Name: Sistema híbrido do Microdrive com a ponta de prova recuperável do opto-silicone e tetrode para a gravação high-density do duplo-local em ratos livremente moventes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Aprenda a construir um microdrive híbrido com tetrodos e sonda opto-silício reutilizável para gravações eletrofisiológicas de alta densidade em ratos livremente móveis. Este método permite manipulação optogenética simultânea em múltiplas regiões cerebrais.

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Este trabalho foi apoiado em parte pela sociedade do Japão para a promoção da ciência de bolsas de pesquisa no exterior (HO), programa de estudioso dotado (TK), programa de ciência da fronteira humana (TK), Brain Research Foundation (TK), faculdade de ciência e tecnologia de aquisição e Programa da retenção (TK), cérebro & Fundação da pesquisa do comportamento (TK), e pelo concessão da pesquisa da Fundação de Sumitomo (JY), concessão nova da pesquisa do investigador de NARSAD (JY). Agradecemos a W. Marks por comentários valiosos e sugestões durante a preparação do manuscrito.

Os autores não têm nada a revelar.

O protocolo demonstra como construir e implantar uma matriz de Microdrive híbrida que permite a gravação de atividades neurais de duas áreas cerebrais usando tetrodes ajustável independente e uma sonda de silício em camundongos que se comportam livremente. Também demonstra experimentos optogenéticos e a recuperação da sonda de silício após experimentos. Quando a ponta de prova ajustável33 do silicone ou a sonda do opto-silicone36 a implantação for demonstrada previamente no...

É crucial compreender como a atividade neuronal apoia o processo cognitivo, tal como a aprendizagem e a memória, investigando como as regiões cerebrais diferentes interagem dinamicamente uns com os outros. Para elucidar a dinâmica da atividade neural subjacente às tarefas cognitivas, a eletrofisiologia extracelular em grande escala tem sido conduzida em animais que se deslocam livremente com o auxílio de matrizes de Microdrive1,2,3, a 4. Nas últimas duas décadas, vários tipos de Microdrive array foram desenvolvidos para implantar eletrodos em múltiplas regiões cerebrais para ratos5,6,7,8 e camundongos9, 10 de , 11 anos de , 12. no entanto, os projetos atuais do Microdrive geralmente não permitem o uso de tipos múltiplos da ponta de prova, forçando investigadores a escolher um único tipo do elétrodo com benefícios e limitações específicos. Por exemplo, as matrizes tetrode funcionam bem para regiões cerebrais densamente povoadas, como o hipocampo dorsal CA11,13, enquanto sondas de silício dão um melhor perfil geométrico para estudar conexões anatômicas14 , quinze anos.
Tetrodes e sondas de silício são freqüentemente usados para gravação in vivo crônica, e cada um tem suas próprias vantagens e desvantagens. Tetrodes provaram ter vantagens significativas na melhor isolação da única unidade do que os únicos elétrodos16,17, além do que a eficácia de custo e a rigidez mecânica. Eles também fornecem rendimentos mais elevados de atividades de unidade única quando combinados com microdrives8,18,19,20. É essencial aumentar o número de neurônios simultaneamente gravados para compreender a função dos circuitos neurais21. Por exemplo, um grande número de células é necessário para investigar pequenas populações de tipos de células funcionalmente heterogêneas, como22 ou recompensa relacionadas ao tempo23 células. Os números de pilha muito mais elevados são exigidos para melhorar a qualidade da decodificação de seqüências do ponto13,24,25.
Tetrodes, no entanto, tem uma desvantagem na gravação de células distribuídas espacialmente, como no córtex ou no tálamo. Em contraste com tetrodes, sondas de silício podem fornecer distribuição espacial e interação de potenciais de campo local (lfps) e atividades de spiking dentro de uma estrutura local14,15. As sondas de silício com várias hastes aumentam ainda mais o número de locais de gravação e permitem a gravação em estruturas únicas ou vizinhas27. Entretanto, tais matrizes são menos flexíveis no posicionamento de locais do elétrodo comparados a tetrodes. Além disso, os algoritmos de classificação de Spike complexos são necessários em sondas de alta densidade para extrair informações sobre potenciais de ação de canais vizinhos para espelhar os dados adquiridos por tetrodes28,29,30. Daqui, o rendimento total de únicas unidades é frequentemente menos do que tetrodes. Além disso, as sondas de silício são desvantajosas devido à sua fragilidade e alto custo. Assim, a escolha de tetrodes vs. sondas de silício depende do objetivo da gravação, que é uma questão de saber se a obtenção de um alto rendimento de unidades únicas ou perfil espacial nos locais de gravação é priorizada.
Além de registrar a atividade neural, a manipulação optogenética tornou-se uma das ferramentas mais poderosas na neurociência para examinar como tipos específicos de células e/ou caminhos contribuem para as funções do circuito neural13,31, 32,33. Entretanto, as experiências optogenética exigem a consideração adicional no projeto da disposição do Microdrive para unir o conector da fibra às fontes luminosas da estimulação34,35,36. Muitas vezes, a conexão de fibra óptica requer uma força relativamente grande, o que pode levar a uma mudança mecânica da sonda no cérebro. Portanto, não é uma tarefa trivial para combinar uma fibra óptica implantável para matrizes de Microdrive convencionais.
Pelas razões acima, os pesquisadores são obrigados a otimizar a seleção do tipo de eletrodo ou para implantar uma fibra óptica, dependendo do objetivo da gravação. Por exemplo tetrodes são usados para alcançar maior rendimento unitário no hipocampo1,13, enquanto sondas de silício são usadas para investigar o perfil de profundidade laminar de áreas corticais, como o córtex entorrinal medial (MEC)37. Atualmente, microdrives para implantação simultânea de tetrodes e sondas de silício haviam sido relatados para os ratos5,11. No entanto, é extremamente desafiador para implantar múltiplas sondas de tetrodes e silício em camundongos por causa do peso dos Microdrives, espaço limitado na cabeça do mouse e requisitos espaciais para projetar o Microdrive para empregar diferentes sondas. Embora seja possível implantar sondas de silício sem um Microdrive, este procedimento não permite o ajuste da sonda e diminui a taxa de sucesso da recuperação da sonda de silício12,38. Além disso, experimentos optogenéticos exigem considerações adicionais no design de matriz de Microdrive. Este protocolo demonstra como construir e implantar uma disposição do Microdrive para a gravação crônica em ratos livremente moventes, que permite a implantação de nove tetrodes independente ajustável e uma ponta de prova ajustável do opto-silicone. Esta matriz de Microdrive também facilita experimentos optogenéticos e recuperação da sonda de silício.

<table><tbody><tr><td>#00-90 parafuso</td><td>J.I. Morris</td><td>#00-90-1/8</td><td>Porca EIB</td></tr>#<tr><td>0-80 Peças</td><td>pequenas</td><td>B00DGB7CT2</td><td>porca de latão para segurar o suporte da ponteira de fibra</td></tr><tr><td>#0-80 Parafuso</td><td>de</td><td>B000FMZ57G</td> de <td>latão para montagem do conector da sonda, suporte da ponteira de fibra e cone de blindagem Tubos de</td></tr><tr><td>polieteretercetona de 22 Ga</td><td>Peças pequenas</td><td>SLPT-22-24</td><td>para anexar à lançadeira, 0,025 polegadas de diâmetro interno</td></tr><tr><td>23 Ga tubo inoxidável</td> Peças <td>pequenas</td><td>HTX-23R</td><td>para tetrodo</td></tr><tr><td>23 Ga fio inoxidável</td> Peças <td>pequenas</td><td>HTX-23R-24-10</td><td>para fio em forma de L / suporte</td></tr><tr><td>26 Ga fio inoxidável</td> Peças <td>pequenas</td><td>GWX-0200</td><td>para postes de guia</td></tr><tr><td>30 Ga fio inoxidável</td> Peças <td>pequenas</td><td>HTX-30R</td><td>para tetrodo</td></tr><tr><td>Pacote de software CAD 3-D</td><td>Dassault Syst&egrave; mes</td><td>SolidWorks 2003</td><td></td></tr><tr><td>impressora 3D</td><td>FormLab</td><td>Form2</td><td></td></tr><tr><td>tubos isolantes de poliimida 5.5mil</td><td>HPC Medical</td><td>72113900001-012</td><td></td></tr><tr><td>fita de folha de alumínio</td><td>Tyco</td><td>Tyco Adhesives 617022 fita de folha de alumínio</td><td>para a pasta condutora de cone de blindagem alternativa</td></tr><tr><td></td><td>YSHIELD</td><td>HSF54</td><td>para cone</td></tr> <tr><td>de blindagemparafusos personalizados para microdrive de sonda de silício</td><td>AMT</td><td>UNM1.25-HalfMoon</td><td>parafuso de aço inoxidável meia-lua, 1,5 mm de diâmetro, 300 &micro; m passo de rosca</td></tr><tr><td>personalizado para tetrode microdrive</td><td>AMT</td><td>Yamamoto_0000-160_9mm</td><td>parafuso de aço inoxidável ranhurado, 0,5 mm de diâmetro, 160 &micro; m passo de rosca, feito sob medida para o nosso design</td></tr><tr><td>acrílico dental</td><td>Stoelting</td><td>51459</td><td></td></tr><tr><td>resina modelo dental</td><td>FormLab</td><td>RS-F2-DMBE-02</td><td></td></tr><tr><td>Ferramenta rotativa Dremel</td><td>Dremel</td><td>modelo 800</td> uma broca <td>trituradora</td></tr><tr><td></td><td>Fine Science Tool</td><td>19007-05</td><td></td></tr><tr><td>placa de interface elétrica</td><td>Neuralynx</td><td>EIB-36-Narrow</td><td></td></tr><tr><td>epóxi</td><td>Devcon</td><td>GLU-735.90</td><td>5 minutos</td></tr><tr><td>pomada epóxi para os olhos</td><td>Pomada oftálmica</td><td>Dechra</td> Puralube <td>para evitar que os olhos dos ratos sequem durante a cirurgia</td></tr><tr><td>folha de polimento de fibra</td><td>Thorlabs</td><td>LFG5P</td><td>para polir a fibra óptica</td></tr><tr><td>pinças finas</td><td>Protech International</td><td>15-368</td><td>para carregar/recuperar a sonda de silício</td></tr><tr><td>ouro pinos</td><td>Neuralynx</td><td>EIB Pinos Pequeno</td><td></td></tr><tr><td>fio terra</td><td>A-M Systems</td><td>781500</td><td>0,010 polegada fio de prata nu</td></tr><tr><td>headstage pré-amplificador</td><td>Neuralynx</td><td>HS-36</td><td></td></tr><tr><td>medidor de impedância</td><td>BAK eletrônica</td><td>Modelo IMP-2</td><td>1 kHz frequência de teste</td></tr><tr><td>óleo mineral</td><td>ZONA</td><td>36-105</td><td>para lubrificação de parafusos e fios</td></tr><tr><td>fibra óptica</td><td>Doric</td><td>MFC_200/260-0.22_50mm_ZF1.25(G)_FLT</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de gravação</td><td>Neuralynx</td><td>Digital Lynx 4SX</td><td></td></tr><tr><td>escriba de fibra de rubi</td><td>Thorlabs</td><td>S90R</td><td>para clivar a graxa de silicone de fibra óptica</td></tr><tr><td></td><td>Fine Science Tool</td><td>29051-45</td><td></td></tr><tr><td>sonda de silício</td><td>Neuronexus</td><td>A1x32-Edge-5mm-20-177</td><td>Fig. 3, 4A, 4B, 5</td></tr><tr><td>sonda de silicone</td><td>Neuronexus</td><td>A1x32-6mm-50-177</td><td>Fig. 4C</td></tr><tr><td>solução de lavagem de sonda de silicone</td><td>Alcon</td><td>AL10078844</td><td></td></tr><tr><td>limpador de lentes de contato lubber de silicone</td><td>Smooth-On</td><td>Dragon Skin 10 FAST</td><td>para preparação de tinta prateada de molde de microdrive</td></tr><tr><td></td><td>GC eletrônico</td><td>22-023</td><td>impressão prateada II revestimento, usado para fios terra</td></tr><tr><td>parafuso de caveira</td><td>Otto Frei</td><td>2647-10AC</td><td>0,8 mm de diâmetro, 0,200 mm de rosca</td></tr><tr><td>tesoura cirúrgica padrão</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5880</td><td></td></tr><tr><td>aparelho estereotáxico</td><td>Kopf</td><td>Modelo 942</td><td></td></tr><tr><td>super cola</td><td>Loctite</td><td>LOC230992</td><td>para aplicação em postes de guia</td></tr><tr><td>pinças cirúrgicas</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5135</td><td></td></tr><tr><td>Tetrode Twister</td><td>Jun Yamamoto</td><td>TT-01</td><td></td></tr><tr><td>fios de tetrodo</td><td>Sandvik</td><td>PX000004</td><td></td></tr></tbody></table>

sistema híbrido do microdrive com a ponta de prova recuperável do opto-silicone e tetrode para a gravação high-density do duplo-local em ratos livremente moventes

Hybrid Microdrive System with Recoverable Opto-Silicon Probe and Tetrode for Dual-Site High Density Recording in Freely Moving Mice

As gravações neurais multiregionais podem fornecer informações cruciais para compreender as interações de escala de tempo fino entre várias regiões cerebrais. Entretanto, os projetos convencionais do Microdrive permitem frequentemente somente o uso de um tipo de elétrodo para gravar das únicas ou das regiões múltiplas, limitando o rendimento de únicas-unidade ou de gravações do perfil da profundidade. Ele também geralmente limita a capacidade de combinar as gravações de eletrodos com ferramentas optogenéticas para direcionar a atividade de caminho e/ou tipo de célula específica. Aqui apresentamos um array híbrido de Microdrive para ratos que se deslocam livremente para otimizar o rendimento e uma descrição de sua fabricação e reutilização da matriz de Microdrive. O projeto atual emprega nove tetrodes e uma ponta de prova do opto-silicone implantada em duas áreas diferentes do cérebro simultaneamente em ratos livremente moventes. O tetrodes e a sonda opto-silício são independentemente ajustáveis ao longo do eixo dorsoventral no cérebro para maximizar o rendimento das atividades unitárias e oscilatórias. Esta matriz de Microdrive também incorpora uma set-up de luz, mediando a manipulação optogenética para investigar as respostas específicas do tipo regional ou celular e funções de circuitos neurais de longo alcance. Além, a ponta de prova do opto-silicone pode com segurança ser recuperada e reúso após cada experimentação. Como a matriz de Microdrive consiste em peças impressas em 3D, o design de microdrives pode ser facilmente modificado para acomodar várias configurações. Descrito pela primeira vez é o projeto da matriz de Microdrive e como anexar a fibra óptica a uma sonda de silício para experimentos de optogenética, seguido pela fabricação do pacote tetrode e implantação da matriz em um cérebro do mouse. A gravação de potencialidades locais do campo e da unidade que spiking combinou com a estimulação optogenética igualmente demonstra a viabilidade do sistema da disposição do Microdrive em ratos livremente moventes.

A matriz de Microdrive foi construída dentro de 5 dias. A linha do tempo da preparação do Microdrive é descrita na tabela 2. Usando este Microdrive, nove tetrodes e uma sonda de silício foram implantados no hipocampal CA1 e MEC do mouse [21 semanas de idade/29 g peso corporal masculino pOxr1-CRE (C57BL/6 fundo)], respectivamente. Este rato transgênicas expressa CRE em neurônios piramidal da camada III de MEC. O rato foi injetado com 200 nL de AAV5-DIO-ChR2-YFP (Titer: 7,7 x 1012 GC/ml) no MEC ...

Este protocolo descreve a construção de uma matriz híbrida do Microdrive que permita a implantação de nove tetrodes independentemente ajustáveis e uma ponta de prova ajustável do opto-silicone em duas regiões do cérebro em ratos livremente moventes. Também é demonstrado um método para recuperar e reusar com segurança a sonda opto-silício para múltiplos propósitos.

Sistema híbrido do Microdrive com a ponta de prova recuperável do opto-silicone e tetrode para a gravação high-density do duplo-local em ratos livremente moventes

Multi-regional neural recordings can provide crucial information to understanding fine-timescale interactions between multiple brain regions. However, ...

Nosso design híbrido de microdrive permite que os experimentadores não apenas regis téramicos, mas também escolham diferentes tipos de eletrodos para otimizar o rendimento e a estabilidade. Combinamos nove tetrodes, uma sonda linear de silício e fibra óptica que são ajustáveis e reutilizáveis em uma matriz de microdrive para experimentos in vivo com ratos em movimento livre. Esta técnica pode ser facilmente adaptada a outros animais maiores, como ratos ou saguis.As sondas de silício são extremamente frágeis. Precisamos ter cuidado ao lidar com as sondas, por exemplo, ao adaptar a fibra óptica e ao girar o conjunto de transporte para o microdrive. A matriz de microdrive consiste em cinco partes.Para preparar o parafuso de microdrive para a sonda de silício primeiro imprima um padrão plástico do microdrive e coloque fita em torno do padrão para fazer uma parede temporária ao redor do padrão. Despeje gel de silício líquido no padrão e remova bolhas de ar com agitação suave. Quando o silício estiver curado, remova cuidadosamente o molde de gel de silício do padrão.Em seguida, use um moedor rotativo para cortar 18 e 9,5 mm de comprimentos de tubo de aço inoxidável de 23 medidores e use o moedor para endurecer a parte superior 2 a 3mm dos tubos. Aplique um pequeno volume de óleo de silício em um parafuso personalizado e ajuste os tubos e aparafuse no molde. Despeje acrílico dentário no molde e use uma seringa para eliminar quaisquer bolhas de ar ao redor dos tubos e do parafuso.Quando o acrílico dentário tiver curado completamente, remova o parafuso do microdrive do molde e use um alicate para dobrar 6mm de uma extremidade da ponta do fio de 18mm para um ângulo de 60 graus. Usando uma ferramenta de giro, gire o parafuso do microdrive para verificar a qualidade e, em seguida, instale o parafuso de microdrive na carroceria do microdrive e gire o parafuso para verificar se ele é capaz de se mover para cima e para baixo suavemente. Para preparar a nave auxiliar para a sonda de silício use uma tesoura afiada para cortar dois comprimentos de 5mm de PEEK e alinhar os tubos em ambos os lados da nave auxiliar.Cole os tubos na nave auxiliar com epóxi e aplique um pequeno volume de óleo de silício nos postos-guia. Quando o epóxi secar, coloque o transporte sobre os postes-guia do corpo de matriz de microdrive para verificar a qualidade. A nave deve se mover suavemente sem atrito excessivo.Para preparar o optorode use um cortador Rubi para cortar um pedaço de fibra óptica até 21mm de comprimento e moer a ponta de fibra até ficar plana e brilhante. Quando a ponta estiver pronta, coloque suavemente a fibra óptica na parte frontal da sonda de silício 200 a 300 micrômetros acima do topo dos locais do eletrodo e proteja temporariamente a fibra com fita transparente e cole a fibra óptica na base da sonda de silício com um pequeno volume de epóxi e deixe que o epóxi cure por cinco horas. Para anexar a nave auxiliar à sonda de silício aplique um pequeno volume de epóxi na parte de trás da base da sonda de silício e segure suavemente a parte inferior da nave auxiliar contra a base da sonda de silício por dois a três minutos para evitar a formação de uma lacuna entre a nave auxiliar e a base da sonda de silício.Quando o epóxi tiver curado completamente segure o sulco da nave com pinças finas e use um microscópio para colocar cuidadosamente os tubos de transporte nos postos-guia do corpo principal. Gire o parafuso para inserir o parafuso de microdrive no orifício do parafuso e insira a ponta do tubo em forma de L na ranhura da cabeça da nave auxiliar para engatar a sonda de silício e o parafuso de microdrive. Em seguida, corte dois parafusos número 0 para um comprimento de rosca de 3,5 mm e triture as pontas para remover as rebarbas.Coloque o suporte do conector da sonda no corpo da matriz e insira o conector elétrico da sonda de silício no suporte. Insira os parafusos número 0 para segurar o suporte do conector da sonda. Use epóxi para fixar o conector da sonda de silício no suporte, tomando cuidado para não colar a sonda no corpo do array microdrive.Para fixar o suporte da ferrule à sonda opto-silicon e ao corpo de matriz de microdrive, corte dois parafusos número 0 em um comprimento de rosca de 6 mm e triture as pontas. Triture a parte externa de duas porcas de parafuso de máquina número 0 para fazer pequenas porcas de hexálida com diâmetros externos de 2,5 a 3 mm e insira o parafuso número 0 no componente A do suporte. Cole as cabeças de parafuso com epóxi.Aplique um pequeno volume de graxa de silício nos componentes A e B para reduzir o atrito com o corpo. Use pinças inversas para inserir temporariamente o componente A no corpo e coloque o componente B sobre os parafusos do componente A.Coloque as porcas personalizadas nos parafusos e use um alicate para apertar as porcas para fixar o suporte da ferrula no corpo. Insira a ferrule de fibra no sulco do suporte de ferrule de fibra, tomando cuidado para que a ferrule de fibra esteja furando de 4 a 5 mm do suporte.Aplique uma pequena quantidade de epóxi entre a ferrula e o sulco do suporte. Quando o epóxi estiver curado, solte as porcas e gire o parafuso do microdrive para verificar a escote e o suporte da ferrula para um movimento suave, então confirme que a ponta da sonda se retrai completamente no corpo quando o suporte da ferrula estiver na posição superior e os tubos de transporte ainda estejam associados aos postes-guia. Para fixar o cone de proteção, aperte dois parafusos número 0 de 3,5 mm do lado de fora do cone para manter o microdrive no lugar.O conjunto de microdrives pode ser configurado dentro de cinco dias se a construção for concluída de acordo com o cronograma descrito na tabela. Após o ajuste do tetrode, o desempenho comportamental pode ser testado em uma pista linear e em um campo aberto. Em ambos os tipos de experimentos, o mouse é autorizado a explorar livremente por aproximadamente 30 minutos, enquanto os sinais eletrofisiológicos são gravados sem ruído severo relacionado ao movimento durante toda a sessão de gravação.A estimulação da luz pode então ser realizada no córtex entorhinal medial para estimular os neurônios do córtex entorhinal medial camada 3 que projetam para o subcampo CA1 do hipocampo. Atividades espontâneas de espeto e potenciais de campo locais são então registradas a partir dos tetrodes e da sonda de silício quando o rato está dormindo. Neste experimento representativo, os potenciais de campo esquerdo registrados nos tetrodes demonstraram grandes atividades de ondulação sugerindo que todos os tetrodes estavam posicionados nas proximidades da camada de células piramida CA1.As atividades responsivas induzidas pela luz neste ensaio foram observadas pela primeira vez no córtex entorhinal medial seguido de atividades dentro do CA1 com 13 a 18 milissegundos de latência. Tome cuidado para inserir a sonda opto-silicon no corpo de microdrive em um ambiente livre eletrostático. O Cone de blindagem pode ser substituído por materiais como uma folha de papel e fita.Isso diminuirá a taxa do microdrive em até 20% Nosso design de microdrive fornece opções flexíveis para uma combinação eficaz de eletrodos de gravação para medir e manipular múltiplas regiões cerebrais e investigar a dinâmica e interações de diferentes estruturas cerebrais.

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