido intra-brônquico

A Model of Self-limited Acute Lung Injury by Unilateral Intra-bronchial Acid Instillation

A instilação intra-brônquica seletiva do ácido clorídrico (HCL) ao brônquio esquerdo murino do do mainstem causa ferimento de tecido agudo com os resultados histopatológicos similares à síndrome de aflição respiratória aguda humana (Ards). O edema alveolar resultante, o dano de barreira alveolar-capilar e a infiltração leucocitária afetam predominantemente o pulmão esquerdo, preservando o pulmão direito como um controle não lesionado e permitindo que os animais sobrevivam. Este modelo de lesão pulmonar aguda autolimitada possibilita a investigação de mecanismos de resolução tecidual, como a efferocitose de macrófago de neutrófilos apoptóticos e a restituição da integridade da barreira alveolar-capilar. Este modelo tem ajudado a identificar papéis importantes para agonistas de resolução, incluindo mediadores especializados de pró-resolução (SPMs), proporcionando uma base para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para pacientes com SDRA.

A instilação de HCl intra-brônquica seletiva resulta em lesão pulmonar aguda unilateral
O método da instilação intra-brônquica seletiva do HCl no brônquio esquerdo do do mainstem é ilustrado na Figura 1a. A consequente lesão pulmonar aguda envolve todo o pulmão esquerdo, e após a administração intravenosa de EBD e perfusão pulmonar, o EBD permaneceu apenas no pulmão esquerdo (Figura 1b). O extravasamento de EBD no pulmão esquerdo foi quantificado e encontrado para ser aumentado significativamente relativo à instilação seletiva Sham (Figura 1C; adaptado de Abdulnour et al. 20146). Em resposta à lesão pulmonar, circulando leucócitos diapedese no tecido inflamado. Neste modelo, os neutrófilos vasculares passam por migração trans-endotelial para o interstício pulmonar lesionado. Neutrófilos intersticiais acumulados no pulmão esquerdo 24 h após a instilação de HCl, em contraste com o pulmão direito, onde poucos neutrófilos intersticiais são observados (Figura 1D). Estes resultados indicam que o método de instilação intra-brônquico do do mainstem esquerdo seletivo conduziu à lesão de pulmão aguda murino que foi localizada pela maior parte ao pulmão esquerdo e produziu as mudanças patológicas que são consideradas igualmente com Ards humanos, incluindo o aumento ruptura alveolar-capilar da barreira e infiltração do neutrófilo.
A lesão pulmonar aguda unilateral possibilita a investigação de mecanismos de resolução
Para estudar a fase de resolução de ratos de lesão pulmonar aguda induzida por ácido deve ser capaz de sobreviver ao insulto inicial. Distinto do HCl intratraqueal, a instilação em somente o brônquio esquerdo do do mainstem conduz a um ferimento Self-Limited com sobrevivência uniforme em ratos de outra maneira saudáveis. Os pulmões podem ser obtidos a partir de camundongos em temporais precoces ou posteriores, como na Figura 2a. A histologia pulmonar mostra lesão tecidual e inflamação no órgão e nível celular com inflamação exsudativa 24 h após lesão caracterizada por edema alveolar marcado e infiltração de neutrófilos no pulmão esquerdo. Observe que não há lesão significativa ou influxo de leucócitos no pulmão direito de controle não lesionado (Figura 2a). 72 h após ferimento, o edema e os infiltrados celulares são diminuídos substancialmente, representando uma fase exsudativa de resolução. Os neutrófilos alveolares podem ser monitorados por citometria de fluxo (CD45+/Cd68-/F4/80-/Ly6g+/CD11b+) obtidos por lavagem pulmonar total. Os neutrófilos aumentam no pulmão esquerdo 24 h após a lesão inicial e diminuem substancialmente em 48 e 72 h (Figura 2b). Se os pontos temporais posteriores forem investigados, os números de neutrófilos retornarão à linha de base e os mecanismos nas fases posteriores da catabíase, como as respostas fibroproliferativas, podem ser estudados.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60024/60024fig1v2.jpg"> Figura 1: a instilação de HCl intra-brônquica seletiva produz lesão pulmonar unilateral definida por ruptura de barreira alveolar e infiltração de neutrófilos. (A) respresentação do canulação do brônquio esquerdo murino do do mainstem para a instilação seletiva do HCL no pulmão esquerdo. (B) pulmão direito resected (RL) e esquerdo (ll) expostos à instilação ácida seletiva e perfundidos depois do corante azul de Evan intravenoso. (C) quantificação do corante azul intersticial de Evan de pulmão homogeneizado, perusado 24 h após lesão ácida ou controle simulado; Figura adaptada de Abdulnour et al. 20146. Os valores representam média ± SEM, onde n ≥ 5. *p &lt; 0, 5, teste U de Mann-Whitney. (D) citometria de fluxo representativa de neutrófilos intravascular (I.V.; fluoróforo 1) e intersticial (r. fluoróforo 2) como percentual do total de células CD45+ em pulmão processado 24 h após lesão ácida. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60024/60024fig1v2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60024/60024fig2.jpg"> Figura 2: lesão pulmonar aguda unilateral é autoresolutiva. (A) histologia de H &amp; E representativa (10x) de pulmões esquerdos obtidos de camundongos ingênuos (0 H) ou camundongos 24, 48, 72 h após lesão, juntamente com o pulmão direito associado do mesmo camundongo (barra de escala = 250 μm). (B) citometria de fluxo representativa de neutrófilos alveolares (Ly6G+ CD11b+) obtidos a partir de lavagem pulmonar total como percentual de células totais CD45+ em camundongos (0 h) ou camundongos 24, 48 e 72 h após lesão ácida. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60024/60024fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

A instilação seletiva do ácido intra-brônquico ao pulmão esquerdo nos ratos conduz a ferimento de pulmão agudo unilateral e self-Limited que modela a síndrome de aflição respiratória aguda humana (ARDS) induzida pela aspiração ácida gastric.

Um modelo de lesão pulmonar aguda autolimitada por instilação unilateral de ácido intra-brônquico

Selective intra-bronchial instillation of hydrochloric acid (HCl) to the murine left mainstem bronchus causes acute tissue injury with histopathologic ...

O método intra-brônquico seletivo é significativo porque oferece aos pesquisadores um modelo reprodutível e não letal para estudar lesões pulmonares agudas, uma das principais causas da síndrome do desconforto respiratório agudo em humanos. A vantagem da técnica intra-brônquica seletiva é a localização da resposta inflamatória ao pulmão esquerdo oferecendo o pulmão direito como um controle ileso e minimizando a angústia animal. Demonstrando esse procedimento estará Alexander Tavares, técnico e aluno de pré-graduação do nosso laboratório.Para preparar 0,1 ácido clorídrico normal, adicione 11 mililitros de água dupla destilada a uma garrafa de vidro âmbar, seguido pela adição lenta de um mililitro de ácido normal de 37%12. Em seguida, adicione lentamente quatro mililitros de um estoque normal de ácida trabalhando em 35 mililitros duplamente destilados em um tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, use uma sonda eletrônica de pH para medir o pH da solução de estoque normal de 0,1, titulando-se a um pH de 1,1 usando hidróxido de sódio ou solução de estoque ácido, conforme necessário para um volume final de 40 mililitros.Antes de iniciar o procedimento, filtre de um a dois mililitros da solução ácida através de um filtro microliter estéril de 0,22 em um tubo de microcentrífuga estéril e confirme a falta de resposta ao reflexo da dor em um rato anestesiado. Usando cortadores elétricos em golpes lentos para baixo raspe suavemente a área cirúrgica na superfície ventral do mouse abaixo do queixo na região cervical da garganta. Remova qualquer cabelo solto e cotonete a pele exposta com três soluçãos consecutivas de 10% de iodo povidone e cotonetes de álcool isopropílico de 70%.Quando a pele estiver preparada, coloque o rato na posição supina em uma placa cirúrgica limpa e cubra o animal com uma cortina cirúrgica estéril. Faça uma abertura longitudinal de 0,5 centímetros na pele acima da traqueia e das glândulas salivares, e use fórceps serrilhados ligeiramente curvos para retrair cuidadosamente a pele. Separe suavemente as glândulas salivares para expor os músculos traqueais e use fórceps serrilhados ligeiramente curvados para afastar suavemente os músculos paratraqueais.Provoque a fáscia ao redor da traqueia até que os anéis cartilaginosos da traqueia estejam completamente expostos, e use fórceps serrilhados totalmente curvos para afastar o tecido conjuntivo entre a retrotrachea e a retrofascia. Deslize fórceps serrilhados totalmente curvados atrás da traqueia e levante a traqueia. Uma vez que a ponta dos fórceps esteja atrás da traqueia, segure uma peça de 10 a 15 centímetros de sutura de seda trançada 4-0 com as pontas dos fórceps e puxe a sutura atrás da traqueia para que haja um comprimento uniforme em ambos os lados.A placa cirúrgica pode ser virada para aproximar a área cirúrgica da mão dominante para os próximos passos. Em seguida, puxe suavemente as extremidades da sutura em direção ao anterior do mouse, e mantenha as extremidades no lugar. Para a canulação do brônquio da rede esquerda, exponha a agulha de um angiocateter de 24 polegadas por 3/4 polegadas e insira o lado de bipe da agulha na região interna da traqueia entre o primeiro e o segundo anéis traqueais.Quando a ponta da agulha puder ser visualizada dentro do lúmen traqueal, solte a sutura e avance a cânula sobre a agulha para a traquea em direção ao lado posterior esquerdo do mouse. Quando as resistências se encontrarem, retire a agulha. Uma vez que a cânula esteja no lugar, segure firmemente a porta de injeção para evitar que o cateter se mude e proteja uma ponta de micropipette P-200 dentro da porta.Em seguida, instile 50 microliters da solução de ácido normal filtrada 0.1 no cateter, seguido por um volume igual de ar. Esta etapa requer uma manipulação precisa da cânula, enquanto as vias aéreas estão obstruídas, e deve ser concluída de forma rápida e suave para restaurar o fluxo de ar adequado e minimizar os danos nas vias aéreas. Retire rapidamente o cateter e incline a placa cirúrgica em um ângulo de 60 graus.Após 30 segundos, coloque a placa cirúrgica plana, e remova a sutura por trás da traqueia. Em seguida, use uma sutura de seda trançada revestida de cera 4-0 para fechar a incisão da pele com dois a três pontos. A lesão pulmonar aguda resultante da instilação de ácido intra-brônquico envolve todo o pulmão esquerdo.De fato, após a administração intravenosa de corante azul evans e perfusão pulmonar, o corante é detectado apenas dentro do pulmão esquerdo. A quantificação da extravasação de corante no pulmão esquerdo é significativamente aumentada em relação à instilação seletiva falsa. Neutrófilos intersticiais se acumulam no pulmão esquerdo 24 horas após a instilação de ácido em contraste com o pulmão direito no qual poucos neutrófilos intersticiais são observados.A histologia pulmonar revela lesão tecidual e inflamação nos níveis do órgão e celular com inflamação exudativa 24 horas após a lesão caracterizada por edema alveolar marcado e infiltração de neutrófilo dentro do pulmão esquerdo. Note que a falta de lesões significativas ou o fluxo de leucócitos no pulmão direito de controle ileso. 72 horas após a lesão, o edema e os infiltrados celulares são substancialmente diminuídos representando uma fase exsudativa de resolução.Conforme avaliado pela citometria de fluxo, os neutrófilos alveolares aumentam no pulmão esquerdo 24 horas após a lesão inicial, e diminuem substancialmente em 48 e 72 horas. É importante visualizar o cateter na traqueia antes de avançar. Angule a cânula em direção ao brônquio da rede esquerda durante a inserção e siga a instilação ácida com 50 microliters de ar.Análise de fluidos de lavage broncoalveolar, histologia pulmonar, fenotipagem de células imunes por citometria de fluxo, imagem de rato vivo e teste de função pulmonar podem ser realizados para avaliar a inflamação e resolução. O desenvolvimento desse modelo auto-limitado de lesão pulmonar aguda permitiu que os pesquisadores fizessem contribuições significativas para o campo da biologia da resolução. Lembre-se que o ácido clorídrico concentrado é perigoso e que deve ser manuseado em um capuz químico usando o equipamento de proteção individual adequado.

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