Avaliação da maturidade do ovo humano e sua aplicação clínica

Nós fornecemos um esboço do protocolo clínico para a avaliação não invasora da maturidade humana do ovo usando a microscopia de luz polarizada.

Na prática clínica, é costume assumir que cada oócito exibindo um corpo polar está pronto para fertilização. A imagem vital da maturação do oócito humano revela que um corpo polar se torna visível bem antes do fuso metafase II bipolar ser montado, criando o risco de uma injeção prematura de esperma. A microscopia de luz polarizada permite uma visualização não invasiva do fuso meiotic em oócitos humanos, e pode ser utilizada com segurança no IFV para avaliar a maturidade do óvulo antes da injeção intracytoplasmática de espermatozoides.

Otimizar o tempo do ICSI é particularmente importante no prognóstico ruim dos ciclos de FIV, com um baixo número de oócitos disponíveis para fertilização. Este procedimento clínico é uma técnica adicional ao tratamento padrão de FIV, e deve ser pré-formado por pessoas experientes, em conformidade com as boas práticas laboratoriais. 35 a 36 horas após a injeção de gonadotropina coriônica humana, colete os complexos cumulus-oócito recuperados em meio de manuseio independente de dióxido de carbono.

Equilibre os oócitos por 10 a 15 minutos em uma incubadora independente de dióxido de carbono a 37 graus Celsius. Exponha os oócitos a uma solução de alta hialuronidase, diluída no meio de manuseio. Após 30 segundos, use uma pipeta de 200 microliter para remover mecanicamente células cumulus-corona.

Avaliar o número e o estado de desenvolvimento dos oócitos desnudados de acordo com a presença ou ausência do núcleo e do primeiro corpo polar. Coloque o estágio de vesícula germinal, e metafase I e metafase II estágio oócitos em gotículas individuais de meio de cultura independente de dióxido de carbono, cobertas com óleo mineral. Em seguida, coloque os oócitos a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e 6% de oxigênio com umidade por 3 a 4 horas.

Para preparar placas de cultivo para a cultura de embriões, adicione o volume apropriado de cultura pré-equilibrada de poços individuais de uma placa de cultura de tamanho adequado. Cubra as gotículas com óleo mineral equilibrado, rotule a placa com um identificador único e coloque-a em um uncubator dependente de dióxido de carbono por pelo menos 20 minutos. Para preparar o prato ICSI, adicione 5 gotículas de microliter de meio de manuseio pré-aquecido para cada oócito de exibição de corpo polar, e uma gota extra para lavar agulhas em um prato de plástico limpo.

Adicione uma gota adicional de solução PVP para imobilização de esperma antes da injeção intracytoplasmática de espermatozoides, e sobreponha as gotículas com óleo mineral pré-aquecido. Certifique-se de rotular o prato. Em seguida, coloque o prato de injeção de esperma em uma incubadora independente de dióxido de carbono por pelo menos 20 minutos.

Enquanto a placa está equilibrando, adicione 5 gotículas de microliter de meio de manuseio pré-aquecido para cada oólito de exibição de corpo polar a um prato de cultura de fundo de vidro. Sobreponha todas as gotículas com óleo mineral pré-aquecido. Certifique-se de rotular o prato.

Em seguida, coloque a placa em uma incubadora independente de dióxido de carbono por pelo menos 20 minutos. Enquanto as placas estão se equilibrando, ligue o estágio aquecido no microscópio invertido e coloque a segurando estéril e a agulha de injeção de esperma em suportes de microjeção. Coloque as agulhas em foco e selecione o objetivo apropriado, tomando cuidado para que o condensador esteja na posição de campo brilhante.

Insira o filtro de interferência verde e coloque o controle deslizante de análise de cristal líquido na posição de trabalho. Ajuste o obturador para aproximadamente 50% e ajuste o polarizador circular para diminuir o ruído de fundo. Para configurar o computador para exame de microscopia de luz polarizada, inicie o software de imagem e selecione Vídeo, Fonte de Vídeo e polarAIDE no menu Vídeo.

Em seguida, mude para vídeo ao vivo indo para a página Vídeo e selecione o ícone para ativar a análise do fuso e da zona. Para determinar a maturidade de cada oócito, transfira todos os oócitos em gotículas individuais no prato de fundo de vidro preparado, e coloque o prato descoberto sob o microscópio invertido preparado. Leve o primeiro oócito em foco e observe a imagem detectada de birefringência oocyte, pois é processada por computador e exibida em tempo real na tela do computador.

Use as agulhas de retenção e injeção de esperma para girar o oócito para que o corpo polar esteja na posição das 12 horas e se concentre no corpo polar. Se a birefringência do eixo não estiver claramente visível à primeira vista nas proximidades da PB, toque ligeiramente na zona pellucida e gire suavemente o oócito em torno de cada eixo para garantir o alinhamento da luz polarizada com as fibras do fuso de matriz. Depois de identificar todos os oócitos positivos do fuso, transfira os oócitos em gotículas individuais dentro do prato ICSI preparado, e submeta os oócitos à injeção intracytoplasmática de esperma de acordo com os protocolos padrão.

Se os oócitos não apresentarem nenhum sinal de fuso metafase II detectável, coloque a antena de microscópio de luz polarizada na incubadora independente de dióxido de carbono por 2 a 3 horas. Antes de reformular o exame de microscopia de luz polarizada, como demonstrado, após a injeção, transfira os oócitos para as placas de cultivo de embriões preparados para sua cultura até que o estágio blastocisto seja atingido. Tome cuidado para garantir que toda a micromanipulação do oócito humano seja realizada em um ambiente de controle, a 37 graus, em um pH de cultura ideal.

A imagem do fuso permite a discriminação de oócitos totalmente maduros presos na fase metafáfase II, daqueles submetidos a uma importante transição maturacional. Em oócitos atrasados em desenvolvimento extrudam corpos polares in vitro, a ausência do sinal de fuso metafase II pode não necessariamente refletir uma perturbação celular, mas pode indicar a progressão do oócito do metafase I para o estágio metafase II. A presença do fuso meiotic é um marcador positivo da competência de desenvolvimento de ovos.

O adiamento do ICSI fornece oócitos atrasados no desenvolvimento com tempo extra para concluir o processo de maturação e montar o fuso metafase II antes de sua injeção. Usando essa abordagem, mesmo oócitos imaturos que são rotineiramente descartados podem ser usados clinicamente, e dar origem a gestações bem sucedidas.