Name: Células-tronco derivadas virais AG-specific T da haste suprimir a replicação de HBV em ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Aprenda a transferência de células adotivas de linfócitos T específicos de antígeno viral derivados de iPSC para suprimir a replicação do HBV em camundongos. Este método oferece uma base para imunoterapia celular.

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Os autores agradecem o Dr. Adam J Gehring do Instituto de pesquisa do hospital geral de Toronto para fornecer cDNA para HBs183-91 (s183) (FLLTRILTI)-específico a2-restringiu genes TCR híbridos humanos-murine, e Dr. Pei-Jer Chen da Universidade Nacional de Formosa para fornecer construção de pAAV/HBV 1,2. Este trabalho é apoiado pelo Instituto Nacional de saúde Grant R01AI121180, R01CA221867 e R21AI109239 para J. S.

Todos os experimentos com animais são aprovados pelo Comitê de cuidados com animais da Universidade do Texas a & M (IACUC; #2018-0006) e são conduzidos em conformidade com as diretrizes da Associação para a avaliação e acreditação de cuidados com animais de laboratório. Os camundongos são usados durante 6 – 9 semanas de idade.
1. geração de células de t CD8+ específicas virais AG de iPSCs (células t IPSC-CD8+ )
<ol><li>Criação dos construtos retrovirais Nota: os genes TCR α e β estão ligados à sequência de autoclivagem 2A. O vetor retroviral mscv-ires-dsred (MIDR) é dsred+ 23.<ol>
<li>Subclone HBs183-191 (flltrilti)-específico a2-restrito humano-murine híbrido TCR (s183 TCR) genes (vα 34 e Vβ28) no MIDR para criar a construção de MIDR S183 (Figura 1a)25.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transdução anti-retroviral Nota: as células Platinum-E (Plat-E) são utilizadas para a embalagem de retrovírus (portadores de genes TCR s183), que serão utilizados para a transdução anti-retroviral. As pilhas de plat-E são as pilhas de empacotamento eficazes do retrovírus que são subjacentes às pilhas 293T, que foram desenvolvidas por meio das construções de empacotamento originais através do promotor EF1α para expressar a proteína retroviral da estrutura, incluindo a mordaça, o pol, e o env ecotropic.<ol>
<li>Em um prato da cultura de 100 milímetros, sementes 3 x 106 Plat-E pilhas em 8 ml do meio de cultura de DMEM que contem o soro fetal da vitela de 10% (FCS) em uma incubadora em 37 ° c com 5% co2, 1 dia antes do transfection.</li>
		<li>No dia 0, transfecção a construção de s183 MIDR nas pilhas de plat-E usando um reagente25do transfection do ADN.</li>
		<li>No dia 1, semente 1 x 106 iPSCs (GFP+) em uma placa de cultura pré-revestida de gelatina.</li>
		<li>Nos dias 2 – 3, colete o sobrenadante contendo retrovírus da cultura de células Plat-E para transduce iPSCs com o s183 TCR na presença de solução de 1,6-dibromohexano25.</li>
		<li>No dia 4, Trypsinize o s183 TCR gene-transfoiado iPSCs, centrifugador em 400 x g para 5 minutos e semente 3 × 105 iPSCs em um prato da cultura de 100 milímetros pré-revestido com 3 x 106 pilhas de alimentador SNL76/7 (irSNL76/7) irradiados25.</li>
		<li>No dia 5 ou 6 de confluência, Trypsinize as células, centrífuga em 400 x g por 5 min e processo de triagem celular. Gating em pilhas vivos, classifica GFP e DsRED pilhas dobro-positivas (os iPSCs gene-transduados de s183 TCR) usando um classificador de alta velocidade da pilha. Similar à etapa 1.2.5, coculture as pilhas classificadas em irSNL76/7 pilhas do alimentador para o uso futuro25.</li>
	</ol></li>
	<li>Diferenciação de células T iPSC-CD8+ específicas do HBV Nota: as pilhas stromal OP9-DL1/DL4 sobre-expressão ambos os ligantes do entalhe DL1 e DL4, e cocultivando iPSCs com os iPSCs podem promover a diferenciação sinalização-negociada entalhe da pilha de T26.<ol>
<li>Cultivar s183 TCR (s183/iPSCs) em monocamada de células OP9-DL1-DL4 em meio médio essencial (MEM) contendo 20% de soro bovino fetal (FBS)27. Inclua murino Flt3 ligante (mflt-3L; concentração final = 5 ng/ml) na cultura.</li>
		<li>No dia 0, semente 0,5 – 1,0 x 105 S183/iPSCs em um prato de cultura de 10 cm previamente cultivado com células OP9-DL1-DL4. Valide que as células OP9-DL1-DL4 estão em uma condição de confluência de 80% – 90%.</li>
		<li>No dia 5, enxágüe os iPSCs com 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS), Aspire o PBS, acrescente-o a 4 mL de 0,25% de tripsina e incubar em uma incubadora de 37 ° c por 10 min. depois, adicione um adicional de 8 mL de mídia iPSC para acabar com a digestão de tripsina. Acumule todas as soluções digestivas contendo as células e Centrifugue a 400 x g por 5 min a 15 – 30 ° c.</li>
		<li>Aspirar o sobrenadante e suspender as células em 10 mL de meios de comunicação iPSC. Transfira a suspensão celular para uma nova placa de Petri de 10 cm e incubar em uma incubadora por 30 min a 37 ° c.</li>
		<li>Após 30 min, colete a mídia iPSC contendo as células flutuantes. Passe a suspensão da célula através de um filtro de células de 70 μm e calcule o número da célula.</li>
		<li>Sementes 5 x 105 células no prato de cultura previamente cultivadas OP9-DL1-DL4 células com uma condição de 80% – 90% confluente como descrito na etapa 1.3.1. Nota: para diferenciação de células T, cada 2 – 3 dias, as células derivadas de iPSC precisam re-SEED com uma camada fresca das células OP9-DL1-DL4.</li>
	</ol></li>
	<li>Avaliação<ol>
<li>Alterações morfológicas de diferenciando iPSCs<ol>
<li>Observe as células um microscópio em vários dias. Nota: no dia 5, as colônias têm características mesoderma-like, exibindo uma morfologia clássica da eixo-forma que assemelha-se aos fibroblasto dérmicos humanos e ao crescimento sustentado in vitro. No dia 8, pequenos aglomerados redondos de células começam a aparecer.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Análise de diferenciando iPSCs por citometria de fluxo<ol>
<li>Em vários dias de cocultura, analisar células derivadas de iPSC como descrito anteriormente25 (Figura 1B, C).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Análise funcional de diferenciando iPSCs<ol>
<li>No dia 28 da cocultura, colete células T iPSC-CD8+ de culturas através da colheita das células flutuantes, Trypsinize as células remanescentes com 0,25% tripsina, re-suspender em 8 ml de mídia IPSC, centrifugar por 5 min em 400 x g em 15-30 ° c, retire a mídia, em seguida, ressuscite as células em 10 mL de mídia.</li>
			<li>Mantenha as pilhas re-suspendidas em um prato fresco de 10 cm em uma incubadora de 37 ° c por 30 minutos e monte as pilhas de flutuação. Em seguida, lave as células um vezes com um PBS frio.</li>
			<li>Incubar 3 x 106 T células-empobrecido esplenócitos (CD4-CD8-) de baços de H-2 classe I knockout, HLA-a 2.1-transgenic (HHD) camundongos com 5 μm s183 peptídeo (flltrilti) em 200 μL de mídia a 4 ° c por 30 min.</li>
			<li>Produza uma mistura de células t de IPSC-CD8+ com esplócito pulsado com peptídeo s183 (células t: esplenócitos = 1:4; Use 0,75 x 106 células t). Incubar a mistura de células a 37 ° c em uma incubadora de CO2 para 40 h. Durante os últimos 7 h, adicione 4 μL de brefeldin A diluído na cultura (concentração final de 1.000 x, que será diluída em meios de cultura 1x) para bloquear os processos de transporte durante a ativação celular.</li>
			<li>Manchar as células e realizar a análise citométrica do fluxo de IFN-γ intracelular como descrito anteriormente (Figura 2).</li>
		</ol>

</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. indução da replicação do HBV através da entrega hidrodinâmica de plasmídeo VHB
Nota: a construção de pAAV/HBV 1.2 foi gerada como descrita previamente9. O DNA completo do HBV 1,2 é incorporado no vetor pAAV.
<ol><li>Entregas hidrodinâmicas de plasmídeo VHB através da veia cauda<ol>
<li>Aqueça camundongos HHD usando uma lâmpada de calor por 5 min na gaiola, a fim de dilatar a veia cauda.</li>
		<li>Deter o animal por meio de um refreador, e as caudas limpas do rato com 70% de spray de etanol.</li>
		<li>Entrega de plasmídeo no fígado.</li>
		<li>Meça o peso corporal do mouse usando uma escala de medição.</li>
		<li>Diluir 10 μg de plasmídeo VHB no equivalente a 8% de PBS em massa corporal (por exemplo, 1,6 mL para um rato de 20 g). Carregue o plasmídeo diluído numa seringa de 3 mL com uma agulha hipodérmica de 26 G × 1⁄2"(0,45 × 12 mm).</li>
		<li>Localize uma das duas veias da cauda lateral no terço médio da cauda e posicione a agulha em qualquer veia lateral. Administrar a injeção contendo plasmídeo VHB através da veia cauda dentro de 3-5 s.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quantificação da viremia do soro sanguíneo de camundongos infectados Nota: a replicação do HBV ocorre a partir do dia 3 – 35 no soro do rato. Os picos de replicação de DNA no dia 7 e reduz gradualmente. O DNA do HBV não é liberado do soro até o dia 35.<ol>
<li>Coleção do soro de sangue dos ratos contaminados<ol>
<li>Colete aproximadamente 0,1 mL de sangue em um tubo de microcentrífuga de cada mouse em 3, 5, 7 e 10 dias após a infecção por sangramento retroorbital em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, em seguida, incubar à temperatura ambiente (RT) por 20 min.</li>
			<li>Centrifugue a amostra a 6.000 x g durante 15 min a 4 ° c e colete o sobrenadante sérico após a centrifugação.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Purify o ADN do soro de sangue usando um jogo comercialmente disponível da extração do ADN que segue as recomendações do fabricante. Resumidamente, lyse as células em uma coluna à base de sílica, executar as lavas, e extrair o DNA, acrescentando 100% etanol para a coluna de eluição e centrifugação em 6000 x g por 1 min. elute o dna em 50 μL de água RNase-livre.</li>
		<li>Use 100 ng de DNA de HBV da eluição para a análise do PCR do tempo real. Use os seguintes primers e sondas: forward 5 ' TAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGG 3 '; Reverse 5 ' GCACAGCTTGGAGGCTTGT 3 '; sonda 5 ' TCACCTCTGCCTAATC 3 '.<ol>
<li>Use o genoma do HBV contendo plasmídeo (pAAV/HBV 1.2) para a curva padrão e realize PCR em tempo real em um volume total de 10 μL (Figura 3).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Configure a reação de PCR em um volume total de 10 μL, conforme mostrado na tabela 1.</li>
		<li>Configurar o programa do PCR no termociclador como mostrado na tabela 2. A taxa de transição programada da temperatura é 20 ° c/s para a desnaturação/recozimento e 5 ° c/s para a extensão. Meça a fluorescência na extremidade da fase de recozimento para cada ciclo para a monitoração do PCR do tempo real.</li>
	</ol>

</li>
</ol>3. redução da replicação do HBV por ACT de células T de iPSC-CD8+ específicas virais AG
<ol><li>Transferência de células adoptivas (ACT)<ol>
<li>Diferenciar s183/iPSCs (1.3.7) sobre as células OP9-DL1-DL4 estromal na presença de mFlt-3L e mIL-7 por 8 dias, conforme descrito na seção 1,3.</li>
		<li>No dia 22, colete células T iPSC-CD8+ da placa de 10 cm com tripsina, em seguida, lave e ressuscite cada placa de 10 cm em 10 ml de mídia fresca. Adicione as pilhas a uma placa fresca de 10 cm e retorne à incubadora por 30 minutos como feito na seção 1,3. Após 30 min, colete células flutuantes.</li>
		<li>Use um filtro de nylon de 70 μm para passar as células para eliminar clusters de células e contar o número da célula. Adapte as células a uma concentração de 1,5 x 107 células/ml em solução de PBS a frio e use um filtro de nylon de 70 μm para passar as células para eliminar clusters de células novamente, se necessário. Mantenha as células no gelo até o ACT.</li>
		<li>Injete 200 μL de suspensão celular (3 x 106 células) em camundongos HHD de 4 – 6 semanas de idade através da veia cauda.</li>
	</ol></li>
	<li>Indução da replicação do HBV<ol>
<li>No dia 14 após a transferência celular, realize a entrega hidrodinâmica do plasmídeo VHB através da veia cauda, conforme descrito na seção 2,1.</li>
	</ol></li>
	<li>Detecção de proteínas de vírus do fígado infectado<ol>
<li>Sacrifique camundongos nos dias 3, 5, 7, 14 e 21 pós-infecção. Para a eutanásia, em cada gaiola, use 1 – 2 L de dióxido de carbono (CO2) na primeira etapa. Quando o animal desenvolve a perda de consciência, ganhe a taxa de fluxo de CO2 em torno de 4 – 5 L/min. Realize a eutanásia do rato usando a inalação do co2 .</li>
		<li>Separe o fígado cortando a pele da superfície do peritônio que utiliza tesouras e fórceps e arrastando ligeiramente o fígado para trás para descobrir a pele interna que alinha a cavidade peritoneal. Colete e corte amostras de fígado (comprimento x largura x altura = 0,5 cm x 0,5 cm X 0,3 cm) dos camundongos infectados para caber facilmente na gaveta de incorporação e bloco em formalina tampão neutro de 10% para 4 – 24 h.</li>
		<li>Descalcificar o fígado samplesusing 2,5 M ácido fórmico; Enxaguar em xileno por 3 min, enxaguar 2x em 100% etanol, enxaguar 2x em 95% etanol, enxaguar 2x em água deionizada (DI) por 2 min, em seguida, descalcificar as amostras de fígado em 1 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) correspondentemente. Manusear a uma temperatura de sub-ebulição (90 ° c) durante 20 min.</li>
		<li>Resfrie os tecidos fixos do fígado por 30 min. Enxague os tecidos com 1X PBS por 4 min e incorpore os tecidos em parafina. Desidratar os tecidos em uma série de concentrações crescentes de etanol para substituir a água, e depois mergulhar na imersão de xileno. Incorporar os tecidos infiltrados em blocos de cera. Faça o corte uniformemente vertical e horizontal para manchar. Prepare secções de 4 μm com um micrótomo deslizante.</li>
		<li>Passar as seções através da desparaffinização e reidratação usando xileno e etanol, em seguida, executar a coloração imunofluorescente das seções.</li>
		<li>Manchar as secções com 200 μL de anticorpos específicos para a superfície do HBV (1:100 diluição na solução de bloqueio). Incubar as seções com o anticorpo para 2 h em RT em uma câmara umidificada de 75% – 100%, e lave 5x em 1X PBS por 5 min.</li>
		<li>Use um reagente anti-fade contendo 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) para coloração nuclear para neutralizar as lâminas. Adicione a lamínula com cerca de 300 μL da solução de coloração DAPI diluída (300 nM em 1X PBS) e valide toda a cobertura coberta. Mantenha os slides no escuro a 4 ° c até a inspeção um microscópio fluorescente.</li>
	</ol></li>
	<li>Infiltração de células inflamatórias em camundongos infectados<ol>
<li>Sacrifique camundongos como descrito na etapa 3.3.1. Colete o fígado e faça seções conforme descrito na etapa 3.3.4.</li>
		<li>Manchar a seção com hematoxilina e eosina (H & E) para avaliar a infiltração de células inflamatórias no fígado.</li>
		<li>Armazene corrediças no escuro em 4 ° c até uma análise mais adicional um microscópio fluorescente.</li>
		<li>Visualize slides um microscópio de fluorescência para detectar a infiltração de células inflamatórias no fígado (Figura 4).</li>
	</ol></li>
	<li>Deteção do ADN de HBV do fígado contaminado<ol>
<li>Isolamento do DNA viral.</li>
		<li>Eutanizar camundongos e recolher as amostras de fígado de acordo com a seção 3,3.</li>
		<li>Lyse os tecidos hepáticos no tampão de Lise Nonindet P-40 (NP-40) (50 mM TRIS-HCL, 1 mM EDTA, 1% NP-40) contendo um cocktail inibidor da protease.</li>
		<li>Centrifugue momentaneamente em 16.000 x g para remover os núcleos e os restos da pilha.</li>
		<li>Incubar o lisado citoplasmático com nuclease micrococcal (nuclease S7; 150 unidades/mL) e CaCl2 (5 mm) a 37 ° c por 90 min para degradar o ácido nucleico fora dos nucleocapsídeos (NCS).</li>
		<li>Inative a nuclease S7 pela adição de 10 mM de EDTA.</li>
		<li>Precipeie os nucleocapsídeos com polietileno glicol (PEG), interrompa por 0,5% Dodecil sulfato de sódio (SDS), e digerir com 0,6 mg/ml proteinase K (PK) a 37 ° c por 1 h.</li>
		<li>Recupere os ácidos nucleicos virais pela extração de clorofórmio fenol e precipitação de etanol.</li>
		<li>Resolva o DNA viral extraído em um gel de agarose de 1,2% e detecte pela análise padrão do Southern blot usando uma sonda de DNA HBV com rótulo de32 P.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Haque, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-derived+tissue-associated+regulatory+T+cells+suppress+the+activity+of+pathogenic+cells+in+autoimmune+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation+Insights%22%5BJournal%5D)">Stem cell-derived tissue-associated regulatory T cells suppress the activity of pathogenic cells in autoimmune diabetes.</a> Journal of Clinical Investigation Insights. , (2019).</li>
<li>Chisari, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+pathological+effects+of+synthesis+of+hepatitis+B+virus+large+envelope+polypeptide+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Structural and pathological effects of synthesis of hepatitis B virus large envelope polypeptide in transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 84 (19), 6909-6913 (1987).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo apresenta um método para gerar o IPSC-CTLs AG-específico viral para o uso como o ato para suprimir a replicação de HBV em um modelo murino. Na infecção crônica por HBV, o genoma viral forma um mini cromossomo estável, o DNA circular covalentemente fechado (cccDNA) que pode persistir ao longo da vida útil do hepatócito. Alvejar o afastamento do mini cromossoma viral pode conduzir a uma cura da infecção crônica de HBV. A terapia antiviral atual visa a transcriptase reversa do vírus, mas raramente estabelece ...

Após a infecção aguda, o sistema imunológico adaptativo (i.e., imunidade humoral e celular) controla a maior parte da hepatite aguda relacionada ao HBV. Ainda, um número de povos nas regiões HBV-endêmicas não pode eliminar os vírus e subseqüentemente converter como indivíduos crônicos. Mais de 25% dos pacientes crônicos (> 250 milhões de pessoas) em todo o mundo desenvolvem doença hepática progressiva, resultando em cirrose hepática e/ou carcinoma hepatocelular (HCC)1. Como resultado, a erradicação de células insistentemente infectadas permanece um problema geral de salubridade, embora haja uma vacina disponível2 e inúmeros medicamentos antivirais estão em desenvolvimento. O tratamento padrão para a infecção pelo HBV inclui análogos de IFN-α, nucleósidos e nucleotídeo. Estes agentes têm a atividade antiviral direta e capacidades modulatórias imunes. No entanto, a soroconversão do antígeno de HBe (AG)+ portadores com anticorpo anti-HBe (AB) e a perda de ácido deoxirribonucleico do HBV SÉRICO (DNA) aparecem individualmente em aproximadamente 20% dos pacientes tratados, e o controle imunológico total do vírus verificada pela privação do HBsAg não é superior a 5%3. Além disso, a resposta ao tratamento muitas vezes não é durável. A vacinação profiláctica com HBs recombinante AG é altamente eficaz em impedir a infecção, mas a vacinação terapêutica de HBs Ag não é eficaz. Claramente, as respostas imunes mediadas por células T desempenham um papel crítico no controle da infecção pelo HBV e comprometimento hepático; no entanto, em pacientes com hepatite crônica, as células T HBV-reativas são freqüentemente excluídas, disfuncionais ou convertem exaustos4,5,6. Consequentemente, em indivíduos com infecção persistente por HBV, nenhuma tentativa de restabelecer a imunidade específica do HBV (i.e., imunidade à base de células T) por meio de remédio antiviral, citocinas imuno-modulatórias ou imunização curativa alcançaram sucesso.
A transferência celular adotiva (Act) de células T específicas do HBV AG é um tratamento eficiente direcionado para eventualmente erradicar os hepatócitos remanescentes wih HBV7,8. O ato de CTLs HBV-específicos em ratos HBV-contaminados foi mostrado para causar a hepatite transiente, suave, e uma gota dramática em transcritos do ácido ribonucleico de HBV (RNA) nos hepatocytes. Nesses estudos, a CTLs não inibiu a transcrição dos genes do HBV, mas melhorou a degradação das transcrições do HBV9. As CTLs específicas do HBV são importantes para prevenir a infecção viral e mediar a depuração do HBV10,11. Para remédios baseados em ato, a expansão in vitro de células T específicas do HBV com alta reatividade para a reinstalação in vivo tem sido sugerida como um método ideal12,13,14; no entanto, as abordagens atuais são restritas em relação às suas habilidades para gerar, separar e cultivar quantidades e qualidades apropriadas de células T específicas do HBV de pacientes para as terapias potenciais.
Embora os ensaios clínicos apresentem segurança, praticidade e atividade terapêutica prospectiva de tratamentos à base de células por meio de células T projetadas que são específicas para hepatócitos infectados pelo vírus HBV, há preocupações sobre os efeitos desfavoráveis ocorrendo das respostas auto-imunes por causa do cross-Reactivity doreceptor de célulaT de misemparelhamento (TCR)15,16, reconhecimentodo AG do fora-alvo pelo TCR17 não específico e em-alvo fora-toxicidade por um receptor quimérico de AG (carro) 18 anos de , 19 com tecidos saudáveis. Atualmente, as células T geneticamente modificadas, que só têm persistência a curto prazo in vivo, são geralmente células T intermediárias ou posteriores. Até o momento, as células-tronco pluripotentes (PSCs) são a única fonte disponível para gerar alto número de células T ingênuas de tipo único AG-específico20,21,22,23. Os PSCs induzidos (iPSCs) são convertidos simplesmente das pilhas somáticas de um paciente com o uso da transdução do gene de diversos fatores da transcrição. Como resultado, os iPSCs apresentam características semelhantes às das células-tronco embrionárias (ESCs)24. Devido à flexibilidade e possibilidade para a capacidade infinita de autorenovar, além da reposição tecidual, tratamentos baseados em iPSC podem ser amplamente aplicados na medicina regenerativa. Além disso, os regimentos subjacentes iPSCs podem substancialmente melhorar terapias Cell-Based atuais.
O objetivo geral deste método é gerar uma grande quantidade de CTLs específicos do HBV de iPSCs (ou seja, iPSC-CTLs) para imunoterapia baseada em ACT. As vantagens sobre técnicas alternativas são que iPSC-CTLs específico do HBV têm um único-tipo TCR e phenotype ingênuo, que conduz a mais desenvolvimento da pilha de T da memória após o ato. É demonstrado que o ACT de iPSC-CTLs específicos do HBV aumenta a migração de células T CD8+ funcionais no fígado e reduz a replicação do HBV em ambos os fígados e sangue de camundongos administrados. Este método revela um uso potencial de iPSC-CTLs AG-específicos virais para a imunoterapia de HBV e pode ser adaptado para gerar outras pilhas AG-específicas virais de iPSC-T para a imunoterapia viral.

<table><tbody><tr><td>Camundongos HHD</td><td>Institut Pasteur, Paris, França</td><td></td><td>Nocaute H-2 classe I, camundongos HLA-A2.1-transgênicos (HHD)</td></tr><tr><td>iPS-MEF-Ng-20D-17</td><td>RIKEN Cell Bank</td><td>APS0001</td><td></td></tr><tr><td>SNL76/7</td><td>ATCC</td><td>SCRC-1049</td><td></td></tr><tr><td>OP9</td><td>ATCC</td><td>CRL-2749</td><td></td></tr><tr><td>pAAV/HBV1.2 plasmídeo</td><td>Dr. Dr. Pei-Jer Chen (Hospital Universitário Nacional de Taiwan, Taiwan)</td><td></td><td>Construção de DNA do HBV</td></tr><tr><td>HBs183-91 (s183) (FLLTRILTI) genes TCR específicos</td><td>Dr. Adam J Gehring (Toronto General Hospital Research Institute, Toronto, Canadá)</td><td></td> <td>Genes TCR híbridos humano-murinos restritos a A2 específicos de FLLTRILTI (V &alfa; 34 e V&beta; 28)</td></tr><tr><td>OVA257&ndash; Genes TCR específicos para 264</td><td>Dr. Dario A. Vignali (Universidade de Pittsburgh, PA)</td><td></td><td>Genes TCR restritos a H-2Kb específicos do SIINFEKL</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CD3 (17A2)</td><td>Biolegend</td><td>100236</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CD44 (IM7)</td><td>BD Pharmingen</td><td>103012</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CD4 (GK1.5)</td><td>Biolegend</td><td>100408</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CD8 (53-6.7)</td><td>Biolegend</td><td></td><td></td>100732</tr><tr><td>Anti-IFN-&gama; (XMG1.2) anticorpo</td><td>Biolegend</td><td>505810</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TNF-a (MP6-XT22) anticorpo</td><td>Biolegend</td><td>506306</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>A10490-01</td><td></td></tr><tr><td>Anti-HBs Anticorpo</td><td>Thermo Fisher</td><td>MA5-13059</td><td></td></tr><tr><td>ACK Tampão de lise</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B7651</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>ABCD1234</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH3007.01</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria Classificador de células de fusão</td><td>BD</td><td>656700</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>MilliporeSigma</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>GeneJammer</td><td>Agilent</td><td>204130</td><td></td></tr><tr><td>HLA-A201-HBs183-91-PE pentâmero</td><td>Proimune</td><td>F027-4A - 27</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secundário anti-rato HRP</td><td>Invitrogen</td><td>A27025</td><td></td></tr><tr><td>mFlt-3L</td><td>Peprotech</td><td>250-31L</td><td></td></tr><tr><td>mIL-7</td><td>Peprotech</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease S7</td><td>Roche</td><td>10107921001</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>MilliporeSigma</td><td>P6148-500G</td><td>Cuidado: Alergênico, carcenogênico,</td></tr><tr><td>tóxico Tampão de permeabilização</td><td>Biolegend</td><td>421002</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>MilliporeSigma</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>ProLong&trade; Mountant Antifade Dourado com DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp MinElute Virus Spin Kit</td><td>Qiagen</td><td>57704</td><td></td></tr></tbody></table>

células-tronco derivadas virais ag-specific t da haste suprimir a replicação de hbv em ratos

Stem Cell-Derived Viral Ag-Specific T Lymphocytes Suppress HBV Replication in Mice

A infecção pelo vírus da hepatite B (HBV) é uma questão de saúde global. Com mais de 350 milhões pessoas afetadas em todo o mundo, a infecção pelo HBV continua sendo a principal causa de câncer hepático. Esta é uma grande preocupação, especialmente nos países em desenvolvimento. A falha do sistema imunitário para montar uma resposta eficaz de encontro ao HBV conduz à infecção crônica. Embora a vacina HBV está presente e novos medicamentos antivirais estão sendo criados, a erradicação das células de vírus-reservatório continua a ser um grande tema de saúde. Descrito aqui é um método para a geração de antígeno viral (AG)-linfócitos T citotóxicos CD8+ específicos (CTLs) derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) (ou seja, IPSC-CTLs), que têm a capacidade de suprimir a replicação do HBV. A replicação de HBV é induzida eficientemente nos ratos através da injeção hidrodinâmico de um Plasmid da expressão de HBV, de paav/HBV 1.2, no fígado. Então, a superfície de HBV AG-específico iPSC-CTLs do rato é transferida adoptivamente, que suprime extremamente a replicação de HBV no fígado e no sangue assim como impede a expressão da superfície AG de HBV nos hepatocytes. Este método demonstra a replicação de HBV nos ratos após a injeção hidrodinâmico e que os CTLs AG-específicos virais derivado da pilha de haste podem suprimir a replicação de HBV. Este protocolo fornece um método útil para a imunoterapia de HBV.

Como mostrado aqui, as células de T de iPSC-CD8+ específicas do HBV viral AG são geradas por um sistema de cultura in vitro. Após o ato destas pilhas AG-específicas virais de T IPSC-CD8+ suprimir substancialmente a replicação de HBV em um modelo murino (arquivo suplementar 1). Os IPSC do rato são transfomeados com a construção retroviral de MIDR que codifica um gene híbrido do HBV TCR do humano-rato (HBS183-191-specific, s183), a seguir os iPSCs gene-transvados são cocult...

Aqui apresentamos um protocolo para a supressão efetiva da replicação do vírus da hepatite B (HBV) em camundongos utilizando a transferência de células adotivas (ACT) de linfócitos T específicos de antígenos virais derivados de células-tronco (AG). Este procedimento pode ser adaptado para a imunoterapia baseada em ACT potencial da infecção por HBV.

Células-tronco derivadas virais AG-specific T da haste suprimir a replicação de HBV em ratos

Hepatitis B virus (HBV) infection is a global health issue. With over 350 million people affected worldwide, HBV infection remains the leading cause of ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave na transferência celular adotiva da célula T específica de antígeno viral derivada do iPSC para uma supressão eficaz da replicação do HBV em camundongos. A principal vantagem desta técnica é que as células T específicas de antígeno viral derivadas do iPSC têm um receptor de células T de um único tipo e fenótipo ingênuo. Para diferenciação de células T iPSC cd8-positivas específicas do HBV, placa s183 T receptor de células transduced iPSCs em uma monocamada OP9-DL1/DL4 em meio alfa-mínimo complementado com soro bovino 20% fetal e ligante murine Flt3 para sua co-cultura em uma incubadora de cultura celular.Monitore a co-cultura regularmente para avaliar a morfologia celular. No dia 28, remova as células supernacantes e flutuantes, e desprende as células aderentes com 0,25% de trippsina. Quando as células tiverem levantado do fundo do recipiente de cultura, pare a reação enzimática com oito mililitros do meio iPSC e colete as células por centrifugação.Resuspend a pelota em 10 mililitros de meio fresco. Diluir as células para uma célula T CD8-positiva derivada do iPSC para quatro s183 peptídeo-pulsed splenocyte razão para uma incubação de 40 horas na incubadora de cultura celular. Durante as últimas sete horas, adicione quatro microliters de brefeldin diluído A à cultura, para bloquear os processos de transporte durante a ativação celular.Manche as células para análise citométrica de fluxo das citocinas intracelulares de interesse de acordo com os protocolos padrão. Para a entrega plasmida de HBV hidrodinâmica através da veia traseira, diluir 10 microgramas de HBV plasmid em um equivalente de 8% da massa corporal de PBS. Carregue o plasmídeo em uma seringa de três mililitros equipada com uma agulha de 26 bitolas e 1/2 polegada por mouse.Aqueça os ratos de HHD sob uma lâmpada de calor por cinco minutos para dilatar as veias da cauda e puxe cuidadosamente um rato em um conterrante plástico. Localize uma veia traseira lateral dilatada no terço médio da cauda, e insira a agulha paralela à veia para entregar todo o volume de plasmídeo através da veia da cauda durante um período de três a cinco segundos. Para a transferência de células adoção de células T cd8-positivas derivadas de antígeno viral, colete as células T iPSC CD8-positivas no dia 22 da cultura, como demonstrado, e semee as células em um novo prato de cultura celular de 10 centímetros.Após 30 minutos na incubadora de cultura celular, filtre as células flutuantes através de um coador de nylon de 70 micrômetros e conte as células viáveis. Diluir as células para um 1,5 vezes 10 para as sete células por mililitro de concentração de PBS. Injete 200 microliters de células em camundongos HHD individuais de quatro a seis semanas de idade, na veia da cauda como apenas demonstrado.No dia 14, após a transferência celular, realize uma entrega plasmida de HBV hidrodinâmico como demonstrado. Nos pontos finais experimentais apropriados pós-infecção, colhia o fígado de cada animal infectado, e corte os fígados em amostras de tecido de 0,5 por 0,5 por 0,3 centímetros. Coloque as amostras em formalina tampão 10% neutra por quatro a 24 horas, seguida de decalcificação em ácido fórmico de 2,5 molar por seis a 24 horas.Em seguida, enxágue as amostras em xileno por três minutos, seguido por duas enxaguas de dois minutos em 100% etanol, 95% etanol e água deionizada. Após a última lavagem de água, decalcifique os tecidos em EDTA de um mililitro a 90 graus Celsius, seguido por uma incubação de 30 minutos à temperatura ambiente. Quando o tecido tiver esfriado, enxágue as amostras em PBS por quatro minutos e use xileno e etanol para desparafinar e reidratar as amostras.Para rotulagem imunofluorescente, colora as seções com 200 microliters de anticorpo específico de antígeno da superfície HBV por duas horas à temperatura ambiente em uma câmara de 75 a 100% umidificada. No final da incubação, lave as amostras com cinco lavagens de cinco minutos em PBS fresco para cada lavagem. Rotule as células com DAPI de acordo com os protocolos padrão antes de montar os slides com tampas para imagem por microscopia de fluorescência.Para análise imunohistoquímica, colorir as seções com hematoxilina e eosina de acordo com os protocolos padrão, e avaliar a infiltração de células inflamatórias no fígado por microscopia leve. A análise citométrica de fluxo da população CD8-positive derivada do IPSC revela que a transdução do receptor de células HBV T aumenta drasticamente a geração de células T cD8-positivas específicas do SPSC. Após a estimulação com esplenócitos t-esgotados pulsados com peptídeo s183, as células T derivadas do CD8 CD8 single-positive iPSC produzem grandes quantidades de gamma interferon, detectadas pela análise citométrica de fluxo intracelular e ELISA.Após a infecção pelo HBV por injeção hidrodinâmica, a replicação do DNA atinge o pico no sexto dia e reduz gradualmente, como observado pela análise pcr em tempo real. Além disso, a replicação viral é significativamente reduzida em todos os pontos de tempo em camundongos que recebem células T específicas antigênicas do HBV em comparação com camundongos que recebem células de controle. A proteína superficial HBV também é substancialmente diminuída em camundongos que recebem linfócitos citotóxicos pré-iPSC específicos do IPSC do HBV em comparação com camundongos tratados com células de controle, demonstrando claramente que as células T iPSC cd8 positivas específicas do antígeno viral têm a capacidade de reduzir a replicação do HBV em um modelo murino.Agora você deve ter uma boa compreensão de como gerar células T específicas de antígeno viral a partir de iPSC para imunoterapia adotiva.

stem-cell-derived-viral-ag-specific-t-lymphocytes-suppress-hbv

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Um protocolo rápido, simples e de baixo custo para a geração de doador-derivado multivirus específico CTLs (rctl) para infusão de células-tronco hematopoéticas alogênico transplante (TCTH) destinatários em risco de desenvolver infecções CMV, EBV ou Adv. Este processo de fabricação é compatível com GMP e deve garantir a mais ampla implementação de T-cell imunoterapia além de centros especializados.

Geração de células T específicas Multivirus para Prevenir / tratar infecções virais após transplante de células-tronco hematopoéticas alogênico

Aqui descrevemos a prática de fabricação primeiro (BPF) compatível com método de produção de vírus específicos linfócitos T citotóxicos (CTL) de sangue de cordão umbilical, fonte de células T predominantemente ingênua.

Expandindo linfócitos T citotóxicos do sangue do cordão umbilical que citomegalovírus Target, vírus de Epstein-Barr, e Adenovirus

O vídeo demonstra um ensaio usando células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSC) Essas células T, projetadas com receptores específicos do HBV, são transferidas para camundongos transgênicos. Os plasmídeos do genoma do HBV competentes para replicação são então injetados diretamente no fígado, permitindo a captação do DNA viral. Uma vez que os antígenos virais são expressos e apresentados por moléculas híbridas de MHC-I, as células T modificadas reconhecem e se ligam a esses...

Suprimindo a replicação do vírus da hepatite B usando células T específicas do antígeno viral

Este protocolo descreve os métodos na construção de um modelo humanizado de camundongo medula óssea/fígado/timo com imunidade projetada baseada em células-tronco contra a infecção pelo HIV.

De células-tronco Baseado Imunidade Engineered contra infecção por HIV no modelo humanizado mouse

Aqui, descrevemos um protocolo para analisar o fenótipo de células T reguladoras (Treg) isoladas de camundongos infectados pelo vírus da coriomeningite linfocítica ingênua e crônica. Além disso, fornecemos um processo para avaliar a atividade supressora das células Treg.

Fenotípica e análise funcional de células reguladoras T ativadas isolados de ratinhos infectados com o vírus da coriomeningite linfocítica crônica

Descrevemos aqui um vírus da hepatite B recentemente desenvolvido sistema de repórter (HBV) para monitorar as fases iniciais do ciclo de vida do HBV. Este simplificado sistema in vitro irá ajudar no rastreio de agentes anti-HBV, utilizando uma estratégia de alto rendimento.

Desenvolvimento de um Sistema Reporter vírus da hepatite B de acompanhar as fases iniciais do ciclo de replicação

Este protocolo descreve o uso da única cadeia de MHC classe I complexos para investigar interações moleculares na ativação de células T CD8 + humana: geração de engenharia apresentadoras de celulas que expressam cadeia única constrói, cultura de clone humano de células T CD8 + e experimentos de ativação de células T.

Uso da tecnologia de MHC única cadeia para investigar Co-Genealogia na ativação de células T humanas CD8 +

Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para infecção pelo vírus da Hepatite B (HBV) em novas células 293T (293T-NE-3NRs, expressando NTCP humano, HNF4α, RXRα e PPARα) e células hepáticas tradicionais (HepG2-NE, expressando NTCP humano).

Modelagem da infecção por vírus da hepatite B em células não hepáticas 293T-NE-3NRs

Com base em uma matriz de peptídeos derivadas do vírus da hepatite B (HBV), as respostas de células T CD4 específicas do HBV poderiam ser avaliadas em paralelo com a identificação de epítopos de células T CD4 específicas do HBV.

Análise das respostas e identificação de epítopos de células T T específicas do HBV com base em uma matriz de peptídeos

Apresentamos um protocolo para triagem de compostos anti-vírus da hepatite B (HBV) visando estágios do ciclo de vida pré e pós-entrada viral, usando calorimetria de titulação isotérmica para medir a afinidade de ligação (KD) com o polipeptídeo cotransportador de taurocolato de sódio do hospedeiro. A eficácia antiviral foi determinada através da supressão de marcadores do ciclo de vida viral (formação, transcrição e montagem viral do cccDNA).

Um Modelo de Hepatócito Competente Examinando a Entrada do Vírus da Hepatite B através do Polipeptídeo Cotransportador de Taurocolato de Sódio como Alvo Terapêutico

O presente estudo apresenta protocolos para avaliar o compromisso de destino precoce de células TFH específicas do vírus e manipular a expressão gênica nessas células.

Acesso à diferenciação precoce de células T CD4+ foliculares específicas de vírus em camundongos infectados por LCMV agudo

Aprenda a transferência de células adotivas de linfócitos T específicos de antígeno viral derivados de iPSC para suprimir a replicação do HBV em camundongos. Este método oferece uma base para imunoterapia celular.

Células-tronco derivadas virais AG-specific T da haste suprimir a replicação de HBV em ratos

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