Sistema tridimensional do ensaio da angiogênese usando spheroids da co-cultura dados forma pela colônia endothelial que dá forma a pilhas e às pilhas de haste mesenchymal

Este sistema esferoide de co-cultura 3D foi projetado para imitar angiogênese fisiológica. Será eficaz para avaliar potenciais moduladores angiogênicos e fornece informações previsíveis antes dos estudos in vivo. Este sistema utiliza esferoides de co-cultura formados por duas células progenitoras vasculares e pode ser usado para investigar interações celulares, brotos e a maturação tubular da angiogênese fisiológica.

Se pudermos usar células do paciente para formar esferoides de co-cultura, podemos usar esse sistema para desenvolver tratamentos personalizados para doenças anormais relacionadas à angiogênese, como o câncer. Este sistema de ensaios pode aumentar a sensibilidade e eficiência dos estudos de angiogênese e desenvolvimento de medicamentos. Comece usando 05% de trypsin-EDTA para desacoplar ECFCs e MSCs de 80 a 90% de culturas celulares confluentes por três ou cinco minutos em uma incubadora de cultura celular, respectivamente.

Inativar trippsina com meio DMEM completo fresco e pipeta as células algumas vezes para gerar uma única suspensão celular. Recolher as células por centrifugação, seguida de duas lavagens com meio livre de soro. Após a segunda lavagem, diluir os ECFCs para três vezes 10 para as seis células por mililitro de concentração média e os MSCs para duas vezes 10 para as seis células por milímetro de concentração média em tubos individuais de microcentrífuga individual de dois milímetros.

Pelotar as células por centrifugação, e aspirar cuidadosamente todos, exceto os últimos 15 a 25 microlitres de supernacer de cada amostra celular. Em seguida, resuspenque cada pelota em 250 microlitres de C diluído de um kit de corante fluorescente, e in pipeta suavemente as suspensões celulares para garantir uma dispersão completa. Adicione 250 microliters de 20 micromolars recém-preparados PKH67 ao tubo de ECFCs.

Adicione 250 microliters de 12-micromolar PKH26 ao tubo de MSCs. Misture imediatamente ambas as suspensões celulares. Depois de cinco minutos em temperatura ambiente com tremores, protegido da luz, pare o processo de coloração com uma incubação de um minuto em 0,5 mililitros de FBS por tubo.

No final da incubação, colete as células por centrifugação, e remova cuidadosamente o sobrenante, seguido por duas lavagens em dois mililitros de meio fresco completo por lavagem. Em seguida, suspenda as células em seu respectivo meio em tubos de 15 mililitros. Para a geração eferóide, após a segunda lavagem, primeiro diluir as suspensões celulares na concentração adequada de crescimento celular endotelial médio MV2 suplementado com solução de celulose de metila de 20% e concentração de soro bovino fetal de 5%.

Em seguida, adicione cada suspensão celular em um reservatório retangular de poliestireno esterilizado. Use uma pipeta multicanal para adicionar aproximadamente 125 gotículas de microliter de células na tampa de uma placa de cultura de 150 milímetros. Quando todas as células tiverem sido adicionadas, inverta a tampa sobre o fundo de um prato contendo 15 mililitros de PBS, e coloque as placas na incubadora de cultura celular por 24 horas.

No dia seguinte, enxágue as tampas do prato com cinco mililitros de PBS em um tubo de 50 mililitros por prato. Enxágüe as tampas com mais cinco mililitros de PBS para coletar quaisquer esferoides restantes, e pelota os spheroids por centrifugação. Descarte cuidadosamente todos, exceto os últimos 100 a 200 microlitres de supernadante, e bata suavemente na parede do tubo para que os esferoides sejam livremente suspensos no restante do supernatante.

Adicione o volume apropriado de crescimento de células endoteliais médio MV2 suplementado com soro bovino fetal de 5% e solução de celulose de 40% de metila a cada tubo para resuspencar os esferoides a 100 esferoides por mililitro de concentração média. Use uma ponta de pipeta de um mililitro cortada a um diâmetro de três a cinco milímetros para misturar suavemente as suspensões esferoides. Use uma nova pipeta de ponta larga, um mililitro para misturar a solução de suspensão esferoide com um gel de colágeno tipo I neutralizado a uma proporção de um para um no gelo.

Adicione 900 microliters de cada solução de gel de colágeno suspensa esferoide nos poços de uma placa pré-aquecida de 24 poços. Permitir que as suspensões polimerizem por 30 minutos na incubadora de cultura celular, antes de cobrir os esferoides com 100 microliters de crescimento celular endotelial médio MV2 suplementado com 2,5% FBS e 50 nanogramas por mililitro de VEGF para os eferóides somente ECFC e médio suplementado com FBS apenas para as culturas esferoletas MSC e ECFC-plus-MSC. Em seguida, coloque cada placa em um gravador de células em tempo real instalado em uma incubadora de cultura celular, e concentre-se aleatoriamente em cinco a dez esferoides em uma ampliação de 10x para monitorar a formação brotante de cada esferoide rotulado por fluorescência a cada hora durante 24 horas.

Para quantificar o broto de esferoide, importe os arquivos de imagem para ImageJ e meça o número e o comprimento dos brotos expressando o sinal fluorescente apropriado de cinco esferoides selecionados aleatoriamente por grupo experimental. Para os eferóides ECFC-plus-MSC, o número de brotos e o comprimento acumulado do broto são significativamente maiores em comparação com os de eferóides somente ECFC em todos os pontos de tempo. Os spheróides somente MSCs não formam brotos, mas demonstram uma migração individual do MSC fora dos esferoides.

A rotulagem de ECFC com corante verde-fluorescente e MSC com corante vermelho-fluorescente antes de combinar para gerar ecfc-mais-MSC spheroids demonstra que as estruturas de broto mediadas pelo ECFC são cobertas com MSCs, sugerindo que os MSCs combinados funcionam como células perivasculares durante a formação do broto, aumentando a estabilidade e durabilidade do broto pela associação apertada entre duas células vasculares. Os eferóides ECFC-plus-MSC pré-tratados com um inibidor de angiogênese mostram um número de broto reduzido e um comprimento cumulativo de broto de forma dependente de dose em comparação com os eferóides ECFC-plus-MSC. Em experimentos paralelos, os eferóides somente ECFC pré-tratados com o inibidor seguidos pela estimulação com VEGF também demonstram uma diminuição do número de broto induzido pelo fator de crescimento e comprimento cumulativo do broto de forma dependente de dose.

Note-se que é necessária uma maior concentração de inibidor de angiogênese para inibir epheroids ECFC-plus-MSC em comparação com eferóides somente ECFC. O crescimento tumoral é significativamente inibido em animais tratados com inibidores de angiogênese de alta dose em comparação com animais tratados com controle e animais com tratamento de angiogênese de baixa dose em um modelo de camundongos tumorais de xenerto humano. A concentração plasmática de bevacizumabe em camundongos tratados com alta dose foi de 568 mais ou menos 40,62 microgramas por mililitro, o que foi mais próximo do valor IC50 de bevacizumab para inibir o comprimento cumulativo de broto em ecfc-mais-MSC spheroids em vez de ecfc-somente spheroids.

Isso sugere que o sistema eferóide de co-cultura ECFC-plus-MSC é adequado para prever concentrações plasmáticas eficazes antes de um estudo animal. Usar uma pipeta de ponta larga de um mL para misturar suavemente os esferoides enquanto eles estão em gel de colágeno no gelo é importante para proteger a integridade dos esferoides. Podemos modificar este sistema para introduzir outros tipos de células, como células imunes e outras matrizes extracelulares para investigar o crosstalk da matriz celular durante a angiogênese.