Name: Perturbando a biomecânica endotelial via connexin 43 disrupção estrutural (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Aprenda a perturbar a connexina 43 para medir trações e tensões intercelulares em células endoteliais. Este método mecânico integra análises bioquímicas e biomecânicas em modelos de organ-on-chip para estudos de processos fisiopatológicos.

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Este trabalho foi apoiado pelos fundos de start-up da Universidade de Florida Central e pelo Instituto Nacional de coração, pulmão e sangue do Instituto Nacional de saúde o prêmio K25HL132098.

1. fazer géis de poliacrilamida (PA)
<ol><li>
Preparação do prato de Petri
	<ol>
<li>Prepare a solução de silano de ligamento misturando 200 ml de água ultrapura com 80 μL de ácido acético e 50 μL de 3-(trimetoxisililo) de metacrilato de propil. O silano do ligamento é uma solução usada para funcionalizar a superfície inferior de vidro do prato de Petri para o acessório do hidrogel.</li>
		<li>Mexa a solução de silano de ligação numa placa de agitação durante pelo menos 1 h.</li>
		<li>Trate bem o centro do prato de Petri com solução de silano de ligação por 45 min.</li>
		<li>Retire a solução de silano de ligação e enxague a placa de Petri com água ultra-pura 2x-3x.</li>
		<li>Seque a superfície do prato de Petri e armazene-a na temperatura ambiente para o uso futuro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação de solução de hidrogel
	<ol>
<li>Misture água ultrapura, 40% de acrilamida e 2% de bis-acrilamida em um tubo de centrífuga de 15 mL de acordo com a tabela 1.</li>
		<li>Adicionar 80 μL de grânulos fluorescentes à solução de hidrogel.</li>
		<li>Agitar suavemente o tubo para misturar grânulos com a solução de gel.</li>
		<li>Aperte levemente a tampa do tubo no tubo de centrifugação e coloque-a numa câmara de vácuo.</li>
		<li>Degas a solução de gel para pelo menos 45 min na câmara de vácuo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Polimerização hidrogel
	<ol>
<li>Em primeiro lugar, adicione 75 μL de persulfato de amónio a 10% (dissolvido em água ultra pura) e, em seguida, adicione 8 μL de TEMED (N, n, n', n'-tetramelethane-1,2-diamina) à solução de hidrogel.</li>
		<li>Colocar 24 μL de solução de hidrogel no centro do prato de Petri (ver tabela 2).</li>
		<li>Use uma lamínula de 18 mm para achatar o hidrogel. Isto dará uma altura de ~ 100 μm.</li>
		<li>Aguarde pelo menos 30-40 min para polimerização em gel.</li>
		<li>Mergulhe o hidrogel polimerizado em água ultrapura para evitar a desidratação do gel.</li>
		<li>Cubra a placa de Petri com a folha de alumínio para impedir photobranqueamento de grânulos fluorescentes e armazene em 4 ° c. Nota: os hidrogéis podem ser armazenados um período de até 3 meses, mas sugere-se que estes géis sejam usados não mais do que 1 semana após a fabricação para obter os melhores resultados.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. cultura celular
<ol><li>Cultura células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) em meio de cultura celular 200 (ver tabela de materiais) suplementado com 1% de penicilina-estreptomicina em 0,1% frascos revestidos com gelatina a 37 ° c e 5% co2.</li>
</ol>3. preparação do estêncil de micropattern
<ol><li>Cure uma fina camada de polidimetilsiloxano (PDMS) em um prato de Petri de 100 mm misturando a base de silicone com o agente de cura de silicone em uma proporção de 20:1 (base: agente de cura). Nota: é possível usar a outra base às relações do agente de cura (ex. 10:1 ou 30:1). Entretanto, uma base mais baixa à relação de agente de cura produzirá um teste padrão mais duro, quando uma base mais elevada à relação de agente de cura produzirá um teste padrão mais macio.</li>
	<li>Prepare um 20:1 (base: agente de cura) solução PDMS e misture cuidadosamente em um tubo de centrífuga de 50 mL. Inverta o tubo de cabeça para baixo e agitar vigorosamente várias vezes para garantir a mistura adequada da solução PDMS, como mistura não uniforme resultará em polimerização incompleta.</li>
	<li>Remover as bolhas que foram introduzidas a partir da etapa acima por centrifugação da solução PDMS por 1 min em 190 x g.</li>
	<li>Despeje 5-6 mL de solução PDMS no centro de uma placa de Petri de 100 mm e Agate o prato até que a solução PDMS cubra toda a superfície do prato de Petri.</li>
	<li>Cure a solução PDMS durante a noite em 50-60 ° c. O PDMS também pode ser curado à temperatura ambiente.</li>
	<li>Remova um estêncil circular de 16 mm de diâmetro PDMS com um perfurador de furo.</li>
	<li>Use um perfurador da biópsia para criar furos pequenos no estêncil de PDMS. Este protocolo usa um perfurador da biópsia do diâmetro de 1,25 milímetros.</li>
	<li>Esterilize stencils PDMS pela primeira submergir-los em 70% etanol por 2-3 min, aspirante a etanol em excesso e, em seguida, colocando uma luz UV por 5 min.</li>
</ol>4. colágeno-I revestimento de hidrogel
<ol><li>Retire a lamínula do hidrogel e aspirar qualquer excesso de líquido.</li>
	<li>Coloque o estêncil PDMS na superfície do hidrogel. Nota: os tweezers podem ser usados para aplicar a pressão clara ao estêncil de PDMS para assegurar um selo estanque entre o estêncil de PDMS e a superfície do hidrogel. Nossos stencils PDMS são estanques e, assim, impedem o acesso à água entre a superfície superior do gel e a superfície inferior do estêncil PDMS. Também, a rigidez do hidrogel não precisa de ser ajustada com respeito à rigidez de PDMS.</li>
	<li>Cubra a superfície do hidrogel com sulfosuccinimidyl-6-(4-azido-2-nitrophenylamino) hexanoato (sulfo-sanpah) dissolvido em uma solução tampão de 0,1 M de HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineetanoesulfonic) em uma concentração de 1:1000 e coloc um UV lâmpada (potência 36 W) por 8 min.</li>
	<li>Aspirar o excesso de solução de sulfo-SANPAH e HEPES e enxaguar o hidrogel duas vezes com 0,1 M HEPES seguidos por um adicional de duas lavas com água ultrapura.</li>
	<li>Aspirar o excesso de água ultra-pura e revestimento hidrogéis com 0,1 mg/mL de colágeno-I durante a noite a 4 ° c.</li>
	<li>Cubra os pratos e proteja os grânulos fluorescentes do fotobranqueamento. Nota: os stencils PDMS são usados para criar monocamada micropadronizada. Monocamadas micromodelados são utilizados como permitem múltiplas monocamada da mesma geometria e dimensões a serem observadas simultaneamente durante cada experimento. No entanto, se os micropatterns não forem desejados, as etapas acima podem ser seguidas com exceção da etapa 4,2.</li>
</ol>5. criação de monocamadas HUVEC em hidrogéis
<ol><li>Use 1x tripsina para separar as células de frascos de cultura de tecido para 3-5 min na incubadora.</li>
	<li>Após a trypsinization, adicione meios de cultura da pilha à solução do tripsina e adicione ao tubo de centrifugação de 15 ml.</li>
	<li>Centrifugue a solução da pilha por 3 minutos em 1710 x g. Uma pequena pelota branca de células deve ser visível na parte inferior do tubo de centrífuga.</li>
	<li>Aspirar o sobrenadante e ressuscite células em meios de comunicação para uma concentração de 50 x 104 células/ml.</li>
	<li>Retire o colágeno-I do hidrogel e enxague 1x com PBS.</li>
	<li>Adicione 75 x 103 células à parte superior do estêncil PDMS e permita que as células se fixem à superfície do hidrogel por pelo menos 1 h na incubadora a 37 ° c e 5% co2.</li>
	<li>Remova o estêncil PDMS e adicione pelo menos 2 mL de mídia à placa de Petri. Mergulhe o estêncil PDMS em tripsina 10x para remover todas as células anexadas e esterilizar por pulverização com etanol 70% e, em seguida, colocando a luz UV por 5 min.</li>
	<li>Coloque o prato de Petri na incubadora e aguarde pelo menos 36 h ou até que uma monocamada confluente seja observada.</li>
</ol>6.2, tratamento de 5 dihydroxychalcone para o rompimento Cx43
<ol><li>Dissolver 2,5 dihidroxichalcone (chalcone) em dimetilsulfóxido (DMSO) para fazer uma solução de 0,1875 mg/mL.</li>
	<li>Diluir a solução de ações com meios de cultura celular para fazer uma concentração de calcone baixo (0,2 μg/ml) alíquota e uma concentração alta de Chalcona (2 μg/ml) de alíquota.</li>
</ol>7. aquisição de dados
<ol><li>Localize ilhas de células com um microscópio.</li>
	<li>Adquira imagens de contraste e talão de fase para morfologia de células de imagem e deslocamentos de hidrogel, respectivamente. Nota: Este protocolo utilizou um objetivo de 10x para aquisição de dados.</li>
	<li>No final do experimento, separe as células com tripsina 10x e adquira uma imagem da superfície do gel sem células (imagem de referência).</li>
</ol>8. imunocoloração
<ol><li>Fixar monocamadas com formaldeído a 4% e incubar a 37 ° c durante 15 min.</li>
	<li>Remover 4% formaldeído e adicionar 0,2% Triton X-100 para 5 min a 37 ° c para permeabilizar as células.</li>
	<li>Remover 0,2% Triton X-100 e enxaguar monocamadas com PBS 2x-3x.</li>
	<li>Cubra monocamada com solução de albumina sérica bovina de 2% (BSA) por 45 min a 37 ° c.</li>
	<li>Retire a solução 2% BSA e enxague monocamada com PBS 2x-3x.</li>
	<li>Adicione o anticorpo Cx43 preliminar em uma concentração de 1:400 à amostra e incubar durante a noite em 4 ° c.</li>
	<li>Remova a amostra preliminar do anticorpo e da enxaguadura com PBS 2x-3x.</li>
	<li>Adicionar anticorpo secundário a uma concentração de 3:200 e incubar por 2 h a 37 ° c. Nota: as amostras devem ser cobertas para evitar o fotobranqueamento.</li>
	<li>Remova o anticorpo secundário e enxague com PBS 2x-3x.</li>
	<li>Cubra a amostra com meio de montagem (Fluromount-G DAPI) e sele com um deslizamento da tampa de 18 milímetros.</li>
</ol>9. implementação de microscopia de força de tração (TFM) e microscopia de tensão monocamada (MSM)
<ol><li>
Cálculo de deformação por hidrogel Observação: um procedimento de cálculo de deslocamento passo a passo usando o MATLAB é fornecido abaixo.<ol>
<li>Abra o arquivo Traction. m principal no MATLAB (para todas as rotinas do MATLAB consulte materiais complementares). Observação: siga as instruções fornecidas no código para definir o diretório MATLAB.</li>
		<li>Defina as seguintes variáveis: formato de imagem, conversão de pixel para mícron, módulo de Young, razão de Poisson e objetivo de microscópio.</li>
		<li>Localize o talão, a imagem de tripsina e a imagem de fase usando a sub-rotina Openfiles . Observação: para grandes conjuntos de dados, é melhor nomear arquivos em ordem sequencial. Por exemplo, os arquivos devem ser nomeados "FileName1. tif", "filename2. tif", etc.</li>
		<li>Defina um ROI quadrado (região de interesse) ao redor do monocamada de célula e execute a sub-rotina cell_cropper para recortar a imagem original.</li>
		<li>Execute a subrotina displacement_finder para calcular deslocamentos.</li>
		<li>Execute a subrotina Dedrift para remover quaisquer deslocamentos não-celulares adicionais que possam ser devidos à deriva do estágio do microscópio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Computação de trações Observação: aqui, trações sem restrições são calculados usando nossa rotina de MATLAB personalizado-escrito. A computação de tração passo a passo usando a rotina do MATLAB mencionada anteriormente é dada abaixo.<ol>
<li>Defina as seguintes variáveis dentro da rotina Traction. m : condição de contorno, espessura do gel, altura do gel, e dedrift.</li>
		<li>Execute a sub-rotina traction_finder para calcular trações e executar a sub-rotina plot_traction para plotar traçamentos. Todas as trações em x-Direction (TX) e y-Direction (Ty) junto com seus locais de pixel correspondentes podem ser encontradas em um arquivo Traction. dat que será gerado pelo código.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cálculo de tensões intercelulares Observação: instruções passo a passo para computação de estresse intercelular usando a rotina MATLAB mencionada anteriormente são fornecidas abaixo.<ol>
<li>Execute a sub-rotina mark_circular_domain para especificar o limite de monocamada. Essa rotina solicitará todas as imagens de fase recortadas sequencialmente para que o usuário desenhe manualmente um limite ao redor da monocamada. Mantenha uma nota dos nXPts gerados na janela de comando e use-os mais tarde como parâmetros da grade no eixo X e no eixo de Y para a análise de FEM (veja a etapa 9.3.2).</li>
		<li>Execute Run_StressCode para calcular tensões intercelulares. Esta sub-rotina lê diretamente os parâmetros do arquivo "model.in" e executa "Island. exe" para realizar a análise FEM. Antes de executar esta rotina, certifique-se de todos os parâmetros no arquivo Model.in , ou seja, os parâmetros de grade em X e Y, pixel para mícron de conversão, módulo de Young do gel, a razão de Poisson, monocamada altura, e monocamada padrão (tira ou buraco), são editados Corretamente.</li>
		<li>Plotar todos os resultados FEM usando a sub-rotina plot_FEM_results . Nota: todos os resultados gerados serão automaticamente armazenados na pasta Results no diretório MATLAB.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Nosso grupo, assim como outros, tem sido com sucesso usando TFM e msm para sondar a influência de junções Cell-Cell em vários processos celulares patológicos e fisiológicos in vitro7,15,18,27 . Por exemplo, Hardin et al. apresentaram um estudo muito perspicaz que sugere a transmissão do estresse intercelular orienta a formação de Gap paracelular nas células endoteliais15...

O campo que se refere ao estudo dos efeitos das forças físicas e das propriedades mecânicas na fisiologia e patologia celular e tecidual é conhecido como mecanobiologia1. Algumas técnicas úteis que têm sido utilizadas na mecanobiologia são A microscopia de estresse monocamada e A microscopia de força de tração. A microscopia da força da tração permite a computação dos trações gerados na relação da pilha-carcaça, quando a microscopia de esforço do monocamada permitir a computação de tensões intercelular geradas entre pilhas adjacentes dentro de um monocamada2 ,3,4,5,6. Os resultados obtidos a partir de métodos anteriores sugeriram que as tensões mecânicas derivadas de células desempenham um papel crucial na determinação do destino de uma série de processos celulares3,4,5. Por exemplo, após a exposição a uma força mecânica externa, um grupo de células migrando como um coletivo pode alterar sua morfologia e polarizar sua forma de alinhar e migrar ao longo da direção da força aplicada, em parte, gerando tracções7, a 8. As tracções fornecem uma métrica que pode ser usada para avaliar a contratilidade celular e são calculadas usando a microscopia de força de tração (TFM). A microscopia de força de tração (TFM) começa com a determinação de deformações de substrato induzidas por células seguidas pelo cálculo do campo de tração usando uma abordagem computacional matematicamente rigorosa e baseada em mecânica. Uma vez que a capacidade de calcular trações tem sido em torno de algum tempo, os pesquisadores têm utilizado TFM para revelar as tracções de impacto têm em uma série de processos, incluindo o câncer9, cicatrização de feridas10 e avaliação de engenharia cardíaca tecido11.
A implementação de TFM e MSM juntos pode ser dividida em três etapas essenciais que devem ser executadas na seguinte ordem: primeiro, as deformações de hidrogel produzidas pelas células são determinadas; segundo, os trações são recuperados das deformações do hidrogel; e em terceiro lugar, uma aproximação do elemento finito é usada para computar tensões intercelular normais e da tesoura dentro da monocamada inteira. Para computar deslocamentos do gel, as imagens do grânulo da fluorescência com pilhas foram comparadas com a imagem do grânulo da referência (sem pilhas) usando uma rotina costume-escrita da Velocimetria da imagem da partícula (PIV). O tamanho da janela de correlação cruzada e a sobreposição para a análise de PIV foram escolhidos para 32 x 32 pixels e 0,5, respectivamente. Neste momento, os deslocamentos de pixel foram convertidos em mícrons multiplicando-se com um fator de conversão de pixel a mícron (para nosso microscópio, esse fator de conversão é 0,65) para obter deslocamentos no plano. Erros associados a ignorar deslocamentos fora do plano são negligenciáveis12,13. Após a computação de deslocamentos do gel, há dois tipos de medidas da tração que podem ser utilizadas, trações restringidos e trações unrestringidos8,14. As tracções não restritas fornecem o campo de tração para todo o campo de visão (incluindo regiões com e sem células), enquanto as tracções restritas fornecem o campo de tração somente para regiões que incluem células14. Em seguida, as tensões intercelulares são calculadas usando a microscopia de estresse monocamada (MSM), que é uma extensão da microscopia de força de tração. A implementação de MSM baseia-se na suposição de que as tracções locais exercidas por uma monocamada de células na interface de substrato celular devem ser equilibradas por forças mecânicas transmitidas entre células na interface célula-célula, conforme exigido pelas leis de Newton7 ,12,13. Uma suposição chave aqui é que o monocamada da pilha pode ser tratado como uma folha elástica fina porque a distribuição da tração no monocamada é sabida e o contrapeso da força não depende das propriedades do material da pilha. Outra suposição fundamental é que as forças de tração são equilibradas por tensões intercelulares locais dentro do campo óptico de visão (dentro da monocamada) e a influência desse equilíbrio de força é mínima na região distal (fora da monocamada)13. Portanto, as condições de contorno definidas por tensões intercelulares, deslocamentos ou uma combinação de ambos no limite de monocamada são cruciais para executar MSM13. Tendo em conta as informações acima, utilizamos MSM para realizar uma análise de elementos finitos (FEM) para recuperar a tensão principal máxima (σmáx) e tensão principal mínima (σmin) girando o plano de tensão em cada ponto dentro do monocamada. Estas tensões principais são usadas subseqüentemente para computar a 2D tensão intercelular normal média [(σMax + σmin)/2] e o esforço intercelular do cisalhamento máximo 2D [(σMax -σmin)/2] dentro da monocamada inteira 12,13. Este procedimento é descrito com mais detalhes por tambe et al.12,13
A microscopia de estresse monocamada (MSM) permite o cálculo das tensões intercelulares celulares geradas dentro de uma monocamada6,7,8,12,13. Essas tensões intercelulares têm sido sugeridas para serem importantes para o crescimento e reparo tecidual, cicatrização de feridas e metástase oncológica12,15,16,17. Além disso, as tensões intercelulares têm sido sugeridas para também serem importantes namigração de célulasendoteliais e na função da barreira endotelial17,18. Quando as junções da pilha-pilha tais como junções apertadas e junções dos aderens tiverem sido sugeridas para jogar um papel crítico na geração e na transmissão intercelular endoteliais do esforço, o papel de junções da abertura permanece indescritível. As junções da abertura conectam fisicamente pilhas adjacentes e fornecem um caminho para a corrente elétrica e as moléculas (< 1 kDa) para passar entre as pilhas vizinhas19,20,21. Embora as células endoteliais expressem Cx37, Cx40 e Cx43 junções Gap19,22, Cx43 é indiscutivelmente o mais importante em termos de progressão da doença23. Evidências de Cx43's importância podem ser encontradas no fato de que o apagamento genético de Cx43 em camundongos resulta em hipotensão24 e tem efeitos adversos na angiogênese25. Além disso, Cx43 tem sido documentado para ser importante para a migração e proliferação celular e na progressão da aterosclerose18,22,23,24,25 .
Neste protocolo, utilizou-se TFM e HSH para investigar se a tração e a geração de estresse intercelular dentro do confluente, monocamada endotelial seriam impactadas pelo rompimento da junção de Gap endotelial Cx43. Nós interrompemos Cx43 com 2,5-dihydroxychalcone (chalcone), uma molécula documentada para inibir Cx43 expressão26. Chalcona foi usado para interromper Cx43 em vez de siRNA como o Chalcona foi relatado previamente por Lee et al. para interromper Cx43 expressão26. Além disso, estávamos particularmente interessados na influência do chalcone no endotélio, pois também foi relatado como um composto anti-inflamatório e antiplaquetário que pode potencialmente ser usado para a prevenção e tratamento de vários patologias26. Os tratamentos com chalcone foram realizados uma hora após o início do experimento, monocamadas tratados com chalcone foram fotografados por um total de seis horas, e o processamento de imagens foi realizado com um código MATLAB personalizado para determinar tracções e, subsequentemente, intercelular Salienta. Nossos resultados mostraram uma diminuição total em trações e em tensões intercelular, sugerindo que Cx43 Jogue um papel chave na biomecânica endothelial.

<table><tbody><tr><td>lamínula de 18 mm</td><td>ThermoFisher</td><td>18CIR-1</td><td>Essencial para achatar géis de poliacrilamida</td></tr><tr><td>2% bis-acrilamida</td><td>BIO-RAD</td><td>1610143</td><td>Componente do gel de poliacrilamida</td></tr><tr><td>2&prime;,5&prime;-Dihidroxichalcona</td><td>SIGMA</td><td>IDF00046</td><td>Para perturbar a estrutura Cx43</td></tr><tr><td>3-(Trimetoxissilil)metacrilato de propila</td><td>SIGMA</td><td>2530-85-0</td><td>Solução de estoque para ligar a mistura de silano com ácido acético e água ultrapura</td></tr><tr><td>40% Acrilamida</td><td>BIO-RAD</td><td>1610140</td><td>Componente do gel de poliacrilamida</td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Fisher-Sceintific</td><td>64-19-7</td><td>Essencial para fazer ligar solução salina</td></tr><tr><td>Alexa Fluro 488 cabra anti-rato IgG;</td><td>Catálogo ThermoFisher</td><td># A-11001</td><td>Anticorpo secundário</td></tr><tr><td>Persulfato de amônio</td><td>BIO-RAD</td><td>1610700</td><td>Agente polimerizante em gel de poliacrilamida</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>SIGMA</td><td>9048-46-8</td><td>Para fazer solução de bloqueio</td></tr> Solução <tr><td>de Atelocolágeno Bovino Tipo I, 3 mg/mL, 100 mL</td><td>Advance Biomatrix</td><td>5005-100ML</td><td>Use como matriz</td></tr> <tr><td>extracelularCorning Cell Culture Phosphate Buffered Saline (1x)</td><td>Fisher-Sceintific</td><td>21040CV</td><td>Buffer Saline necessário para cultura de células</td></tr><tr><td>Dimetil Sulfóxido, Fisher BioReagents</td><td>Fisher-Sceintific</td><td>67-68-5</td><td>Para dissolver chalcone e fazer solução estoque</td></tr><tr><td>Fluoromount-G com DAPI</td><td>ThermoFisher</td><td>00-4959-52</td><td>Meio de montagem para imunostaing usado para corar para DAPI</td></tr><tr><td>Microesfera fluroscente Grânulos modificados com carboxilato</td><td>ThermoFisher</td><td>F8812</td><td>Grânulos modificados com carboxilato de 0,5 mícron (vermelho), solução</td></tr><tr><td>tampão HEPES</td> de 2% de sólidos 1 M <td>SIGMA</td><td>7365-45-9</td><td>Essencial para</td></tr><tr><td>LVES</td><td>ThermoFisher</td><td>A1460801</td><td>Essential HUEVC meio 200 suplemento</td></tr><tr><td>Medium 200</td><td>ThermoFisher</td><td>M200500</td><td>Essential para cultura</td></tr> <tr><td>de células HUVECAnticorpo monoclonal Cx43 de camundongo (CX - 1B1)</td><td>Catálogo ThermoFisher</td><td>#13-8300</td><td>Anticorpo primário para placa de Petri Cx43</td></tr><tr><td>(35 mm de diâmetro)</td>Placa de Petri <td>CellVis</td><td>D35-20-1.5H</td><td>de 35 mm com um poço central de 20 mm</td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH Crosslinker 100 mg</td><td>Proteochem</td><td>102568-43-4</td><td>Essencial para funcionalizar a superfície do gel de poliacrilamida</td></tr><tr><td>Kit de elastômero de silicone SYLGARD 184</td><td>DOW corning</td><td>2646340</td><td>Elastômero de silício com agente de cura para fazer PDMS</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>BIO-RAD</td><td></td> 1610801 <td>Agente polimerizante em gel de poliacrilamida</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>SIGMA</td><td>9002-93-1</td><td>Para permeabilizar células</td></tr><tr><td>Tripsina -EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>25300054</td><td>Usado para separar células</td></tr></tbody></table>

perturbando a biomecânica endotelial via connexin 43 disrupção estrutural

Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption

As células endoteliais foram estabelecidas para gerar tensões e tracções intercelulares, mas as junções de Gap de papel desempenham no estresse intercelular endotelial e a geração de tração é atualmente desconhecida. Conseqüentemente, nós apresentamos aqui um protocolo mecânica-baseado para sondar a influência do conexina 43 da junção da abertura (Cx43) tem na biomecânica endothelial expondo monocamadas endothelial confluente a um inibidor conhecido do Cx43 2, a 5-dihydroxychalcone (chalcone) e medir o impacto que este inibidor tem sobre tracções e tensões intercelulares. Nós apresentamos resultados representativos, que mostram uma diminuição em ambos os trações e tensões intercelular uma dosagem elevada do Chalcona (2 μg/ml) quando comparado ao controle. Este protocolo pode ser aplicado a não apenas Cx43, mas também outras junções de Gap, assumindo que o inibidor apropriado é usado. Acreditamos que este protocolo será útil nos campos da pesquisa cardiovascular e mecanobiologia.

As imagens de contraste de fase de controle, 0,2 μg/ml e 2 μg/ml de monocamadas tratados com Chalcona foram realizadas 30 minutos antes do tratamento com Chalcona (Figura 1A-C) e 2 horas após o tratamento com Chalcona (Figura 1D-F). Os deslocamentos de esferas induzidas por células (μm) foram observados para diminuir tanto no Chalcona de dose baixa quanto nas condições de Chalcona de alta dose (<...

Aqui, apresentamos um protocolo baseado em mecânica para interromper a junção de Gap conexina 43 e medir o impacto subsequente que isso tem sobre a biomecânica endotelial através da observação de tracções e tensões intercelulares.

Perturbando a biomecânica endotelial via connexin 43 disrupção estrutural

Endothelial cells have been established to generate intercellular stresses and tractions, but the role gap junctions play in endothelial intercellular ...

Este protocolo é significativo, pois permite a elucidação do papel que as forças celulares desempenham em muitos processos fisiológicos e patológicos, como a cicatrização de feridas e metástases cancerígenas, por exemplo. A principal vantagem desta técnica baseada em mecânica é sua capacidade de interromper simultaneamente as junções celular-célula e medir seu impacto sobre as forças mecânicas geradas por células, principalmente traçãos e estressores intercelulares. Nosso protocolo é aplicável a uma ampla gama de processos fisioterapêutos, como metástases cancerígenas, atheroscleroses e hipertensão, por exemplo.Nossos métodos podem ser integrados para realizar análises bioquímicas e biomecânicas com modelos de órgãos em chip, construções de tecidos bio-projetados, sistemas de entrega de medicamentos in vitro e sistemas de cocultura tecidual. Nosso protocolo é bastante simples de executar. No entanto, aconselhamos aqueles que fazem este protocolo pela primeira vez a ter paciência e não correr pelas etapas deste protocolo.Nosso protocolo tem etapas únicas que podem não ser claras para os usuários iniciantes. Por isso, encorajamos os usuários a seguir nossos procedimentos passo a passo escritos e usar demonstrações visuais como orientação. Para começar, prepare a solução de silano cego misturando 200 mililitros de água ultra pura com 80 microliters de ácido acético e 50 microliters de metacrilato de silano.Mexa a solução bind-silane em uma placa de mexida por pelo menos uma hora. Trate o poço central de uma placa de Petri com a solução Bind-silane por 45 minutos. Remova a solução Bind-silane e enxágue a placa de Petri com água ultra pura duas a três vezes.Seque a superfície da placa de Petri e armazene à temperatura ambiente para uso futuro. Para preparar a solução de hidrogel, misture 12,49 mililitros de água ultra pura a 2.062 mililitros de 40% de acrilamida e 375 microlitadores de 2%bisacrilamida em um tubo centrífuga de 15 mililitros. Adicione 80 microliters de contas fluorescentes à solução de hidrogel.Agite suavemente o tubo para misturar as contas com a solução de gel. Mantenha a tampa solta no tubo de centrífuga e coloque-a em uma câmara de vácuo. Desaum o gel solução por pelo menos 45 minutos na câmara de vácuo.Para polimerizar o hidrogel, primeiro adicione 75 microlitadores de persulfato de 10% de amônio e, em seguida, adicione oito microliters de TEMED à solução de hidrogel. Coloque 24 microliters da solução de hidrogel no centro da placa de Petri. Pressione o hidrogel com uma tampa de 18 milímetros para achatar o hidrogel e fazer uma altura de aproximadamente 100 micrômetros.Aguarde pelo menos 30 a 40 minutos para polimerização de gel. Submergir o hidrogel polimerizado em água ultra pura para evitar a desidratação do gel. Cubra a placa de Petri com papel alumínio para evitar o fotobleaching de contas fluorescentes e armazene a quatro graus Celsius.Primeiro, misture a base de silicone PDMS com o agente de cura de silicone em uma proporção de 20 para um em um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Inverta o tubo de cabeça para baixo e agite vigorosamente várias vezes para garantir a adequada mistura da solução PDMS. Remova as bolhas na solução PDMS centrifugando por um minuto a 190 vezes G.Despeje de cinco a seis mililitros da solução PDMS no centro de uma placa de Petri de 100 milímetros e agitar a placa até que a solução PDMS cubra toda a superfície da placa de Petri.Cure a solução PDMS durante a noite a 50 a 60 graus Celsius. Em seguida, remova um estêncil PDMS de diâmetro circular de 16 milímetros com um perfurador de furos. Use um perfurado de biópsia de 1,25 milímetros de diâmetro para criar pequenos orifícios no estêncil PDMS.Esterilize os estêncil PDMS submergindo-os em 70% de etanol por dois a três minutos, aspirando o excesso de etanol e, em seguida, colocando sob uma luz UV por cinco minutos. Aspire qualquer excesso de líquido e remova o deslizamento da tampa do hidrogel. Coloque o estêncil PDMS na superfície do hidrogel e use pinças para aplicar pressão leve ao estêncil PDMS para garantir uma vedação à base de água entre o estêncil PDMS e a superfície do hidrogel.Cubra a superfície do hidrogel com Sulfo-SAMPA dissolvido em solução tampão HEPES molar de 0,1 molar a uma concentração de 1 a 1.000 e coloque o hidrogel sob uma lâmpada UV com potência de 36 watts por oito minutos. Aspire o excesso de solução Sulfo-SAMPA e HEPES e enxágue o hidrogel duas vezes com HEPES molar 0,1 seguido de duas enxágues adicionais com água ultra pura. Aspire o excesso de água ultra pura e use uma pipeta de 200 microliter para revestir o hidrogel com 0,1 miligramas por mililitro de Colágeno-1.Cubra o prato para proteger as contas fluorescentes de fotobleaching e armazene o hidrogel a quatro graus Celsius durante a noite. Agora, adicione três mililitros de 1X Trypsin no frasco e coloque-o na incubadora a 37 graus Celsius por três a cinco minutos para separar as células do frasco de cultura tecidual. Após a experimentação, adicione três mililitros de mídia de cultura celular no frasco, redemoinho para misturar e transfira a mistura em um tubo de centrífuga de 15 mililitros.Centrifugar a solução celular por três minutos a 1.710 vezes G.Aspire o supernasce e suspenda as células na mídia para uma concentração de 50 vezes 10 às quatro células por mililitro. Retire o prato de hidrogel da geladeira. Remova o Colágeno-1 do hidrogel e enxágue uma vez com PBS.Adicione 75 vezes 10 às terceiras células ao topo do estêncil PDMS e permita que as células se conectem à superfície do hidrogel por pelo menos uma hora na incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Remova o estêncil PDMS e submerse o estêncil PDMS em Trypsin 10X por 10 a 15 segundos para remover todas as células anexadas. Adicione pelo menos dois mililitros de mídia à placa de Petri e esterilize o estêncil pulverizando com 70% de etanol e, em seguida, colocando sob a luz UV por cinco minutos.Coloque a placa de Petri na incubadora por pelo menos 36 horas, ou até que uma monocamada confluente seja observada. Imagens de contraste de fase de 30 minutos antes do tratamento de chalcone e duas horas após o tratamento de chalcone foram comparadas. Os deslocamentos de contas induzidos por células foram observados para diminuir tanto em condições de chalcone de baixa dose quanto em altas doses quando comparados às monocamadas huvec de controle.Antes do tratamento de chalcone, as traçãos RMS eram em torno de 51 Pascals para todas as condições. Após o tratamento de chalcone, houve um pequeno aumento nas traçãos RMS para 59 Pascals em monocamadas tratadas com baixa dose e uma redução de quase duas vezes nas trações RMS para 18 Pascals em monocamadas tratadas com alta dose em comparação com o controle. O tratamento chalcone aumentou a magnitude média normal do estresse intercelular com baixa dose, mas diminuiu significativamente a magnitude média normal de estresse intercelular com alta dose quando comparado ao controle.O tratamento de chalcone também diminuiu as tensões intercelulares máximas tanto na baixa quanto na alta concentração de chalcone quando comparado ao controle. O impacto do tratamento chalcone é estatisticamente significativo com base tanto nos testes T quanto no teste ANOVA de fator único. Ao colocar estêncil PDMS em cima do gel, certifique-se de que o gel está seco o suficiente para garantir uma vedação apertada entre o estêncil PDMS e o gel.Este protocolo também pode ser aplicado para sondar a contribuição biomecânica de uma variedade de junções células células, proteínas citoesqueletal, moléculas de adesão da matriz celular ou moléculas extracelulares com imagens vivas. Com este protocolo in vitro, os pesquisadores agora podem investigar com sucesso uma série de propriedades biomecânicas, bem como propriedades bioquímicas durante a reparação de tecidos, cicatrização de feridas ou metástases de câncer sem modelo animal. Aconselhamos nossos espectadores a serem muito cuidadosos ao manusear chalcone e DMSO, pois a inalação dessas drogas é relatada como prejudicial.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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