Name: Imunoterapia adotiva de células iNKT em Isomerase Isomerase Induzida de Glicose-6-Fosfato (G6PI)-Induzido RaMice (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-31T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Aprenda a construir um modelo de artrite reumatoide com taxa de sucesso superior a 93% usando células iNKT para imunoterapia adotiva. Este método simples e reprodutível permite estudar a patogênese da AR e avaliar o potencial terapêutico das células iNKT em aplicações clínicas.

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Nosso estudo foi apoiado pela Fundação Nacional de CiênciaNatural da China (NSFC) (81771755), Colleges and university's key research project of Hebei province (ZD2017009) e o Animal Lab of Medical Experiment Center, Hebei University. Somos gratos pelo apoio deles.

Todos os camundongos experimentais (150 no total) eram camundongos saudáveis de DBA/1 masculino, 6-8 semanas de idade (20,0 ± 1,5 g), criados em um ambiente específico sem patógenos (FPS). Não há tratamento especial antes de ser modelo. O experimento foi dividido em um grupo de controle saudável (15 camundongos), um grupo de controle de modelos (15 camundongos) e um grupo de terapia celular (55 camundongos). Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Bem-Estar Animal e Ética da Universidade hebei.
1. Construindo o Modelo da Doença
<ol><li>Duplicando o modelo animal RA<ol>
<li>Pesar 1,75 mg de hG6PI 325-339 e hG6PI 469-483 fragmentos e dissolvê-los em 5,25 mL de 4 °C de água destilada tripla.</li>
		<li>Dissolva o adjuvante completo da Freund (CFA) em um banho de água de 50 °C, desenhe 5,25 mL em outro tubo de centrífuga de 10 mL e esfrie-o para uso.</li>
		<li>Coloque a mistura de solução hG6PI e solução CFA em uma unidade de emulsificação artificial com duas seringas de vidro conectadas.</li>
		<li>Empurre a seringa a uma velocidade e frequência constantes de 10-20x por min para emulsificar completamente a solução de peptídeo misto e a solução CFA. Realize a operação em um banho de gelo, e mantenha as gotículas de emulsão na água por 10 min após a conclusão da emulsificação sem dispersão.</li>
		<li>Injete 150 μL de hG6PIs emulsificados na raiz da cauda do mouse subcutâneamente.</li>
		<li>Injete 200 mg de toxina de Pertussis no mouse intraperitonely a 0 h e 48 h após a injeção hG6PI.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verificação experimental do modelo RA<ol>
<li>Meça a espessura da pata do rato com uma pinça Vernier (2x por dia).</li>
		<li>Observe e marque o grau de vermelhidão e inchaço do pé. Use os seguintes critérios de pontuação: 1) dedos com leve inchaço; 2) pedis dorsum e almofada de pé com inchaço vermelho claro; 3) tornozelo com inchaço vermelho.</li>
		<li>Eutanizar os camundongos anestesia profunda por injeção intraperitoneal de 1% de pentobarbital de sódio (50 mg/kg de peso corporal) 14 dias após a modelagem e remover as patas para a coloração de HE.</li>
		<li>Determine os níveis de secreção do soro IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, TNF-α e IFN-γ usando um ensaio de matriz de bead citométrica comercial (CBA) de acordo com o protocolo do fabricante.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Obtenção de células iNKT com terapia celular adotiva
<ol><li>Indução direcional de células iNKT<ol>
<li>Injete camundongos normais intraperitoneicamente com α-GalCer (0,1 mg/kg de peso corporal).</li>
	</ol></li>
	<li>Isolamento de células iNKT<ol>
<li>Três dias após a modelagem, injete camundongos intraperitonealmente com 1% pentobarbital de sódio (50 mg/kg de peso corporal) para anestesia. Ratos adequadamente anestesiados não mostram uma resposta de retirada da pata traseira a uma pitada de dedo do pé.</li>
		<li>Isole o baço de um mouse DBA/1 depois de injetá-lo intraperitoneticamente com α-GalCer. Prepare uma única suspensão celular cortando e moendo o baço em uma peneira de malha de 200.</li>
		<li>Lave a suspensão celular com PBS, centrífuga a 200 x g por 5 min, e descarte o supernatante. Repetir.</li>
		<li>Resuspenda as células com 1 mL de solução de diluição de sangue inteiro e tecido. Adicione 3 mL de meio de separação de linfócitos de camundongos e, em seguida, centrífuga as células por 20 min a 300 x g à temperatura ambiente.</li>
		<li>Colete a camada de linfócitos brancos leitosos (ou seja, a segunda camada da parte superior), lave-a 2x com PBS e conte com um contador de células automatizado.</li>
	</ol></li>
	<li>Estratégia de seleção positiva de classificação celular ativada magnética (MACS)para purificação de células iNKT NOTA: Para o pré-tratamento dos tetramers CD1d, 1 mg/mL de α-Galcer foi diluído a 200 μg/mL com 0,5% de Tween-20 e 0,9% da NaCl, e 5 μL da solução resultante foi adicionado a 100 μL da solução tetramer CD1dd. A mistura foi incubada por 12h à temperatura ambiente e colocada a 4 °C para uso. O tCR β foi diluído 80x com água deionizada. Todos os outros anticorpos foram usados como solução de estoque.<ol>
<li>Resuspender 107 células com 100 μL de PBS 4 °C, adicionar 10 μL de CD1d Tetramer-PE carregado α-GalCer, e incuba-las a 4 °C por 15 min no escuro.</li>
		<li>Lave as células 2x com PBS e resuspenda-as em 80 μL de PBS.</li>
		<li>Adicione 20 μL de anti-PE-MicroBeads e incuba-as a 4 °C por 20 min no escuro.</li>
		<li>Lave-os 2x com PBS e resuspenda as células com 500 μL de PBS.</li>
		<li>Coloque a coluna de classificação no campo magnético do macs sorter e enxágue com 500 μL de PBS.</li>
		<li>Adicione a suspensão celular da etapa 2.3.4 à coluna de classificação, colete o fluxo e enxágue 3x com tampão PBS.</li>
		<li>Remova o campo magnético e colete as células da coluna de classificação. Neste ponto, adicione 1 mL de tampão PBS à coluna de classificação, e empurre rapidamente o êmbolo a uma pressão constante para levar as células rotuladas para o tubo de coleta e obter células iNKT purificadas. Conte com um contador de celular automatizado.</li>
	</ol></li>
	<li>Identificação do fenótipo celular iNKT<ol>
<li>Tome 1 x 106 células das etapas 2.2.5 e 2.3.7, respectivamente, e resuspenda-as em 50 μL de PBS.</li>
		<li>Incubação anticorpo: Não adicione o anticorpo ao tubo de controle negativo, adicione 0,5 μL de α-GalCer-PE-CD1d Tetramer ou 10 μL de β FITC-TCR no único tubo de controle positivo. Adicione 0,5 μL de α-GalCer-PE-CD1d tetramer e 10 μL de fitc-TCR β no tubo de amostra. Incuba-os a 4 °C por 30 min no escuro.</li>
		<li>Lave as células na PBS e, em seguida, centrífuga a 200 x g por 5 min.</li>
		<li>Descarte o supernatante, adicione 1 mL da foxation/solução de trabalho foxp3/permeabilização, e incuba rastizar as células por 45 min a 4 °C no escuro.</li>
		<li>Adicione 1 mL de 1x solução de trabalho buffer de permeabilização e centrífuga as células em temperatura ambiente por 500 x g em temperatura ambiente por 5 min.</li>
		<li>Descarte o supernatante. Adicione 1 μL de Alexa Fluor 647 mouse Anti-PLZF e 1 μL de perCP-Cy 5.5 mouse anti-T-bet (ou 1 μL de PerCP-Cy 5.5 mouse anti-RORΥt) por 30 min à temperatura ambiente no escuro.</li>
		<li>Adicione a 2 mL da solução de trabalho buffer de permeabilização para limpeza.</li>
		<li>Descarte o supernatante, resuspenda as células em 500 μL de PBS e meça por citometria de fluxo.</li>
	</ol></li>
	<li>Identificação funcional de células iNKT<ol>
<li>Tome 3 x 106 células iNKT a partir da etapa 2.3.7 e resuspenda-as em 12 placas de poço com 1,5 mL de RPMI-1640 incompleto médio (ou seja, sem soro).</li>
		<li>Adicione phorbol ester (PMA, 50 ng/mL) e ionomicina de cálcio (IO, 1 μg/mL) e coloque em uma incubadora de CO2 por 24 h.</li>
		<li>Colete o supernatant celular e detecte os níveis de secreção de IL-2, IL-17A, TNF-α, IL-6, IL-4, IFN-γ e IL-10 usando um ensaio comercial da CBA de acordo com o protocolo do fabricante.</li>
	</ol></li>
	<li>Estudo experimental sobre a via migratória de células iNKT em camundongos RA<ol>
<li>Dissolva dir dye (2,5 mg/mL) em DMSO.</li>
		<li>Resuspender as células iNKT em 6 placas de poço com rpmI-1640 incompleto médio. A densidade é de 1 × 106 células/mL.</li>
		<li>Adicione a solução DiR (5 μg/mL) e incuba em uma incubadora de CO2 por 25 min.</li>
		<li>Lave com PBS e resuspenda as células (3 x 106/300 μL) para obter células iNKT com rótulo diR (DiR-iNKT).</li>
		<li>Injete 1% de pentobarbital de sódio (50 mg/kg de peso corporal) intraperitoneicamente para anestesiar os camundongos. Ratos adequadamente anestesiados não mostram uma retirada da pata traseira para beliscar os dedos dos dedos. Aplique pomada veterinária aos olhos do camundongo para evitar a secura enquanto estiver anestesia para imagem.</li>
		<li>Injete as células DiR-iNKT 3 x 106 por mouse na veia traseira com o modelo RA por 8 dias. Monitore as células iNKT em camundongos pós-injeção por 0 min, 10 min, 30 min, 60 min e dia 0 (após 3 h), 1, 3, 6, 12, 26, 34, 38 e 42 dias usando um animal pequeno no sistema de imagem vivo (IVIS). O comprimento de onda de excitação usado foi de 748 nm, o comprimento de onda de emissões era de 780 nm, e o tempo de exposição era automático.</li>
		<li>Coloque cada rato em uma gaiola separada após cada observação e mantenha a rerecência esnaciada. Observe até a recuperação da anestesia.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Avaliação da Imunoterapia Adotiva de Camundongos RA com células iNKT
<ol><li>Imunoterapia adotiva celular iNKT para ratos RA<ol>
<li>Injete 3 x 106 células células iNKT células por mouse através da veia traseira. Selecione aleatoriamente 15 ratos que foram modelados 8 dias antes e obtenham células iNKT sem rotulagem DiR a partir da etapa 2.3.7 pela infusão da veia traseira.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Avalie a eficácia da imunoterapia adotiva para células iNKT.<ol>
<li>Meça a espessura da pata do camundongo, quantifique o inchaço da articulação do tornozelo e escore sistematicamente após a infusão de células iNKT como descrito nos passos 1.2.1-1.2.2.</li>
		<li>Observe a infiltração celular inflamatória e as alterações articulares das articulações do camundongo, conforme descrito na etapa 1.2.3.</li>
		<li>Determine os níveis de secreção de IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, TNF-α e IFN-γ como descrito na etapa 1.2.4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determine a frequência de células e subconjuntos iNKT.<ol>
<li>Isole o tímo do rato e prepare uma suspensão de uma única célula.</li>
		<li>Separe os linfócitos com fluido de separação linfócito.</li>
		<li>Determine a frequência celular iNKT e a frequência do subgrupo conforme descrito na etapa 2.4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Análise estatística NOTA: Todos os dados são apresentados como média ± Valores sd. de P < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.<ol>
<li>Use uma análise de um fator de variância (ANOVA). Se a variância estiver satisfeita, use o teste LSD para maior comparação.</li>
		<li>Se a variância não for uniforme, use o teste não paramétrico. Use o teste Kruskal-Wallis H para comparação adicional31.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Tobón, G. J., Youinou, P., Saraux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+environment%2C+geo-epidemiology%2C+and+autoimmune+disease%3A+Rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmunity+Reviews%22%5BJournal%5D)">The environment, geo-epidemiology, and autoimmune disease: Rheumatoid arthritis.</a> Autoimmunity Reviews. 35 (1), 0-14 (2010).</li>
<li>Cross, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+burden+of+rheumatoid+arthritis%3A+estimates+from+the+Global+Burden+of+Disease+2010+study%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Rheumatic+Diseases%22%5BJournal%5D)">The global burden of rheumatoid arthritis: estimates from the Global Burden of Disease 2010 study.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (7), 1316-1322 (2014).</li>
<li>Kanashiro, A., Bassi, G. S., Queiróz Cunha, F. D., Ulloa, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+neuroimunomodulation+to+bioelectronic+treatment+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectronics+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">From neuroimunomodulation to bioelectronic treatment of rheumatoid arthritis.</a> Bioelectronics in Medicine. 1 (2), 151-165 (2018).</li>
<li>Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariant+natural+killer+T+cells%3A+an+innate+activation+scheme+linked+to+diverse+effector+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions.</a> Nature Reviews Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).</li>
<li>Bianca, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+Natural+Killer+T-Cells+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Unraveling Natural Killer T-Cells Development.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1950(2018).</li>
<li>Mitsuo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+CD161%2BCD8%2B+T+cells+in+the+peripheral+blood+of+patients+suffering+from+rheumatic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Decreased CD161+CD8+ T cells in the peripheral blood of patients suffering from rheumatic diseases.</a> Rheumatology. 45 (12), 1477-1484 (2006).</li>
<li>Miellot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+invariant+NK+T+cells+protects+against+experimental+rheumatoid+arthritis+by+an+IL-10-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Activation of invariant NK T cells protects against experimental rheumatoid arthritis by an IL-10-dependent pathway.</a> European Journal of Immunology. 35 (12), 3704-3713 (2005).</li>
<li>Miellot-Gafsou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+activation+of+invariant+natural+killer+T+cells+in+a+rheumatoid+arthritis+model+and+application+to+disease+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Early activation of invariant natural killer T cells in a rheumatoid arthritis model and application to disease treatment.</a> Immunology. 130 (2), 296-306 (2010).</li>
<li>Tudhope, S. J., Delwig, A. V., Falconer, J., Pratt, A., Ng, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profound+invariant+natural+killer+t-cell+deficiency+in+inflammatory+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Rheumatic+Diseases%22%5BJournal%5D)">Profound invariant natural killer t-cell deficiency in inflammatory arthritis.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 69 (10), 1873-1879 (2010).</li>
<li>Ming, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+on+immunoregulation+of+iNKT+cells+in+RA+by+novel+synthetic+immunostimulator+CH1b%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Effects on immunoregulation of iNKT cells in RA by novel synthetic immunostimulator CH1b.</a> Chinese Journal of Immunology. 32 (02), 218-222 (2016).</li>
<li>Ming, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+the+correlation+between+the+percentage+of+iNKT+cells+and+the+ratio+of+IFN-%CE%B3%2FIL-4+in+patients+with+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Journal+of+Microbiology+Immunology%22%5BJournal%5D)">Study of the correlation between the percentage of iNKT cells and the ratio of IFN-γ/IL-4 in patients with rheumatoid arthritis.</a> Chinese Journal of Microbiology Immunology. 35 (3), 213-218 (2015).</li>
<li>Sharif, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+natural+killer+T+cells+by+%CE%B1-galactosylceramide+treatment+prevents+the+onset+and+recurrence+of+autoimmune+Type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Activation of natural killer T cells by α-galactosylceramide treatment prevents the onset and recurrence of autoimmune Type 1 diabetes.</a> Nature Medicine. 7, 1057-1062 (2010).</li>
<li>Gapin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+invariant+natural+killer+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Development of invariant natural killer T cells.</a> Current Opinion in Immunology. 39, 68-74 (2016).</li>
<li>Kwon, D. I., Lee, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+Differentiation+Program+of+Invariant+Natural+Killer+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immune+Network%22%5BJournal%5D)">Lineage Differentiation Program of Invariant Natural Killer T Cells.</a> Immune Network. 17 (6), (2017).</li>
<li>Thapa, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+differentiation+of+ROR-%CE%B3t+expressing+iNKT17+cells+is+orchestrated+by+Runx1%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The differentiation of ROR-γt expressing iNKT17 cells is orchestrated by Runx1.</a> Scientific Reports. 7 (1), 7018(2017).</li>
<li>Schurgers, E., Billiau, A., Matthys, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen-induced+arthritis+as+an+animal+model+for+rheumatoid+arthritis%3A+focuson+interferon-%CE%B3%5BTitle%5D)+AND+%22Interferon+Cytokine+Research%22%5BJournal%5D)">Collagen-induced arthritis as an animal model for rheumatoid arthritis: focuson interferon-γ.</a> Interferon Cytokine Research. 31 (12), 917-926 (2011).</li>
<li>Van Haalen, H. G. M., Severens, J. L., Tran-Duy, A., Boonen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+cost-effectiveness+A+systematic+review+and+stepwise+approach+for+selecting+a+transferable+health+economic+evaluation+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacoeconomics%22%5BJournal%5D)">How cost-effectiveness A systematic review and stepwise approach for selecting a transferable health economic evaluation rheumatoid arthritis.</a> Pharmacoeconomics. 32 (5), 429-442 (2014).</li>
<li>Schubert, D., Maier, B., Morawietz, L., Krenn, V., Kamradt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+with+glucose-6-phosphate+isomerase+induces+T+cell-dependent+peripheral+polyarthritis+in+genetically+unaltered+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunization with glucose-6-phosphate isomerase induces T cell-dependent peripheral polyarthritis in genetically unaltered mice.</a> Journal of Immunology. 172, 4503-4509 (2004).</li>
<li>Bockermann, R., Schubert, D., Kamradt, T., Holmdahl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+a+B-cell-dependent+chronic+arthritis+with+glucose-6-phosphate+isomerase%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research%2C+Therapy%22%5BJournal%5D)">Induction of a B-cell-dependent chronic arthritis with glucose-6-phosphate isomerase.</a> Arthritis Research, Therapy. 7, 131613-131624 (2005).</li>
<li>Kamradt, T., Schubert, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+and+clinical+implications+of+G6PI+in+experimental+models+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research%2C+Therapy%22%5BJournal%5D)">The role and clinical implications of G6PI in experimental models of rheumatoid arthritis.</a> Arthritis Research, Therapy. 7, 20-28 (2005).</li>
<li>Horikoshi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+Invariant+NKT+Cells+with+Glycolipid+Ligand+%CE%B1-Galactosylceramide+Ameliorates+Glucose-6-Phosphate+Isomerase+Peptide-Induced+Arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22PlosOne%22%5BJournal%5D)">Activation of Invariant NKT Cells with Glycolipid Ligand α-Galactosylceramide Ameliorates Glucose-6-Phosphate Isomerase Peptide-Induced Arthritis.</a> PlosOne. 7 (12), 51215(2012).</li>
<li>Zhang, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+with+mixed+peptides+derived+from+glucose-6-phosphate+isomerase+induces+rheumatoid+arthritis+in+DBA+%2F1+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Journal+of+Pathophysiology%22%5BJournal%5D)">Immunization with mixed peptides derived from glucose-6-phosphate isomerase induces rheumatoid arthritis in DBA /1 mice.</a> Chinese Journal of Pathophysiology. 32 (3), 569-576 (2016).</li>
<li>Motohashi, S., Nakayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariant+natural+killer+T+cell-based+immunotherapy+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Invariant natural killer T cell-based immunotherapy for cancer.</a> Immunotherapy. 1 (1), 73(2017).</li>
<li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+requirement+of+natural+killer+T-cells+in+tolerogenic+APCs-mediated+suppression+of+collagen-induced+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">The requirement of natural killer T-cells in tolerogenic APCs-mediated suppression of collagen-induced arthritis.</a> Experimental and Molecular Medicine. 42 (8), 547-554 (2010).</li>
<li>Luc, V. K., Lan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+Potential+of+Invariant+Natural+Killer+T+Cells+in+Autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Therapeutic Potential of Invariant Natural Killer T Cells in Autoimmunity.</a> Frontiers in Immunology. 9, 519-526 (2018).</li>
<li>Chiba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+collagen-induced+arthritis+by+natural+killer+T+cell+activation+with+OCH%2C+a+sphingosine-truncated+analog+of+%CE%B1-galactosylceramide%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis%2C+Rheumatism%22%5BJournal%5D)">Suppression of collagen-induced arthritis by natural killer T cell activation with OCH, a sphingosine-truncated analog of α-galactosylceramide.</a> Arthritis, Rheumatism. 50 (1), 305-313 (2004).</li>
<li>Tudhope, S. J., Delwig, A. V., Falconer, J., Pratt, A., Ng, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profound+invariant+natural+killer+t-cell+deficiency+in+inflammatory+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Rheumatic+Diseases%22%5BJournal%5D)">Profound invariant natural killer t-cell deficiency in inflammatory arthritis.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 69 (10), 1873-1879 (2010).</li>
<li>Bruns, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+with+an+immunodominant+self-peptide+derived+from+glucose-6-phosphate+isomerase+induces+arthritis+in+DBA%2F1+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research%2C+Therapy%22%5BJournal%5D)">Immunization with an immunodominant self-peptide derived from glucose-6-phosphate isomerase induces arthritis in DBA/1 mice.</a> Arthritis Research, Therapy. 11 (4), (2009).</li>
<li>Parietti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rituximab+treatment+overcomes+reduction+of+regulatory+iNKT+cells+in+patients+with+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Rituximab treatment overcomes reduction of regulatory iNKT cells in patients with rheumatoid arthritis.</a> Clinical Immunology. 134 (3), 331-339 (2010).</li>
<li>Yoshida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+mechanism%28s%29+of+the+inhibition+of+disease+progression+by+combination+treatment+with+fingolimod+plus+pathogenic+antigen+in+a+glucose-6-phosphate+isomerase+peptide-induced+arthritis+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biological%2C+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Functional mechanism(s) of the inhibition of disease progression by combination treatment with fingolimod plus pathogenic antigen in a glucose-6-phosphate isomerase peptide-induced arthritis mouse model.</a> Biological, Pharmaceutical Bulletin. 38 (8), 1120-1125 (2015).</li>
<li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+the+adoptive+immunotherapy+on+rheumatoid+arthritis+with+Thymus-derived+invariant+natural+killer+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunopharmacology%22%5BJournal%5D)">Study of the adoptive immunotherapy on rheumatoid arthritis with Thymus-derived invariant natural killer T cells.</a> International Immunopharmacology. 67, 427-440 (2019).</li>
</ol>

Os autores declaram que não há financiamento ou conflitos de interesse.

As células iNKT são células T especiais que fazem a ponte imunidade inata e adaptativa e são desenvolvidas principalmente a partir de CD4++/CD8+ thymocytes. As células iNKT têm funções imunoregulatórias diversas e interagem com outras células imunes por contato direto e secreção de diferentes citocinas23, afetando células dendríticas (DCs), macrófagos, nêutrons, células B, células T e diferenciação e desenvolvimento celular NK2<...

A artrite reumatoide (RA) é uma doença autoimune caracterizada por incomodade crônica e progressiva com incidência de 0,5 a 1%1,2. A patogênese subjacente é atribuída à proliferação anormal das células CD4+ e CD8+ T, manifestadas por um aumento na proporção de células CD4+IFN-γ+ e CD4+IL-17A+ T, e o número reduzido de células CD4+IL-4+ e CD4+CD25+FoxP3+ T. Portanto, a secreção de citocinas inflamatórias é aumentada, e uma reação inflamatória excessiva destrói o equilíbrio nativo e a função de tolerância do sistema imunológico do corpo. Além disso, o ajudante T linfócito (Th) 1 células que penetram na articulação agravam a resposta inflamatória e danos articulares. Portanto, a inibição da resposta inflamatória excessiva e da restauração da tolerância imunológica e do equilíbrio imunológico são fundamentais para o tratamento de RA3,4.
As células iNKT têm funções e características das células NK e t. As células iNKT abrigam uma cadeia de células T distintae e invariante (TCR) com repertórios limitados de β-cadeia TCR5 e reconhecem o antígeno glicolipídico apresentado pelo maior complexo de histocompatibilidade (MHC) classe I CD1d na superfície das células presentes em antígenos. Mitsuo et al.6 detectaram um grande número de células iNKT e defeitos funcionais em muitas doenças autoimunes, incluindo ra. Aurore et al.7 demonstraram que as células iNKT têm um efeito positivo na manutenção da tolerância autoimune e que quando o número e a função das células iNKT são restaurados, a doença é aliviada. Além disso, Miellot-Gafsou et al.8 descobriram que as células iNKT não só revogaram a doença, mas também aumentaram a progressão da doença. Esses resultados contraditórios sugerem que as células iNKT são células T heterogêneas, e a função de diferentes subconjuntos pode ser revertida. Em um estudo clínico de RA, a frequência de células iNKT correlacionada com o escore da atividade da doença9. Os resultados também confirmaram que a frequência do iNKT foi reduzida em pacientes com RA, o número de subconjuntos de células CD4+IFN-γ+ T aumentou, e os níveis secretos de citocinas inflamatórias IFN-γ e TNF-α aumentaram10,11. Além disso, Sharif et al.12 investigados diabetes tipo 1 (T1D) e descobriram que a infusão seletiva de células iNKT upregulamentou a expressão da citocina inflamatória IL-4, manteve a tolerância imune e impediu o desenvolvimento do diabetes tipo 1. Portanto, a infusão adotiva de células iNKT específicas ou ativação direcionada de células iNKT aumenta o nível de células iNKT em pacientes com RA, o que pode ser um avanço no tratamento de RA.
A imunoterapia celular é atualmente de grande interesse e tem sido amplamente utilizada na terapia contra o câncer. No entanto, as células iNKT são células imunoreguladoras raras e heterogêneas (apenas 0,3% do número total de PBMCs)13, o que limita potenciais aplicações clínicas. Essas células são divididas principalmente em três subpopulações: 1) células iNKT1, que têm uma alta expressão de proteína promielocítica de zinco -finger protein (PLZF) e fator de transcrição t-box (T-bet); 2) células iNKT2 com expressão intermediária de PLZF e proteína de ligação GATA 3 (GATA3); 3) células iNKT17 com baixa expressão de PLZF e receptor nuclear órfão relacionado a retinóides (ROR)-γt que secretam IFN-γ, IL-4 e IL-1714. Células iNKT ativadas secretam citocinas semelhantes a Th1, Th2 e Th17, que determinam os diferentes efeitos imunomodulatórios das células iNKT15. Os efeitos imunomodulatórios e imunoterapêuticos da ativação específica de várias subpopulações de células iNKT são diferentes. Portanto, a seleção de fenótipos específicos de células iNKT (principalmente iNKT2) com funções anti-inflamatórias para regular a resposta imune do corpo pode corrigir o desequilíbrio imunológico e as doenças imunológicas em RA.
O estabelecimento de um modelo animal ideal é de grande importância para o tratamento e estudo da patogênese ra. Atualmente, os modelos animais mais usados e maduros incluem artrite induzida por colágeno, artrite adjuvante, artrite induzida por zimosan e artrite induzida por polissacarídeo16–17. No entanto, não há um modelo que possa simular totalmente todas as características do RA humano. Artrite induzida por colágeno tipo II (CIA) é um modelo clássico de artrite. A CIA é induzida pela imunização de camundongos com anticorpos monoclonais específicos de colágeno tipo II, refletindo a dependência de anticorpos desse modelo da doença. Benurs et al. descreveram um modelo com uma resposta imune sistêmica à isomerase glicose-6-fosfato (G6PI), que induz poliartrite simétrica periférica em cepas de camundongos suscetíveis18,19. Nesse modelo, o desenvolvimento da artrite depende de células T, células B e imunidade inata18,19,20. Horikoshi21 descobriu que os modelos RA resultantes da imunização de camundongos DBA/1 com fragmentos de polipeptídeo G6PI são mais semelhantes ao RA humano em termos de células CD4+ T e citocinas (ou seja, IL-6 e TNF-α) do que os modelos da CIA. Para aumentar o efeito estimulante no local de reconhecimento do TCR, os fragmentos de polipeptídeo misto do G6PI (hGPI325-339 e hGPI469-483) foram usados para imunizar camundongos DBA/1 para construir o modelo de camundongora RA. A taxa de sucesso dessa abordagem pode ser alta porque hGPI325-339 e hGPI469-483 são imunodominantes para respostas de células T restritas a Q I-A. Portanto, este modelo pode simular a superproliferação de células CD4+ T e defeitos celulares iNKT em pacientesRA 22. A pesquisa básica da imunopatologia ra estabeleceu as bases para nossa investigação mais aprofundada.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 647 Mouse Anti-PLZF</td><td>BD</td><td>563490</td><td></td></tr><tr><td>América Anti-PE MicroBeads</td><td>Miltenyi</td><td>130-048-801</td><td>Alemanha</td></tr><tr><td>Colunas</td><td>Miltenyi</td><td>MS</td><td>Alemanha</td></tr><tr><td>Centrífuga Criogênica</td><td>Beckman</td><td>Allegra&reg; X-15R</td><td>América</td></tr><tr><td>DiR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D12731</td><td>América</td></tr><tr><td>Centro de Incorporação</td><td>Tianjin Aviation Electromechanical Co., Ltd.</td><td>BMJ-1</td><td>China</td></tr><tr><td>FITC Hamster Anti-Mouse TCR &beta; Cadeia</td><td>BD</td><td>553170</td><td>América</td></tr><tr><td>Citômetro de fluxo</td><td>BD</td><td>Accuri C6</td><td>América</td></tr><tr><td>Freund adjuvante completo</td><td>Sigma</td><td>F5881</td><td>América</td></tr><tr><td>hGPI325-339 (IWYINCFGCETHAML)</td> <td>Karebay Biochem</td><td>18062202</td><td>China</td></tr><tr><td>hGPI469-483 (EGNRPTNSIVFTKLT)</td> <td>Karebay Biochem</td><td>18062203</td><td>China</td></tr><tr><td>Sistema de imagem in vivo</td><td>Paquímetro PerkinElmer</td><td>IVIS lumina II</td><td>América</td></tr><tr><td>Ionomicina Cálcio</td><td>Cayman</td><td>10004974</td><td>América</td></tr><tr><td>KRN7000</td><td>AdipoGen</td><td>AG-CN2-0013</td><td>América</td></tr><tr><td>Mouse CD1d Tetrâmero-PE</td><td>MBL</td><td>TS-MCD-1</td><td>Japão</td></tr><tr><td>Mouse Percoll</td><td>Solarbio</td><td>P8620</td><td>China</td></tr><tr><td>Microscópio Óptico</td><td>Olympus</td><td>Olympus-II</td><td>Japão</td></tr><tr><td>PerCP-CyTM5.5 Mouse anti-ROR-&upsih; t</td><td>BD</td><td>562683</td><td>América</td></tr><tr><td>PerCP-CyTM5.5 Mouse anti-T-bet</td><td>BD</td><td>561316</td><td>América</td></tr><tr><td>Toxina da coqueluche</td><td>Sigma</td><td>P7208</td><td>América</td></tr><tr><td>ésteres de forbol</td><td>Cayman</td><td>10008014</td><td>América</td></tr><tr><td>Tampão de lise de glóbulos vermelhos</td><td>BD</td><td>555899</td><td>América</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Indústrias Biológicas</td><td>01-100-1ACS</td><td>Israel</td></tr><tr><td>Kit de citocinas Th1/Th2/Th17</td><td>BD</td><td>560485</td><td>América</td></tr><tr><td>Ultramicrótomo</td><td>Leica Leica</td><td>EM UC6</td><td>Alemanha</td></tr></tbody></table>

imunoterapia adotiva de células inkt em isomerase isomerase induzida de glicose-6-fosfato (g6pi)-induzido ramice

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase (G6PI)-Induced RA Mice

Artrite reumatoide (RA) é uma doença inflamatória crônica autoimune complexa. A patogênese da doença está relacionada com células invariantes assassinas naturais T (iNKT). Pacientes com RA ativa apresentam menos células iNKT, função celular defeituosa e polarização excessiva de Th1. Neste estudo, foi estabelecido um modelo animal RA utilizando uma mistura de hGPI325-339 e hGPI469-483 peptídeos. As células iNKT foram obtidas por indução in vivo e purificação in vitro, seguidas de infusão em camundongos RA para imunoterapia adotiva. O rastreamento do sistema de imagem in vivo (IVIS) revelou que as células iNKT foram distribuídas principalmente no baço e fígado. No dia 12 após a terapia celular, a progressão da doença desacelerou significativamente, os sintomas clínicos foram aliviados, a abundância de células iNKT no timo aumentou, a proporção de iNKT1 no timo diminuiu, e os níveis de TNF-α, IFN-γ, e IL-6 em o soro diminuiu. A imunoterapia adotiva das células iNKT restaurou o equilíbrio das células imunes e corrigiu a inflamação excessiva do corpo.

A pontuação do índice de artrite e a espessura da pata aumentaram após a modelagem. Em comparação com o grupo controle, os dedos do grupo modelo RA começaram a mostrar inchaço vermelho em 6 dias após a modelagem, com agravamento gradual. Aos 14 dias, o inchaço vermelho na articulação do tornozelo atingiu o pico, seguido de alívio gradual. A espessura da pata mudou de forma semelhante (P &lt; 0,05) (Figura 1).
A infiltração celular inflamatória aumentou si...

Este protocolo usa peptídeos mistos G6PI para construir modelos de artrite reumatoide que estão mais próximos do da artrite reumatoide humana em células CD4+ T e citocinas. Células T assassinas naturais invariantes de alta pureza (principalmente iNKT2) com fenótipos e funções específicas foram obtidas por indução in vivo e purificação in vitro para imunoterapia adotiva.

Imunoterapia adotiva de células iNKT em Isomerase Isomerase Induzida de Glicose-6-Fosfato (G6PI)-Induzido RaMice

Rheumatoid arthritis (RA) is a complex chronic inflammatory autoimmune disease. The pathogenesis of the disease is related to invariant natural killer T ...

Nosso protocolo descreve um método para construir um modelo de RA. Sua taxa de sucesso é de mais de 93% e sua patogênese depende de células T, células B e imunidade inata, o que permite aos pesquisadores estudar melhor a patogênese da RA de uma perspectiva imune global. Então usamos células INKT com efeitos imunomodulatórios para seu tratamento.As células INKT têm bom efeito no tratamento pela introdução in vivo que fornecem suporte básico de dados para a aplicação clínica de células INKT e realmente explode o valor de aplicação clínica das células INKT. A maior vantagem dessa tecnologia é que ela é simples de operar e fácil de copiar. Demonstrando o procedimento estarão Chen Shengde, Gao Xiang e Zhang Jingnan, estudante de pós-graduação do meu laboratório.Para começar, pesar 1,75 miligramas de HGPI325 a 339 e HGPI469 a 483 fragmentos e dissolvê-los em 5,25 mililitros de 4 graus Celsius de água tripla destilada. Dissolver o Adjuvante completo de Freund em um banho de água de 50 graus Celsius. Desenhe 5,25 mililitros em outro tubo de centrífuga de 10 mililitros e esfrie-o para uso.Coloque a mistura da solução HG6PI e a solução Adjuvante da Complete Freund em uma unidade de emulsific

adoptive-immunotherapy-inkt-cells-glucose-6-phosphate-isomerase-g6pi

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

De hipersensibilidade do tipo retardado (DTH) é uma reação inflamatória mediada por CCR7-efetoras de memória T (TEM) linfócitos. Aqui demonstramos como ativar células antígeno-específicas TEM, induzir DTH adotivos em ratos Lewis e monitorar a resposta inflamatória.

Indução e Monitoramento de hipersensibilidade tardia-Type Adoptive em Ratos

Geração de linfócitos T de tronco pluripotentes induzidas (iPS) células dá uma abordagem alternativa de utilização de células-tronco embrionárias para T imunoterapia baseada em células. O método mostra que, utilizando...

Diferenciação de células Dirigido tronco pluripotentes induzidas no sentido de Linfócitos T

Este vídeo ilustra um método para isolar células T natural killer invariantes, também conhecidas como células iNKT. O procedimento começa com a injeção de um glicolipídio sintético em um camundongo para estimular a ativação e proliferação de células iNKT no baço. Posteriormente, suspensões unicelulares são preparadas a partir do baço e incubadas com complexos de reconhecimento de células iNKT marcados com fluoróforos, seguidos de separação baseada em esferas magnéticas, para isolar as células...

Isolando células T assassinas naturais invariantes de um modelo de camundongo

Este vídeo mostra uma terapia baseada em células para artrite autoimune em camundongos. As células T reguladoras derivadas de iPSC que expressam receptores específicos de ovalbumina são injetadas com albumina de soro bovino metilado (mBSA) emulsionada em um adjuvante. As células apresentadoras de antígenos murinos (APCs) processam e apresentam o mBSA às células T, estimulando a ativação e migração das células T para a membrana sinovial da articulação do joelho. As injeções subsequentes envolvem...

Uma terapia baseada em células para artrite autoimune em um modelo murino

Este vídeo demonstra um método baseado em imagem para visualizar células beta transplantadas que expressam luciferase em um camundongo imunodeficiente diabético não obeso. A introdução de esplenócitos de um camundongo diabético leva à destruição progressiva das células beta, visualmente confirmada pelo declínio da luminescência após a introdução do substrato.

Imagem de células beta transgênicas em um camundongo imunodeficiente desafiado com esplenócitos diabéticos

Nós proporcionar um método reprodutível para induzir diabetes do tipo 1 (DM1) em ratinhos dentro de duas semanas pela transferência adoptiva de células T primárias de ilhéus, CD4 + específicas para o antigénio.

Accelerated Diabetes Tipo 1 Indução em Ratos por transferência adotiva de diabetogênicos TCD4 +

Apresentamos aqui um método para desenvolver células T reguladoras (Tregs) específicas de antígeno funcional (Ag) a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) para imunoterapia de artrite autoimune em um modelo murino.

Desenvolvimento de Células-Tronco de derivados de células T regulatórias antígeno específico da Contra Auto-imunidade

Aqui, apresentamos um protocolo para a preparação e a administração estereotáxica de linfócitos humanos alogênico em camundongos imunodeficientes carregando humana ortotópico de tumores primários. Este estudo fornece um prova de conceito para a viabilidade e a eficácia antitumoral de imunoterapias celulares intrabrain-entregue.

Estereotáxica transferência adotiva de citotóxicas células imunes em modelos murino de humanos ortotópico Glioblastoma Multiforme Xenografts

O primata não humano (NHP) é um modelo ideal para estudar a terapêutica celular da retina humana devido às semelhanças anatômicas e genéticas. Este manuscrito descreve um método de transplante submacular de células epiteliais de pigmento retiniano no olho nHP e estratégias para prevenir complicações intraoperatórias associadas à manipulação macular.

Transplante de Epitélio de Pigmento De Retina em um modelo de primata não humano para doenças degenerativas da retina

Este protocolo descreve um método simples e minimamente invasivo para transplante e obtenção de imagens de células NIT-1 em camundongos imunodeficientes combinados não-obesos diabéticos (NOD)-graves desafiados com esplenócitos purificados de camundongos NOD espontaneamente diabéticos.

Monitoramento Bioluminescente da Sobrevida do Enxerto em Modelo de Transferência Adotiva de Diabetes Autoimune em Camundongos

Aqui, relatamos um protocolo que estabelece um modelo de camundongo com artrite reumatóide (AR) por meio da transferência adotiva de células T CD4+ de camundongos SKG, fornecendo uma ferramenta experimental rápida e confiável para investigar os mecanismos imunológicos, progressão patológica e desenvolvimento de novos tratamentos para AR.

Um modelo de transferência adotiva de artrite reumatóide em camundongos

Aprenda a construir um modelo de artrite reumatoide com taxa de sucesso superior a 93% usando células iNKT para imunoterapia adotiva. Este método simples e reprodutível permite estudar a patogênese da AR e avaliar o potencial terapêutico das células iNKT em aplicações clínicas.

Imunoterapia adotiva de células iNKT em Isomerase Isomerase Induzida de Glicose-6-Fosfato (G6PI)-Induzido RaMice

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