Melhorando a exatidão da avaliação cytometric do fluxo do potencial mitochondrial da membrana em pilhas hematopoietic da haste e do progenitor através da inibição de bombas do Efflux
30 de julho de 2019
As bombas do efluxo de xenobiotic são altamente ativas na haste e nas pilhas Hematopoietic do progenitor (hspcs) e causam a extrusão de tmrm, uma tintura fluorescente potencial da membrana mitochondrial. Aqui, nós apresentamos um protocolo para medir exatamente o potencial mitochondrial da membrana nos hspcs por tmrm na presença de Verapamil, um inibidor da bomba do efluxo.
A função mitocondrial é fundamental para a auto-renovação das células-tronco hematopoiéticas. A atividade mitocondrial é um refletor do potencial da membrana mitocondrial interna, que pode ser medido por TMRM, um corante cationic fluorescente celular. As bombas de efflux xenobióticos são altamente ativas no HSC e causam extrusão TMRM.
A principal vantagem deste protocolo, é a correção desse efeito, utilizando o Verapamil, um inibidor das bombas efflux. Comece isolando a medula óssea dos fêmures do rato. Use um par de fórceps e uma tesoura afiada para cortar as duas patas posteriores.
Em seguida, faça um pequeno corte na pele ventral do mouse, e estique-o. Extrair o fêmur e a tíbia, tomando cuidado para não desalojar as cabeças do fêmur, e coloque os ossos em uma placa de seis poços, cheia de 1,5 mililitros de tampão de coloração. Remova os músculos dos ossos e corte as extremidades dos ossos, permitindo que a medula óssea saia.
Coloque os ossos limpos em novos poços, com 1,5 mililitros de tampão de coloração. Em seguida, limpe a medula óssea com uma seringa de três mililitros e uma agulha calibre 25, até que o osso fique branco. Colete todas as células em um tubo de 1,5 mililitro, e centrífuga-as por cinco minutos a 180 vezes G, depois descarte o supernascedor.
Resuspenque cuidadosamente a pelota em 300 microliters de tampão de gelo ACK e coloque as células no gelo por um minuto. Em seguida, desative imediatamente a lise adicionando um mililitro de tampão de coloração. Centrifugar as células por cinco minutos a 180 vezes G.Resuspend a pelota celular, que deve parecer branca, em um mililitro de tampão de coloração.
Filtre as células usando uma tampa de coador de celular, com uma malha de nylon de 35 micrômetros, para obter células mononucleares. Comece preparando o coquetel de linhagem, e anticorpos conjugados fluoróvias, de acordo com as instruções do manuscrito. Mantenha os anticorpos no gelo, e protegido da luz.
Em seguida, centrifufique a amostra por cinco minutos a 180 vezes G, e descarte o supernaspeso. Adicione 400 microliters do coquetel de linhagem, e quatro microliters de anticorpos biotinilados CD135 à pelota celular, e vórtice da mistura. Em seguida, incubar-lo no gelo por 30 minutos.
Após a incubação, lave a amostra adicionando três mililitros de tampão de coloração, girando-a por cinco minutos a 180 vezes G, e descartando o supernatante. Em seguida, adicione 400 microliters de solução de anticorpos, e vórtice da mistura. Incubar no gelo por mais 30 minutos e repetir a lavagem com o tampão de coloração.
Para preparar a solução de coloração TMRM, adicione 2,2 microliters de solução de estoque TMRM e 1,1 microliters de Verapamil, a 1,1 mililitros de meio de cultura hematopoiética livre de soro, com trombopoietina e fator célula-tronco. Resuspend a medula óssea em um mililitro da solução de coloração TMRM, vórtice rapidamente, e incubar por uma hora a 37 graus Celsius. Filtre a amostra usando uma tampa de filtro celular, com uma malha de nylon de 35 micrômetros, para evitar entupir o cítmetro de fluxo.
Em seguida, adicione um microliter de DAPI e prossiga com a citometria de fluxo. Execute a amostra de medula óssea, e adquira pelo menos um milhão de eventos. Em seguida, exiba as células mononucleares de medula óssea ao vivo em um gráfico para azul pacífico, para identificar frações CD135 Lin-negativo e Lin-positive.
Plote a fração Lin-negativa para APC/Cy7 versus PE/Cy7 para identificar a fração progenitor multipotente ou MPP. Em seguida, plote a fração MPP para APC versus PerCP/Cy5.5, para identificar a célula-tronco hematopoiética ou a fração HSC. Exibir a fração HSC para FITC, ou CD34, para dividi-la em frações HSC negativas cd34 e CD34 positivas.
Finalmente adquirir a intensidade TMRM em cada população. Para garantir que a coloração TMRM funcionasse corretamente, adicione um microliter de FCCP à amostra, para uma concentração final de um mililitro, e incuba-o a 37 graus Celsius por cinco minutos. Então adquira um milhão de eventos.
Após a adição do FCCP, a intensidade do TMRM deve ser drasticamente aumentada. Este protocolo tem sido usado com sucesso para quantificar o potencial da membrana mitocondrial em várias populações celulares, com corante TMRM. Foi demonstrado que a presença de PBS e FBS no meio de cultura afeta a intensidade do sinal TMRM.
Por isso, é importante realizar a coloração TMRM em meio de expansão sem soro. Células-tronco hematopoiéticas expressam altos níveis de atividade de bombas de efflux xenobióticos que extrudam corante TMRM. Assim, os perfis TMRM também variam na presença de Verapamil ou Ciclosporin H, que bloqueiam as bombas.
Para verificar a precisão da coloração TMRM, o FCCP pode ser despolarizar as mitocôndrias e reduzir a intensidade do TMRM. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para estudar HSC com um corante potencial de membrana mitocondrial diferente, incluindo TMRE ou JC-1. Assim como outros corantes mitocondriais, como MitoTracker ou MitoSOX.
As questões críticas herdadas pela diferente atividade das bombas de efflux entre a população de medula óssea foram apontadas recentemente. Portanto, este protocolo visa reduzir a discrepância entre os achados anteriores.
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Visão Geral
Este estudo investiga o potencial da membrana mitocondrial em células-tronco e progenitoras hematopoéticas (HSPCs) utilizando TMRM, um corante fluorescente, e o impacto das bombas de efluxo de xenobióticos. É apresentado um protocolo que incorpora verapamil para medir com precisão os níveis de TMRM mediante a inibição dessas bombas, permitindo uma avaliação confiável da função mitocondrial.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Dinâmica mitocondrial em células-tronco
- Mecanismos celulares de efluxo
- Medição do potencial de membrana
Contexto
- Importância da função mitocondrial na renovação de células-tronco
- Dificuldades impostas pelas bombas de efluxo nas medições com corantes
- Uso do TMRM como indicador do potencial mitocondrial
Métodos Utilizados
- Isolamento da medula óssea de camundongos
- Citometria de fluxo para análise de populações celulares
- Inibição de bombas de efluxo utilizando Verapamil
Resultados Principais
- Quantificação bem-sucedida do potencial da membrana mitocondrial em HSPCs
- Efeitos demonstrados do verapamil sobre a retenção de TMRM
- Adaptabilidade do protocolo para corantes mitocondriais alternativos
Conclusões
- O estudo fornece um método confiável para avaliar a atividade mitocondrial em células-tronco.
- Os achados aprimoram o entendimento da biologia das células-tronco e dos efeitos de agentes farmacológicos na função mitocondrial.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A avaliação precisa do potencial da membrana mitocondrial em células-tronco e progenitoras hematopoéticas é essencial para compreender a autorrenovação das células-tronco e a regulação metabólica. A atividade das bombas de efluxo nessas células pode distorcer as medições com corantes fluorescentes, levando a dados tendenciosos que afetam a validação de alvos e a confiabilidade de modelos pré-clínicos. Este protocolo aborda uma limitação técnica fundamental em ensaios baseados em citometria de fluxo, melhorando a consistência dos dados para descobertas subsequentes e aplicações translacionais.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Valor Científico: Permite a investigação da função mitocondrial como alvo terapêutico em células-tronco hematopoiéticas, reduzindo artefatos de medição decorrentes da eliminação do corante.
- Valor Operacional: Permite a comparação consistente de populações de células-tronco e progenitoras entre modelos experimentais, corrigindo a variabilidade dos transportadores xenobióticos.
Desenvolvimento de Ensaios e Triagem
- Valor Científico: Prepara sistemas hematopoiéticos validados para triagem de compostos, garantindo que as leituras do potencial mitocondrial reflitam o estado biológico real, e não a atividade de efluxo.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e padronização do ensaio mediante o uso de inibidores de bombas de efluxo, como a verapamil, em protocolos de coloração.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Facilita a desmistificação mecanicista ao fornecer dados confiáveis sobre a atividade mitocondrial associada às vias de autorrenovação de células-tronco.
- Valor Operacional: Permite a continuidade do descobrimento à validação pré-clínica, padronizando uma leitura funcional chave entre diferentes sistemas modelo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta ao apoiar a verificação de hipóteses em biologia de células-tronco e permitir um perfil funcional confiável antes dos esforços de identificação de compostos líderes.
- Biologia da Descoberta: Apoia a validação de alvos mitocondriais e a clarificação de vias em sistemas hematopoéticos ao minimizar sinais falsamente baixos decorrentes da extrusão do corante.
- Triagem: Fornece medidas quantitativas e reprodutíveis do potencial mitocondrial quando a efluxo é inibido, melhorando a detecção de efeitos de compostos.
- Análises: Gera leituras baseadas em citometria de fluxo (intensidade de TMRM) que permitem a comparação de estados metabólicos entre frações celulares e condições de tratamento.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se ao trabalho pré-clínico ao fornecer uma métrica transladável da aptidão de células-tronco que se correlaciona com desfechos funcionais.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um fluxo de trabalho de citometria de fluxo reutilizável para avaliação da saúde mitocondrial em modelos de células-tronco em múltiplos projetos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva em estudos de mecanismos de células-tronco ao eliminar uma importante fonte de variabilidade nos ensaios.
- Valor Operacional: Melhora a padronização e a reprodutibilidade de ensaios mitocondriais em contextos de pesquisa hematopoiética.
- Valor Estratégico: Permite decisões mais precisas de avançar/não avançar na validação de alvos, reduzindo falsos negativos associados à efluxo de corantes.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos em células-tronco com base em dados funcionais mais precisos.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em citometria de fluxo, isolamento de células-tronco e manipulação de corantes fluorescentes.
- Depende do acesso ao verapamil ou inibidores alternativos das bombas de efluxo e tampões de coloração compatíveis.
- Necessita padronização entre equipes para garantir tempo de incubação e concentração consistentes do inibidor.
- Deve-se considerar possíveis efeitos colaterais do verapamil sobre a viabilidade celular ou metabolismo em culturas de longo prazo.
- Limitado a aplicações nas quais o potencial da membrana mitocondrial é uma leitura funcional relevante e a atividade de efluxo é conhecida por interferir.
